Name: Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych mózgu myszy po stresie genotoksycznym. Wykorzystuje analogi tymidyny EdU i BrdU do analizy proliferacji in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały finansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 323267, od Electricité de France (EDF) oraz od l'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

1. Procedury na zwierzętach
Ten protokół został opracowany zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 roku (86/609/EWG) i został zatwierdzony przez nasz instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt (CETEA-CEA DSV IdF).
<ol>
	<li>Wstrzyknięcia z EdU / BrdU i napromienianie ciężarnych myszy E14.5 (Figura 2A).
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór EdU w stężeniu 1 mg/ml i BrdU w stężeniu 5 mg/ml w PBS. Wykonaj wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) 100 μl roztworu EdU za pomocą igły 25 G ciężarnym myszom. 1,5 godziny później napromienij myszy (napromienianie całego ciała) pod ciśnieniem 0 Gy lub 2 Gy (0,6 Gy/min). Bezpośrednio po tym należy wstrzyknąć ciężarnym myszom (IP) 200 μl roztworu BrdU za pomocą igły 25 G.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wycinków koronalnych embrionalnych mózgów.
	<ol>
		<li>Po 1 godzinie lub 4 godzinach od napromieniania należy poddać ciężarne myszy eutanazji za pomocą dwutlenku węgla.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną na ponad trzy centymetry za pomocą nożyczek. Oddziel dwa rogi macicy od reszty macicy, dzieląc oba końce rogów. Przenieś rogi macicy na szalkę Petriego zawierającą PBS 0,6% glukozy. Otwórz rogi macicy za pomocą kleszczy, aby odizolować zarodki. Usuń worek owodniowy każdego zarodka za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Wypreparować głowy zarodków za pomocą kleszczy i utrwalić je przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie (PFA, pH = 7,4) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Płucz główki zarodków w PBS przez co najmniej jedną noc w temperaturze 4 °C. Głowy mogą być przechowywane w PBS przez kilka dni.</li>
		<li>Zanurzyć głowice w parafinie za pomocą procesora do infiltracji próżniowej, jak wskazano w tabeli 1. Osadzanie głowic może odbywać się również pod kapturem chemicznym do kąpieli etanolowych i ksylenowych, a następnie w piecu o temperaturze 65 °C do kąpieli parafinowych.</li>
		<li>Przygotować skrawki koronalne o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.</li>
		<li>Zamontuj na szkiełkach mikroskopowych pokrytych polilizyną.</li>
		<li>Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie EdU/BrdU
<ol>
	<li>Deparafinizacja i demaskowanie antygenu
	<ol>
		<li>Odparafinować skrawki mózgu zatopione w parafinie przez zanurzenie szkiełek w 3 kąpielach toluenu na 5 minut.</li>
		<li>Hydrate przez 3 min w 2 kąpielach każdego roztworu o malejącym stężeniu etanolu w następujący sposób: etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% i 5 min w H2O. Szkiełka można przechowywać w wodzie dejonizowanej przez kilka godzin.</li>
		<li>Gotuj plastry przez 10 minut w roztworze cytrynianu (10 mM, pH 6), a następnie inkubuj w wodzie dejonizowanej przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie EdU
	<ol>
		<li>Wykonaj detekcję EdU zgodnie z protokołem producenta. Przepuszczalność komórek 0,5% trytonem X-100 w PBS przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotuj 1X dodatek buforowy EdU, rozcieńczając roztwór 10X w wodzie dejonizowanej. Ten roztwór powinien być świeżo przygotowany i użyty tego samego dnia.</li>
		<li>Przygotuj koktajl reakcyjny EdU, w tym azydek EdU Alexa Fluor 488. Ważne jest, aby dodawać składniki zgodnie z kolejnością podaną w tabeli 2, w przeciwnym razie reakcja nie będzie przebiegać optymalnie. Koktajl reakcyjny EdU należy zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.</li>
		<li>Usunąć bufor permeabilizacyjny (krok 2.1.1), a następnie przemyć dwukrotnie PBS.</li>
		<li>Dodać 150 μl koktajlu reakcyjnego EdU, nałożyć szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyjmij koktajl reakcyjny EdU, a następnie umyj go raz PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie BrdU
	<ol>
		<li>Przygotować bufor saturacyjny z 7,5% surowicą kozią i 7,5% surowicą płodową bydlęcą w PBS. Dodać 150 μl buforu nasycającego na wycinki mózgu, umieścić szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.</li>
		<li>Zdjąć szkiełko nakrywkowe. Dodać 150 μl mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-BrdU rozcieńczonego w stosunku 1:300 w buforze nasyconym, umieścić szkiełko nakrywkowe i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń szkiełko nakrywkowe, a następnie umyj 3 razy w PBS.</li>
		<li>Dodać 150 μl koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego-Alexa594 rozcieńczonego w stosunku 1/400 w buforze nasycenia, umieścić szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń szkiełko nakrywkowe, a następnie umyj raz w PBS.</li>
		<li>Barwienie jądrowe: dodać 150 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w stężeniu 1 μg/ml w PBS, umieścić szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 2 minuty w temperaturze suchej masy.</li>
		<li>Zamontuj prowadnice w medium montażowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza
<ol>
	<li>Zbadaj wycinki mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 20X lub mikroskopem konfokalnym i uzyskaj obrazy w trzech kanałach (488 nm, 594 nm i UV) jako oddzielne pliki.</li>
	<li>Układaj obrazy w stosy za pomocą oprogramowania Photoshop.</li>
	<li>Przeanalizuj sekcje mózgu w standardowym sektorze grzbietowo-przyśrodkowej ściany mózgu. Sektor ten ma wymiar przyśrodkowo-boczny 100 μm i jest podzielony na 18 przedziałów (lub więcej) o wysokości 10 μm w wymiarze promieniowym za pomocą siatki nałożonej na obrazy (rysunek 1), jak opisano wcześniej31.
	<ol>
		<li>Wyrównaj siatkę tak, aby pierwszy pojemnik znajdował się na powierzchni komory, tak aby jego długa oś była równoległa do granicy komory. Następnie ponumeruj oznaczone jądra EdU, BrdU i/lub piknotyczne (odpowiadające jądrom apoptozy) w każdym pojemniku. Ponumeruj jądro znajdujące się na granicy dwóch pojemników w pojemniku, który zawiera jego większą część, lub w dolnym pojemniku, gdy jądro zajmuje równe obszary w dwóch pojemnikach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza statystyczna.</li>
</ol>
Przeanalizuj co najmniej dwa wycinki kory mózgowej na zarodek. Powtórz eksperymenty na co najmniej 3 zarodkach z różnych miotów. Wyniki powinny być podane jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Analizy statystyczne są przeprowadzane za pomocą Graphpad Prism przy użyciu dwukierunkowych testów ANOVA i wielokrotnych porównań posthoc Bonferroni.

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cerebral+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+he+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li>
<li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+nuclei+IN+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li>
<li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+vertebrate+central+nervous+system%3A+revised+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li>
<li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+cerebral+cortex%3A+Boulder+Committee+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li>
<li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li>
<li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon%3A+a+major+site+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li>
<li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li>
<li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li>
<li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells%3A+putting+a+speed+limit+on+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li>
<li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li>
<li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li>
<li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+p53+and+Fas%2FCD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li>
<li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li>
<li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li>
<li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+kinetics+and+radiation+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology+and+Related+Studies+in+Physics%2C+Chemistry%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246, 629-634 (1989).</li>
<li>Weinert, T. A., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RAD9+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+evidence+that+its+function+acts+posttranslationally+in+cell+cycle+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).</li>
<li>Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li>
<li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia%3A+a+new+explanation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li>
<li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li>
<li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+p21waf1%2Fcip+-dependent+G1%2FS+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li>
<li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12(2012).</li>
<li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+%28EdU%29+and+5-bromo-2%27-deoxyuridine+%28BrdU%29+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li>
<li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li>
<li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-iT+EdU+Imaging+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).</li>
<li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early%2C+middle%2C+and+late+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li>
<li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li>
<li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisany tutaj projekt eksperymentalny, oparty na włączeniu EdU na 1,5 godziny przed napromienianiem i włączeniu BrdU natychmiast po napromieniowaniu, pozwolił wykazać, że NSPC są w stanie aktywować punkty kontrolne S i G2/M, ale nie punkt kontrolny G1/S podczaspierwszej godziny po stresie genotoksycznym w mózgu płodu myszy. Przeprowadziliśmy inne eksperymenty, w których EdU wstrzykiwano w różnym czasie po napromieniowaniu i BrdU, zaledwie 1 godzinę przed złożeniem ofiar na myszach, co pozwoliło nam dokładnie o...

Podczas rozwoju mózgu embrionalnego, neurony projekcyjne kory mózgowej są generowane w strefie komorowej, pseudowarstwowym nabłonku złożonym z różnych typów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NSPC), które wyściełają boczne komory. Wśród NSPC promieniste komórki glejowe (RGC), które służą jako nerwowe komórki macierzyste, przechodzą interkinetyczną migrację jądrową (INM): przeprowadzają mitozę na powierzchni komory i fazę S na podstawowej granicy strefy komorowej (VZ)1,2,3. Mogą dzielić się symetrycznie, aby wygenerować dwa RGC, lub asymetrycznie, aby wygenerować jeden RGC i jeden neuron lub pośrednią komórkę progenitorową (IPC)4,5. IPC migrują do leżącej nad nią warstwy proliferacyjnej zwanej strefą podkomorową (SVZ), gdzie po ostatnim symetrycznym podziale generują dwa niedojrzałe neurony projekcyjne6-8. W przeciwieństwie do RGC, IPC nie przechodzą INM (omówione w 9). Nowo wygenerowane neurony migrują promieniście wzdłuż włókien promieniowych przez strefę pośrednią (IZ), aby dotrzeć do miejsca docelowego w płytce korowej (CP)10,8. Idealne wyczucie czasu wszystkich tych wydarzeń jest niezbędne do prawidłowego rozwoju kory mózgowej. Na przykład przejście od proliferacji do różnicowania populacji progenitorów neuronalnych jest kontrolowane przez czas trwania fazy G1 11,12. Wydłużenie fazy G1 koreluje zatem z różnicowaniem komórek.
Stres genotoksyczny, taki jak promieniowanie jonizujące, poważnie upośledza rozwój mózgu (omówione w 13). My i inni wykazaliśmy, że NSPC są bardzo podatne na apoptozę wywołaną promieniowaniem 14,15,16. Promieniowanie jonizujące indukuje pęknięcia podwójnej nici DNA, które są najpoważniejszym uszkodzeniem proliferujących komórek. Jednym z istotnych składników odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) w komórkach cyklicznych jest aktywacja punktów kontrolnych cyklu komórkowego w przejściach G1/S lub G2/M lub podczas fazy S (punkt kontrolny wewnątrz S)17-21. Blokują one postęp cyklu komórkowego, aby zapewnić czas na naprawę uszkodzeń DNA lub eliminację zbyt uszkodzonych komórek. W związku z tym śmierć komórki, jak również opóźniony postęp cyklu komórkowego, mogą zmienić rozwój mózgu w odpowiedzi na ekspozycję na promieniowanie jonizujące22-24. W związku z tym interesujące było opracowanie metody oceny aktywacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego w NSPC w napromieniowanym embrionalnym mózgu myszy.
Postęp cyklu komórkowego jest rutynowo śledzony za pomocą włączenia analogu tymidyny, 5-Bromo-2'-deoksyUrydyny (BrdU). BrdU jest włączany podczas fazy S cyklu komórkowego, kiedy DNA ulega replikacji. Zastosowanie przeciwciała przeciwko BrdU pozwala następnie na wykrycie komórek, które znajdowały się w fazie S podczas impulsu BrdU.
Nowy analog tymidyny, 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest wykrywany przez fluorescencyjny azydek. Różne sposoby wykrywania EdU i BrdU nie reagują krzyżowo25, co umożliwia jednoczesne wykrywanie obu analogów tymidyny, co jest przydatne w badaniu progresji cyklu komórkowego. Zwykle ogniwa są najpierw pulsowane EdU, a następnie pulsowane BrdU, gdzie czas między oboma inkorporacjami trwa kilka godzin 25,26. Dodanie BrdU do pożywek hodowlanych zawierających EdU powoduje preferencyjne włączenie BrdU do DNA z wyłączeniem EdU, podczas gdy jednoczesne dodanie EdU25 z równomolowym lub półrównomolowym BrdU do pożywki powoduje włączenie tylko BrdU27. Upraszcza to protokół podwójnego etykietowania, eliminując etapy mycia, które są zwykle wymagane do usunięcia pierwszej etykiety z pożywki hodowlanej przed dodaniem drugiej etykiety. Jest to również szczególnie interesujące w badaniach in vivo, w których etapy mycia nie są możliwe, w celu określenia dokładnego czasu wejścia lub wyjścia fazy S populacji komórek.
Ostatnio opracowano metodę dwuimpulsowego znakowania w embrionalnym mózgu myszy za pomocą EdU i BrdU 23,24,22 do analizy progresji cyklu komórkowego i INM NSPC po napromienianiu in utero. Ponadto wykazano, że podczas fazy S komórki myszy replikują najpierw regiony euchromatyny, a następnie perycentryczną heterochromatynę28,29,30. Co ciekawe, perycentryczna heterochromatyna różnych chromosomów grupowała się w jądrach międzyfazowych, tworząc heterochromatyczne ogniska znane również jako chromocentra i łatwo wykrywalne przez barwienie DAPI jako jasne ogniska. Dlatego różnicowe barwienia EdU i BrdU euchromatyny i chromocentrów pomogły nam dokładniej przeanalizować progresję fazy S NSPC.
Ta metoda pozwoliła na wykazanie pozornego braku punktu kontrolnego G1/S w NSCP22-24, co jest dość zaskakujące, ponieważ ten punkt kontrolny ma być krytyczny dla stabilności genomu. Kilka eksperymentalnych projektów opartych na różnych kombinacjach impulsów EdU i BrdU zostało wykorzystanych do analizy progresji cyklu komórkowego w brzusznym i grzbietowym kresomózgowiu. W tym miejscu podajemy przykład protokołów pozwalających na badanie ostrego uszkodzenia DNA NSPC w ciągu pierwszych 4 godzin po napromienianiu in utero zarodków myszy E14,5.

<table><tbody><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Life Technologies</td><td>B5002</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>IBL 637</td><td>CIS BIO International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissu Tek VIP</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM 2125 RT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>C10083</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Goat anti mouse-Alex594</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko polisynowe</td><td>Thermo scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-068</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny SPE</td><td>Oprogramowanie Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Wersja 5.0c</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurony kory mózgowej są generowane podczas rozwoju mózgu z różnych typów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NSPC), które tworzą pseudowarstwowy nabłonek wyściełający boczne komory embrionalnego mózgu. Stresy genotoksyczne, takie jak promieniowanie jonizujące, mają bardzo szkodliwy wpływ na rozwijający się mózg związany z wysoką czułością NSPC. Wyjaśnienie zaangażowanych mechanizmów komórkowych i molekularnych zależy od charakterystyki odpowiedzi na uszkodzenie DNA tych szczególnych typów komórek, co wymaga dokładnej metody określenia progresji NSPC przez cykl komórkowy w uszkodzonej tkance. Pokazano metodę opartą na kolejnych iniekcjach dootrzewnowych EdU i BrdU u ciężarnych myszy i dalszym wykrywaniu tych dwóch analogów tymidyny w odcinkach koronalnych mózgu embrionalnego. Zarówno EdU, jak i BrdU są włączane do DNA replikujących się komórek podczas fazy S i są wykrywane za pomocą dwóch różnych technik (odpowiednio azydku lub specyficznego przeciwciała), które ułatwiają ich jednoczesne wykrycie. Następnie określa się barwienie EdU i BrdU dla każdego jądra NSPC w zależności od jego odległości od brzegu komory w standardowym obszarze grzbietowego kresomózgowia. W ten sposób ta technika podwójnego znakowania pozwala odróżnić komórki, które przeszły przez cykl komórkowy, od tych, które aktywowały punkt kontrolny cyklu komórkowego, co doprowadziło do zatrzymania cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA.
Przedstawiono przykład eksperymentu, w którym EdU zostało wstrzyknięte przed napromieniowaniem, a BrdU natychmiast po napromieniowaniu i analizowane w ciągu 4 godzin po napromieniowaniu. Protokół ten zapewnia dokładną analizę ostrej odpowiedzi NSPC na uszkodzenie DNA w funkcji fazy cyklu komórkowego, w której zostały one napromieniowane. Metodę tę można łatwo przenieść do wielu innych systemów w celu określenia wpływu konkretnego leczenia na postęp cyklu komórkowego w żywych tkankach.

W eksperymencie opisanym na Rysunku 2, EdU podano 1,5 hr przed napromieniowaniem, a BrdU bezpośrednio po napromieniowaniu. Następnie w skrawkach korowych przygotowanych 1 lub 4 hr po napromieniowaniu wyróżniono cztery typy komórek, w zależności od wbudowania EdU, BrdU, obu tych związków lub żadnego z nich (Rysunki 2A i 2B). Co ważne, wbudowanie ani EdU, ani BrdU nie zmieniło poziomu apoptozy wywołanej promieniowaniem (dane nie pokazano). Ponadto metody barwienia pozwalaj...

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

assessing-cell-cycle-progression-neural-stem-progenitor-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena postępowania cyklu komórkowego komórek macierzystych i progenitorowych u myszy w rozwijającym się mózgu po stresie genotoksycznym

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę oceny progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych mózgu myszy po stresie genotoksycznym. Wykorzystuje analogi tymidyny EdU i BrdU do analizy proliferacji in vivo.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym (Wideo) | JoVE Journal

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Przeglądaj więcej filmów