Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae za pomocą reakcji Quellung

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie serotypowania otoczki Streptococcus pneumoniae lub pneumokoków z wykorzystaniem reakcji quellingu. Jest to realizowane poprzez najpierw zaszczepienie bulionu z naparu z serca świeżą, nocną kulturą czystą pneumokoków. W drugim kroku kroplę inokulum przenosi się na szklany preparat do mikroskopu.

Następnie na szkiełko dodaje się równą objętość surowicy anty. W ostatnim kroku obie krople miesza się, a na zawiesinę nakłada szkiełko nakrywkowe. Ostatecznie zawiesinę można oglądać w kontraście fazowym, aby zaobserwować pozytywną lub negatywną reakcję Quella w płucach.

Niniejsza metoda prezentuje złoty standard badania syp dla pneumokoków. Metoda ta jest prosta, łatwa do wykonania i łatwa w interpretacji. Wizualna prezentacja tej metody jest istotna, ponieważ osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą mieć trudności z rozpoznaniem odpowiedniej gęstości komórek niezbędnej do przeprowadzenia testu qualm.

Należy rozpocząć od użycia sterylnej jednorazowej pętelki o pojemności 1 µL w celu pobrania niewielkiej ilości świeżej, czystej kultury nocnej pneumokoków wyhodowanej na stałej, nieselektywnej płytce z agarem z krwią końską, a następnie zaszczepić pneumokoki w 100 µL bulionu sercowego (heart infusion broth). Zawiesina powinna być ledwo widocznie mętna; należy delikatnie wymieszać zawartość probówki, aby zemulgować roztwór komórek. Następnie należy użyć nowej pętelki 1 µL, aby przenieść kroplę inokulum na szkiełko mikroskopowe.

Następnie, na szkiełku przedmiotowym, umieść małe okrągłe szkiełko nakrywkowe nad zawiesiną i sprawdź gęstość zawiesiny w kontraście fazowym przy powiększeniu 400×. Jeśli inokulum jest zbyt gęste, rozcieńcz zawiesinę komórkową większą ilością pożywki i delikatnie wymieszaj komórki; jeśli inokulum jest zbyt rzadkie, np. gdy widocznych jest mniej niż 50 komórek, dodaj do zawiesiny komórkowej więcej bakterii i ponownie delikatnie wymieszaj.

Z doświadczeniem gęstość zawiesiny komórkowej można ocenić, potrząsając nią i trzymając pod światło; powinna ona wydawać się jedynie widocznie mętna. Pod mikroskopem roztwór komórek powinien mieć w przybliżeniu taką gęstość.

Po uzyskaniu optymalnego rozcieńczenia komórek bakteryjnych przenieś około 1 µL inokulum na szkiełko przedmiotowe. Następnie, używając nowej pętli, dodaj równą objętość w temperaturze pokojowej.

Nanieść antyserum na szkiełko i dokładnie wymieszać obie krople. Za pomocą pętlą niezwłocznie nałożyć małe szkiełko nakrywkowe na zawiesinę, dbając o to, aby pęseta nie dotknęła kropli. Następnie obejrzeć zawiesinę w kontraście fazowym, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Ujemna reakcja Quella jest obserwowana, gdy nie stwierdza się obrzęku komórek pneumokoków lub jest on minimalny. Jest to podobne do kontroli ujemnej, w której stosuje się zawiesinę komórek pneumokoków bez dodatku antyserum. Dodatnia reakcja Quella występuje, gdy swoiste dla danego typu przeciwciało wiąże się z kapsułą pneumokoka, co prowadzi do zmiany jego współczynnika załamania światła.

W kontraście fazowym bakterie wydają się być obrzęknięte i są bardziej widoczne. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że pracuje się z żywymi mikroorganizmami. Z tego powodu konieczne jest przestrzeganie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej, noszenie odzieży ochronnej i odpowiedniego sprzętu laboratoryjnego oraz bezpieczna utylizacja całego sprzętu i odczynników po zakończeniu procesu.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 10 minut, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo wiedzieć, jak przeprowadzić typowanie serologiczne pneumokoków z wykorzystaniem reakcji Quellung. Technika ta jest istotna dla zrozumienia epidemiologii pneumokoków, zarówno w kontekście kolonizacji nosogardzieli, jak i chorób inwazyjnych.