Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila
13 lutego 2014
Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.
Ogólnym celem tej procedury jest szybki i dokładny pomiar wydajności lotu u Drosophila. Osiąga się to poprzez uprzednie wrzucenie much do cylindra rozlotowego. Drugim krokiem procedury jest zobrazowanie powierzchni lądowania za pomocą kamery cyfrowej.
Ostatnim krokiem jest analiza danych za pomocą oprogramowania do obrazowania poprzez pomiar wysokości lądowania każdej muchy. Ostatecznie procedura ta pomaga zidentyfikować mutacje i stany, takie jak starzenie się lub neurodegeneracja, które upośledzają zdolność lotu i pomagają określić ilościowo wydajność lotu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oryginalny tester lotu, jest to, że jest ona bardziej odpowiednia dla badań przesiewowych o wysokiej przepustowości dla mutantów i innych warunków, które utrudniają lot.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, ile czasu wymagało testowanie dużej liczby genotypów przy użyciu oryginalnego testera lotu. Przymocuj cylinder lotu do stojaka pierścieniowego za pomocą łańcucha clamps. Pozostaw około trzech centymetrów pod cylindrem na naczynie kierunkowe.
Załaduj naczynie kierunkowe cienką warstwą oleju mineralnego i wsuń je pod cylinder lotnika. Przymocuj lejek do drugiego stojaka pierścieniowego. Wyreguluj wysokość lejka tak, aby dno lejka zlicowało się z górną częścią cylindra zgarniacza.
Najwęższa część lejka musi być węższa niż fiolka z muchami. Średnica rurki wrzutowej powinna być nieco szersza niż w przypadku fiolki na muchy, aby fiolka mogła swobodnie opadać. Włóż rurkę kroplową do górnej części lejka i zabezpiecz ją za pomocą zacisku pazurowego.
Następnie z arkusza poliakryloamidu wytnij prostokątny kawałek o długości cylindra biegu o szerokości nieco mniejszej niż wewnętrzny obwód cylindra biegu. Nałóż cienką warstwę kleju do pułapek splątanych na arkusz, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na górze i na dole niepokrytego, aby utrzymać arkusz. Po wyschnięciu kleju na arkuszu przez godzinę, wsuń arkusz do cylindra zgarniającego z klejem do wewnątrz.
Następnie zamontuj szynę kamery za pomocą sosnowych wsporników. Upewnij się, że dolna część szyny może podeprzeć kamerę bez blokowania obiektywu. Następnie przykręć korki w miejscu, w którym nie zasłaniają widoku kamery na plastikowy arkusz.
Zebrać fiolki z muchami do badania, przy nie więcej niż 20 muchach na fiolkę. Delikatnie postukać muchami w dno fiolki. Odłączyć fiolkę i włożyć ją do probówki.
Zwolnić fiolkę. Kiedy fiolka uderza w ścianki zwężającego się lejka, muchy, które są wyrzucane do cylindra lotu. Podnieś rurkę wrzutową, aby wyjąć pustą fiolkę i w razie potrzeby załadować więcej much.
Do 200 much załadowanych z 10 fiolek może być łatwo przetestowanych i zobrazowanych na jednym arkuszu poliakrylamidu. Teraz usuń plastikowy arkusz i umieść go na płaskiej białej powierzchni Biała tablica plakatowa może być użyta, jeśli blaty są ciemne. Zamontuj szynę kamery na plastikowym arkuszu.
Kamera powinna znajdować się wystarczająco wysoko nad arkuszem, aby zarówno górna, jak i dolna część arkusza znajdowała się w polu widzenia. Przesuń kamerę wzdłuż ścieżki, przytrzymując przycisk przechwytywania, aby uzyskać zdjęcie panoramiczne. Liczbę much lądujących w oleju w naczyniu pod komorą lotu można policzyć ręcznie.
Dla każdej próby między próbami muchy mogą być usuwane z arkusza, a arkusz może być ponownie użyty. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu obrazu J, w razie potrzeby przytnij obrazy, aby uwzględnić tylko obszar powierzchni lądowania. Pułapka splątana pokryta obszarem.
Przekonwertuj obrazy na ośmiobitową skalę szarości i utwórz próg. Aby odfiltrować białe tło. Ustaw parametry, aby zidentyfikować każdą muchę.
Korzystając z menu analizy cząstek, zdefiniuj parametry. Służy do identyfikacji cząstki za pomocą aparatury demonstracyjnej. Obszar od pięciu do 90 pikseli do kwadratu i okrągłość od 0,4 do 1,0 dokładnie zidentyfikują wszystkie próbki.
Teraz zmierz położenie każdej muchy, korzystając z wygenerowanej listy współrzędnych dla każdej cząstki. Współrzędną X w pikselach można przekonwertować na centymetry. Aby obliczyć wysokość spocznika, zaimportuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego i kontynuuj analizę.
Osiągi w locie zmutowanych much typu powolnego, które mają znaną wadę lotu, porównano z muchami kantońskimi typu dzikiego. Wszystkie muchy miały trzy dni, wychowywały się w temperaturze pokojowej, muchy konsekwentnie lądowały w pobliżu górnej części cylindra. Rozrzut lądowania był znacznie większy w przypadku wolno nękających mutantów.
Średnia wysokość lądowania dla kantonów na poziomie 73 centymetrów była znacznie większa niż dla wolno szturchanych mutantów na poziomie 44 centymetrów. Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak histologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące integralności strukturalnej mięśni lotu, neuronów ruchowych lub połączeń nerwowo-mięśniowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób możesz szybko ocenić osiągi lotu w powietrzu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, ułatwiającą przesiewowe badania. Procedura polega na upuszczaniu much do cylindra lotniczego, rejestrowaniu obrazów powierzchni lądowania i analizowaniu danych w celu zmierzenia wysokości lądowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowań
- Genetyka
Tło
- Wydajność lotu jest krytyczną miarą w badaniach nad Drosophila.
- Istniejące metody pomiaru zdolności lotu są często o niskiej wydajności.
- Identyfikowanie mutacji wpływających na lot może dostarczyć informacji na temat neurodegeneracji.
- Ta metoda poprawia zdolność do przesiewania różnych warunków wpływających na lot.
Cel badania
- Opracować metodę o wysokiej wydajności do oceny wydajności lotu u Drosophila.
- Zidentyfikować mutacje genetyczne i warunki, które upośledzają zdolność lotu.
- Dokładnie sprecyzować wydajność lotu.
Zastosowanie metod
- Drosophila są upuszczane do cylindra lotniczego.
- Cyfrowy aparat rejestruje obrazy powierzchni lądowania.
- Oprogramowanie do przetwarzania obrazów analizuje dane w celu zmierzenia wysokości lądowania.
- Metoda pozwala na szybkie przesiewowe badania wielu próbek.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia dokładne pomiary wydajności lotu.
- Jest odpowiednia do przesiewowych badań mutantów.
- Można oceniać warunki takie jak starzenie się i neurodegeneracja.
- Wyniki mogą pomóc w zrozumieniu genetycznej podstawy upośledzenia lotu.
Wnioski
- Ta technika poprawia istniejące metody pomiaru wydajności lotu.
- Umożliwia badaczom przeprowadzanie efektywnych analiz o wysokiej wydajności.
- Wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia wpływu genetycznego na zachowanie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of Drosophila flight performance enables high-throughput genetic and phenotypic screening, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobiology and aging research. The improved workflow standardizes behavioral assays, increasing predictive confidence for downstream functional studies and portfolio triage. This capability accelerates the identification of genetic modifiers and disease-relevant phenotypes in preclinical model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of genetic and environmental factors affecting neuromuscular function.
- Supports functional target validation by quantifying behavioral phenotypes linked to gene perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and impaired flight performance.
- Improves predictive confidence for prioritizing genetic targets in neurodegeneration and aging pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated Drosophila models for scalable, reproducible behavioral screening workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling entry velocity and automating data capture.
- Enables quantitative, high-throughput readouts suitable for large-scale genetic or compound screens.
- Supports reliable evaluation of candidate genes or interventions affecting motor function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant endpoints in neurodegeneration and aging research.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of functional outcomes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative behavioral data.
- Supports translational biomarker development by linking genotype to functional phenotype.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early genetic screening through preclinical model validation, providing a standardized behavioral assay for functional genomics and neurobiology research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying flight impairment across genotypes and conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for high-throughput mutant or intervention screens.
- Analytics: Provides digital imaging and software-based measurement of landing height for objective data comparison.
- Translational Research: Links Drosophila behavioral phenotypes to disease-relevant functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse genetic and phenotypic screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for behavioral assays.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling and behavioral assay setup.
- Needs digital imaging equipment and image analysis software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental conditions in Drosophila.
- Limited to model systems where flight performance is a relevant functional endpoint.
