Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila
13 lutego 2014
Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.
Ogólnym celem tej procedury jest szybki i dokładny pomiar wydajności lotu u Drosophila. Jest to realizowane poprzez najpierw wrzucenie much do cylindra lotniczego. Drugim krokiem procedury jest utrwalenie obrazu powierzchni lądowania za pomocą kamery cyfrowej.
Ostatnim krokiem jest analiza danych przy użyciu oprogramowania do obrazowania poprzez pomiar wysokości lądowania każdej muchy. W rezultacie procedura ta pomaga w identyfikacji mutacji oraz stanów, takich jak starzenie się lub neurodegeneracja, które upośledzają zdolność lotu, a także pozwala na ilościową ocenę wydajności lotu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oryginalny tester lotu, jest jej większa przydatność do wysokoprzepustowych przesiewów mutantów i innych stanów upośledzających lot.
Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, jak dużo czasu zajmuje testowanie dużej liczby genotypów przy użyciu pierwotnego testera lotu. Przymocuj cylinder do lotu do statywu pierścieniowego za pomocą zacisków łańcuchowych. Pozostaw około trzech centymetrów wolnej przestrzeni pod cylindrem na szalkę wagową.
Napełnij płytkę do ważenia cienką warstwą oleju mineralnego i wsuń ją pod cylinder lotniczy. Przymocuj lejek do drugiego statywu. Dostosuj wysokość lejka tak, aby jego dno znajdowało się na poziomie górnej krawędzi cylindra lotniczego.
Najwęższa część lejka musi być węższa niż fiolka do much. Średnica rurki spustowej powinna być nieco większa niż średnica fiolki do much, aby fiolka mogła swobodnie spadać. Włóż rurkę spustową do górnej części lejka i przymocuj ją za pomocą zacisku laboratoryjnego.
Następnie z arkusza poliakryloamidu wytnij prostokątny fragment o długości równej długości cylindra lotniczego i szerokości nieco mniejszej niż obwód wewnętrzny cylindra lotniczego. Na arkusz nałóż cienką warstwę kleju tangle trap, pozostawiając niepowlekany margines u góry i u dołu, aby móc utrzymać arkusz. Po wyschnięciu kleju na arkuszu przez godzinę, wsuń go do cylindra lotniczego stroną z klejem do wewnątrz.
Następnie zmontuj szynę kamery, używając sosnowych wsporników. Upewnij się, że spód szyny utrzymuje kamerę w taki sposób, aby nie zasłaniać obiektywu. Następnie przykręć ograniczniki w miejscach, w których nie będą one przerywać widoku kamery na arkusz plastiku.
Przygotuj fiolki z muchami do badania, dbając, aby w każdej fiolce znajdowało się nie więcej niż 20 much. Delikatnie ostukaj fiolki, aby muchy opadły na dno. Wyjmij korek z fiolki i umieść ją w rurce do dozowania.
Zwolnij fiolkę. Gdy fiolka uderzy o ścianki zwężającego się lejka, muchy zostaną wyrzucone do cylindra lotniczego. Podnieś rurkę spustową, aby usunąć pustą fiolkę i, jeśli jest to konieczne, załadować więcej much.
Do 200 much z 10 fiolek można łatwo przetestować i obrazować na jednej płycie z poliakryloamidu. Teraz należy zdjąć plastikową płytę i umieścić ją na płaskiej, białej powierzchni; jeśli blaty robocze są ciemne, można użyć białego brystolu. Nad plastikową płytą należy zamontować prowadnicę kamery.
Kamera powinna znajdować się na dostatecznej wysokości nad arkuszem, aby zarówno jego górna, jak i dolna krawędź znajdowały się w polu widzenia. Przesuwaj kamerę wzdłuż prowadnicy, trzymając przycisk przechwytywania obrazu, aby uzyskać zdjęcie panoramiczne. Liczbę much, które wpadły do oleju w naczyniu pod komorą lotu, można policzyć ręcznie.
Przed każdą kolejną próbą muchy można usunąć z arkusza, a sam arkusz można wykorzystać ponownie. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu ImageJ i w razie potrzeby przytnij obrazy tak, aby obejmowały wyłącznie powierzchnię lądowania. Obszar pokryty pułapką entangle.
Konwertuj obrazy na ośmiobitową skalę szarości i utwórz próg (threshold), aby odfiltrować białe tło. Ustaw parametry w celu zidentyfikowania każdej muchy.
W menu analizy cząstek (analyze particles) należy zdefiniować parametry. Służą one do identyfikacji cząstki przy użyciu zestawu demonstracyjnego. Przedział pola powierzchni od 5 do 90 pikseli kwadratowych oraz kołowość od 0,4 do 1,0 pozwolą na dokładną identyfikację wszystkich próbek.
Następnie należy zmierzyć położenie każdej muchy, korzystając z wygenerowanej listy współrzędnych dla każdej cząstki. Współrzędną X podaną w pikselach można przeliczyć na centymetry. Aby obliczyć wysokość lądowania, należy zaimportować tabelę do arkusza kalkulacyjnego i przystąpić do analizy.
Wydajność lotu much mutantów slow poke, u których stwierdzono defekt lotu, porównano z muchami typu dzikiego canton s. Wszystkie muchy miały trzy dni i były hodowane w temperaturze pokojowej; muchy kontrolne konsekwentnie lądowały w pobliżu górnej części cylindra. Rozproszenie miejsca lądowania było znacznie większe w przypadku mutantów slow poke.
Średnia wysokość lądowania dla much typu canton wynosząca 73 centymetrów była znacząco większa niż w przypadku mutantów slow poke, która wynosiła 44 centymetrów. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak histologia, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące integralności strukturalnej mięśni lotnych, neuronów ruchowych lub złączy nerwowo-mięśniowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko ocenić zdolności lotne u oph.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewanie. Procedura polega na wrzucaniu much do cylindra lotniczego, przechwytywaniu obrazów powierzchni lądowania i analizie danych w celu pomiaru wysokości lądowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Genetyka
Wstęp
- Wydajność lotu jest kluczowym parametrem w badaniach nad Drosophila.
- Istniejące metody pomiaru zdolności lotnych charakteryzują się często niską przepustowością.
- Identyfikacja mutacji wpływających na lot może dostarczyć cennych informacji na temat neurodegeneracji.
- Niniejsza metoda zwiększa możliwość przesiewania różnych uwarunkowań wpływających na zdolność lotu.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody oceny sprawności lotu u Drosophila.
- Identyfikacja mutacji genetycznych i warunków upośledzających zdolność do lotu.
- Precyzyjne ilościowe określenie sprawności lotu.
Zastosowane metody
- Muchówki Drosophila są wpuszczane do cylindra do lotu.
- Kamera cyfrowa rejestruje obrazy powierzchni lądowania.
- Oprogramowanie do obrazowania analizuje dane w celu pomiaru wysokości lądowania.
- Metoda ta umożliwia szybkie przesiewanie wielu próbek.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia dokładne pomiary wydajności lotu.
- Jest ona odpowiednia do wysokoprzepustowego przesiewu mutantów.
- Można za jej pomocą oceniać stany takie jak starzenie się i neurodegeneracja.
- Wyniki mogą pomóc w zrozumieniu podłoża genetycznego upośledzenia lotu.
Wnioski
- Technika ta stanowi ulepszenie istniejących metod pomiaru wydajności lotu.
- Umożliwia ona badaczom efektywne przeprowadzanie analiz wysokoprzepustowych.
- Wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia wpływów genetycznych na zachowanie.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe zastosowanie praktyczne
Ilościowy pomiar zdolności lotnych Drosophila umożliwia wysokoprzepustowy screening genetyczny i fenotypowy, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad neurobiologią i starzeniem. Udoskonalony schemat postępowania standaryzuje testy behawioralne, zwiększając pewność predykcyjną dla późniejszych badań funkcjonalnych i selekcji portfolio. Możliwość ta przyspiesza identyfikację modyfikatorów genetycznych i fenotypów istotnych dla chorób w preklinicznych systemach modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę czynników genetycznych i środowiskowych wpływających na funkcje nerwowo-mięśniowe.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie fenotypów behawioralnych powiązanych z perturbacjami genetycznymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie prawidłowej wydajności lotu od wydajności upośledzonej.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów genetycznych w badaniach nad neurodegeneracją i starzeniem.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Przygotowuje zwalidowane modele Drosophila dla skalowalnych i powtarzalnych procesów badań behawioralnych.
- Standaryzuje warunki testowe poprzez kontrolę prędkości wejścia i automatyzację gromadzenia danych.
- Umożliwia ilościowy, wysokoprzepustowy odczyt odpowiedni dla szerokich badań genetycznych lub przesiewowych związków chemicznych.
- Wspiera rzetelną ocenę genów kandydackich lub interwencji wpływających na funkcje motoryczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników fenotypowych do punktów końcowych istotnych dla chorób w badaniach nad neurodegeneracją i starzeniem się.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji wyników funkcjonalnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka, w oparciu o solidne, ilościowe dane behawioralne.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie genotypu z fenotypem funkcjonalnym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje proces odkryć – od wczesnego screeningu genetycznego po walidację w modelach przedklinicznych – zapewniając zestandaryzowany test behawioralny dla badań z zakresu genomiki funkcjonalnej i neurobiologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację upośledzenia lotu w różnych genotypach i warunkach.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dla wysokoprzepustowych badań mutantów lub interwencji.
- Analityka: Zapewnia obrazowanie cyfrowe i pomiary wysokości lądowania za pomocą oprogramowania w celu obiektywnego porównania danych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy behawioralne Drosophila z funkcjonalnymi skutkami istotnymi dla chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla zróżnicowanych kampanii przesiewowych genetycznych i fenotypowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i wydajność testów behawioralnych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych i interwencji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze much Drosophila oraz w konfiguracji testów behawioralnych.
- Wymagany jest sprzęt do obrazowania cyfrowego oraz oprogramowanie do analizy obrazu w celu uzyskania ilościowych wyników.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów testów i przepływów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych tło genetycznych i warunków eksperymentalnych u Drosophila.
- Ograniczona do systemów modelowych, w których zdolność lotna jest istotnym punktem końcowym funkcjonalnym.
