Name: In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Poznaj technikę szybkich nieinwazyjnych wstrzyknięć dooponowych do odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego u myszy w celu transfekcji siRNA i knockdownu genu. Ta metoda umożliwia skuteczne badanie funkcji genów w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wszystkie procedury dotyczące wykorzystywania zwierząt były zgodne z etycznymi wytycznymi określonymi przez lokalne ciało zarządzające (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Niemcy).
1. Przygotowanie kompleksu siRNA/PEI
 
Roztwór kompleksu siRNA/PEI przygotowuje się zgodnie ze wskazówkami producenta w następujący sposób:
<ol>
	<li>Roztwór A: Rozcieńczyć żądaną ilość siRNA sterylną wodą (jeśli to konieczne) do jednej czwartej objętości końcowej i rozcieńczyć ją dalej 10% roztworem glukozy do połowy objętości końcowej. Delikatnie wymieszać lub wymieszać, pipetując w górę iw dół. Optymalna ilość siRNA musi być określona empirycznie, ale 1 μg siRNA w 10 μl złożonego roztworu na zwierzę jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji.</li>
	<li>Roztwór B: Rozcieńczyć potrzebną objętość odczynnika PEI sterylną wodą do jednej czwartej objętości końcowej i rozcieńczyć ją dalej 10% roztworem glukozy do połowy objętości końcowej. Delikatnie wymieszać lub wymieszać, pipetując w górę i w dół. 
	Uwaga: ilość odczynnika PEI decyduje o równowadze jonowej w kompleksie, która wpływa na efektywność transfekcji. Podobnie optymalna ilość roztworu PEI musi być określona empirycznie. W naszych rękach optymalna ilość to 0,12 μl roztworu PEI na 1 μg siRNA.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór A z roztworem B jednocześnie, delikatnie zmieszaj.</li>
	<li>Mieszany roztwór inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Kompleks ten jest stabilny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie dokanałowe
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy 3% izofluranem, aż nie wykaże oznak odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby dodatkowo upewnić się, że jest w stanie znieczulenia. </li>
	<li>Ogolić około 2cm2 futra na tylnym końcu zwierzęcia w pobliżu podstawy ogona, aby ułatwić lepszą wizualizację podczas wprowadzania igły.</li>
	<li>Umieść mysz w stożku nosowym w celu dalszego podawania izofluranu podczas zabiegu, zmniejsz ilość izofluranu do 1,5% i pokryj oczy myszy lubrykantem do oczu.</li>
	<li>Przygotować gotowy do użycia mieszany roztwór siRNA za pomocą 25 μl strzykawki Hamiltona przymocowanej do igły 30 G 0,5 cala.</li>
	<li>Zlokalizuj wyrostek kolczysty L6, który powinien być najbardziej widoczny i przymocuj kolumnę kręgowców wokół tego obszaru, delikatnie ją naciskając.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę między rowek kręgów L5 i L6 i obserwować, czy wykonuje się ruch ogonem, ponieważ ten znak wskazuje na pomyślne wprowadzenie igły do przestrzeni śródoponowej. 
	napiwek: Za pomocą paznokcia powinno być również w stanie zlokalizować rowek.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu ruchu ogona, natychmiast, ale ostrożnie, zabezpiecz pozycję igły jedną ręką i powoli wstrzyknij żądaną objętość substancji drugą ręką. 
	Wskazówka: objętość między 5-10 μl jest optymalna, ponieważ objętość mniejsza niż 5 μl jest zawodna, a objętość większa niż 10 μl prowadzi do zbyt dużego ciśnienia.</li>
	<li>Po wykonaniu wstrzyknięcia należy przenieść mysz z powrotem do klatki, aby dojść do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Powtarzaj to wstrzyknięcie co najmniej 2 razy co 24 godziny, aby osiągnąć optymalną regulację w dół docelowego genu.</li>
</ol>

<ol><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse%3A+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li>
<li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55%2C212-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li>
<li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li>
<li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cannabinoid+%28CB1%29-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection%3A+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li>
<li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice%3A+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tak więc opisana powyżej technika dokanałowych wstrzyknięć igieł jest skuteczna, szybka, specyficznie zlokalizowana i nieniszcząca. Technicznie rzecz biorąc, najbardziej krytycznym aspektem tej procedury jest miejsce wprowadzenia igły do rowka. Bardzo ważne jest, aby ta procedura była wykonywana bardzo spokojnymi rękami i cierpliwością. Podobnie jak w przypadku wielu zabiegów chirurgicznych, szkolenie poprawia wskaźnik udanego wstrzyknięcia. Jest to również ważne, ponieważ podczas rzeczywistego eksperymentu technika ta n...

Rdzeń kręgowy jest bardzo ważnym ośrodkiem w wielu kluczowych procesach biologicznych i funkcjach fizjologicznych, w tym w przetwarzaniu i przekazywaniu bolesnych (nocyceptywnych) bodźców4-7. Opracowano różne techniki eksperymentalne w celu ułatwienia farmakologicznej modulacji rdzenia kręgowego, takie jak przewlekła implantacja cewników dooponowych8, mikroiniekcja rdzenia kręgowego i dokanałowe wstrzyknięcie igły9. Każda technika ma swoje zalety i wady, a w zależności od paradygmatu eksperymentu jedna technika może być bardziej odpowiednia niż inne. Podczas gdy przewlekła implantacja cewników dooponowych jest łatwo możliwa u szczurów, metoda ta jest bardzo trudna u myszy, ze względu na ograniczenia rozmiaru. Wskaźnik sukcesu jest bardzo niski, a deficyty motoryczne często występują z powodu nieporęcznej obecności cewnika w mocno ograniczonej przestrzeni podtwardówkowej u myszy. Co więcej, długotrwałe dostarczanie leków jest spowodowane częstym krzepnięciem przewlekle wszczepionych cewników. Wreszcie, reakcje immunologiczne są powszechne.
Te problemy można obejść za pomocą metody ostrego wstrzykiwania dooponowego za pomocą igły w przypadku braku preimplantowanego cewnika, co umożliwia szybkie i anatomicznie ograniczone stosowanie leków i odczynników do rdzenia kręgowego u myszy. Metoda ta w pełni zachowuje korzyści płynące z podawania dooponowego w porównaniu z innymi drogami podawania ogólnoustrojowego (np. doustnie, dożylnie, dootrzewnowo itp.), takie jak specyficzność modulacji kręgosłupa, która pozwala na zmniejszenie dawek i ograniczenie skutków ubocznych, a także zdolność do dostarczania substancji, które zwykle nie przekraczają bariery krew-mózg, ponieważ podczas wstrzyknięcia dooponowego igła jest wprowadzana między oponę twardą a rdzeń kręgowy. Co jednak ważne, w porównaniu z innymi metodami podawania dooponowego, metoda iniekcji dooponowej jest najmniej inwazyjna, pozwalając na wielokrotne zastosowanie u tego samego zwierzęcia bez powodowania znacznych uszkodzeń tkanek lub wywoływania reakcji immunologicznej w wyniku implantacji ciała obcego. Wymaga to jednak umiejętności technicznych do bardzo precyzyjnego celowania w igłę, aby umożliwić skuteczność.
Tutaj wizualnie demonstrujemy metodę osiągania optymalnego wskaźnika sukcesu w szczególności w celu celowania w rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym. Miejsce wstrzyknięcia, które jest wybierane w tym eksperymencie, to rowek między kolumną kręgowców L5 i L6, w pobliżu miejsca, w którym kończy się rdzeń kręgowy, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia kręgosłupa. Co więcej, demonstrujemy zastosowanie tej techniki do niszczenia genów w rdzeniu kręgowym za pomocą siRNA.

<table><tbody><tr><td>In Vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-36832</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontrola siRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&szlig;-tubuliny III</td><td>Sigma</td><td>T2200&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-WAVE1</td><td>R& D Systems</td><td>AF5514</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szybki zielony barwnik</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfiguracja izofluranu</td><td>Dr&auml; ger L&uuml; beck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Golarka</td><td>Wella</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton Gazoszczelna 1702</td><td>Hamilton</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 w 13 mm Igła</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter do przodu WAVE1 do qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>WAVE1 odwrócony starter do qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart Essential DNA Green Master</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) transfekcja sirna i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

Ten raport opisuje krok po kroku przewodnik po technice ostrych iniekcji dokanałowych w sposób nieinwazyjny, tj. niezależnie od implantacji cewnika. Techniczne ograniczenie tej techniki chirurgicznej polega na finezji rąk. Wstrzyknięcie jest szybkie, szczególnie dla wyszkolonego eksperymentatora, a ponieważ rozerwanie tkanki przy tej technice jest minimalne, możliwe są wielokrotne wstrzyknięcia; Co więcej, nie dochodzi do reakcji immunologicznej na obce narzędzia (np. cewnik), co daje lepszy i bardziej szczegółowy odczyt modulacji rdzenia kręgowego. Ponieważ stosowanie substancji jest w dużej mierze ograniczone do docelowego obszaru rdzenia kręgowego, nie ma potrzeby stosowania leków w dużych dawkach, a co ważniejsze, można uniknąć niepożądanych skutków dla innych tkanek, obserwowanych przy podawaniu ogólnoustrojowym1,2. Co więcej, łączymy tę technikę z transfekcją kwasu nukleinowego in vivo za pomocą odczynnika3 z polietyleniminy (PEI), który zapewnia ogromną wszechstronność w badaniu funkcji kręgosłupa poprzez dostarczanie środków farmakologicznych, a także modulatorów genów, RNA i białek.

Aby zilustrować prawidłowe wstrzyknięcie, wykonaliśmy tę technikę z użyciem barwnika Fast Green FCF u dorosłych myszy C57Bl6 (w wieku 8-10 tygodni). Zwierzęciu pozwolono na kilkuminutową rekonwalescencję po iniekcji, aby barwnik mógł się rozprzestrzenić, a następnie uśmiercono je przedawkowaniem CO2. Następnie dokonano sekcji kręgosłupa i odsłonięto rdzeń kręgowy. Niebieskie punkty odpowiadające rozproszonemu barwnikowi wyznaczyły miejsce wstrzyknięcia. Nie stwierdzono oznak uszkodzenia rdzenia kręgowego, co p...

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest miejscowe podanie iRNA poprzez wstrzyknięcie doglebowe do rdzenia kręgowego. Jest to realizowane poprzez przygotowanie optymalnego odczynnika kompleksu I-R-N-A-P-E-I, a następnie przygotowanie myszy do iniekcji doglebowej.Po co najmniej 15 minutach inkubacji mieszaninę siRNA pobiera się do strzykawki Hamiltona. Ostatnim krokiem jest ostrożne wykonanie wtryśnięcia dokanałowego, powtarzając iniekcje co 24 godziny w celu zapewnienia optymalnej regulacji w dół. Ostatecznie przeprowadza się immunoblotting oraz ilościową analizę w czasie rzeczywistym.Metoda PCR jest wykorzystywana do wykazania skutecznego obniżenia poziomu białek i mRNA po transfekcji drogą INA. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona mniej inwazyjna niż iniekcja wewnątrzkatetertowa lub do rdzenia kręgowego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą muszą ćwiczyć, aby uzyskać niezbędną precyzję pozwalającą na iniekcję przez małą szczelinę między kolumną kręgosłupa bez uszkodzenia rdzenia kręgowego.Aby przygotować roztwór SIR A, należy rozpocząć od rozcieńczenia pożądanej ilości SIR A w wodzie sterylnej. Następnie należy go dalej rozcieńczyć 10% roztworem glukozy, mie

in-vivo-sirna-transfection-gene-knockdown-spinal-cord-via-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vivo Transfekcja SiRNA i Wyłączenie Genu w Rdzeniu Kręgowym za pośrednictwem Szybkiej Nieinwazyjnej Przetoki Podpajęczynówkowej w Odcięku Lędźwiowym u Myszy

Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.

Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Źródło: Tadokoro, T., et al. Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia technikę iniekcji podskórnej w celu dostarczenia genu do rdzenia kręgowego u myszy. Procedura polega na odsłonięciu opony twardej, nakłuciu opony twardej i wstrzyknięciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przenoszącego gen eksprymujący białko fluorescencyjne do przestrzeni subpialnej. Po wstrzyknięciu i rekonwalescencji...

Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Poznaj technikę szybkich nieinwazyjnych wstrzyknięć dooponowych do odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego u myszy w celu transfekcji siRNA i knockdownu genu. Ta metoda umożliwia skuteczne badanie funkcji genów w neurobiologii.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Przeglądaj więcej filmów