Name: Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj model niedokrwienia/reperfuzji w C. elegans przy użyciu beztlenowej komory. Metoda pozwala ocenić śmiertelność, zmiany neuronalne i reakcje behawioralne w niedokrwieniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunki 1 i 2 zostały wcześniej opublikowane w Free Radical Biology & Medicine (Queliconi et al.5) i posiadają prawa autorskie należące do Elsevier. Prace te były wspierane przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (K.N.) i USPHS GM087483 (K.N.). B.B.Q. jest doktorantem w ramach stypendium FAPESP.

1. Wzrost C. elegans
<ol>
	<li>Przygotować płytki agarowe z 35 mm pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsiane bakteriami OP50, zgodnie ze standardowymi metodami uprawy1.</li>
	<li>Zsynchronizuj C. elegans, umieszczając 6 grawych dorosłych osobników na wysiewanej płytce NGM. Usuń dorosłe osobniki po złożeniu ~100 jaj (~3 godziny).</li>
	<li>Inkubować płytki przez 3 dni w temperaturze 20 °C, po czym robaki rozwiną się do stadium młodego dorosłego i są optymalne do tego eksperymentu. Alternatywne protokoły synchronizacji C. elegans opisano w innym miejscu10.</li>
</ol>
2. Materiały dla AS
<ol>
	<li>Bufor M9 (22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mMMgSO4) powinien zostać oczyszczony z tlenu przez zrównoważenie zN2 (można również użyć argonu) przez 30 minut przed eksperymentem i przechowywany w otoczeniu lodu.</li>
	<li>Zrób mały otwór (o szerokości 3 mm) w pokrywie probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, w którym umieszczone zostaną robaki podczas AS. Otwór pozwala na wymianę gazu bez konieczności utrzymywania otwartej pokrywy, ponieważ może to prowadzić do nadmiernego parowania mediów.</li>
</ol>
3. Anoksyzja/Głód
<ol>
	<li>Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty co najmniej w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dodać 1 ml natlenionego buforu M9 do każdej płytki o średnicy 35 mm zawierającej młode dorosłe robaki wyhodowane w sposób opisany powyżej. Uważaj, aby nie usunąć bakterii z talerza (dodaj M9 do krawędzi, na których bakterie nie zostały zasiane). Po ~1 min robaki powinny pływać w M9.</li>
	<li>Pokryj końcówkę pipety o pojemności 1 ml roztworem BSA, pipetując i usuwając sterylny 1% roztwór BSA.</li>
	<li>Ostrożnie przechylić płytkę zawierającą robaki w buforze M9, wyjąć M9 z tego samego miejsca, w którym została dodana, i umieścić zawiesinę w przygotowanych probówkach do mikrowirówek. Odstaw na lód, aż robaki opadną na dno rurek (~1-2 min).</li>
	<li>Usunąć maksymalną możliwą ilość M9 bez naruszania robaków z probówki (pozostawiając około 100 μl), dodać 1 ml oczyszczonego tlenem i zamrożonego M9 i umieścić probówkę na lodzie, aż robaki ponownie osiądą na dnie. Powtórz ostatni krok 3 razy. W ostatnim praniu wyjmij M9, aż w tubie pozostanie ~100 μl.</li>
	<li>Umieść probówki z robakami w odtlenionym M9 w komorze beztlenowo-niedotlenionej (patrz instrukcje poniżej, sekcja 3.6.1) lub, alternatywnie, w specjalnie zaprojektowanym pojemniku (patrz instrukcje poniżej, sekcja 3.6.2).
	<ol>
		<li>Jeśli ma być używana komora antyoksykacyjna/hipoksyjna, pozostaw trochę oczyszczonego M9 w komorze przed rozpoczęciem kroku 3.5 i powtórz krok 3.5, gdy robaki znajdą się w komorze.</li>
		<li>Jeżeli ma być użyta komora celna, szczegółowy opis sposobu stworzenia taniego aparatu znajduje się na końcu niniejszego protokołu i został opisany przez inną grupę wcześniej11. Krótko:
		<ol>
			<li>Wykonaj dwa otwory w pokrywie pojemnika typu Tupperware o pojemności 250 ml i dodaj do nich łączniki rurek. Jeden będzie służył do wstrzykiwania mieszaniny gazów, podczas gdy drugi będzie wyjściem gazu do łaźni wodnej.</li>
			<li>Umieść robaki w komorze i uszczelnij komorę za pomocą pokrywy.</li>
			<li>Gaz o stałym strumieniuN2 (100 ml/min).</li>
			<li>Umieścić pojemnik w łaźni wodnej o temperaturze 26 °C. Upewnić się, że rurka wylotowa jest dobrze zanurzona w wodzie, aby powietrze nie wracało i aby nie było nieszczelności w systemie (widoczne przez pęcherzyki unoszące się z samej komory).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować robaki w temperaturze 26 °C przez 20 godzin.</li>
</ol>
4. Symulowana reperfuzja
<ol>
	<li>Po 20 godzinach w warunkach AS wyjąć rurki z komory inkubacyjnej do powietrza w pomieszczeniu.</li>
	<li>Odpipetować C. elegans końcówką pokrytą BSA (jak w kroku 3.3) na płytkę NGM o średnicy 35 mm z ziarnem OP50. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Po tym robaki będą gotowe do zdobycia.</li>
</ol>
5. Rozpoznawanie martwych i żywych robaków
<ol>
	<li>Za pomocą platynowego kilofa delikatnie dotknij czubka głowy robaka. Żywe robaki będą się cofać po dotknięciu. Jeśli robaki nie reagują, oznacz je jako martwe. Czasami robak nie porusza się do tyłu, ale może wykazywać lekkie ruchy głowy na boki. Chociaż nie są one technicznie martwe, prawie na pewno wygasną w ciągu kilku godzin i powinny zostać ocenione jako martwe. Jeśli ktoś czeka zbyt długo z nacięciem robaków, może dojść do wewnętrznego wylęgu potomstwa i te "worki robaków" mogą pęknąć, co bardzo utrudni wykrycie tusz.</li>
	<li>Usuń zarówno żywe, jak i martwe robaki z płytki podczas ich liczenia, aby uniknąć podwójnego liczenia. Żywe robaki można przenieść na osobną płytkę w celu przeprowadzenia testów behawioralnych. Ilość żywych robaków w stosunku do ogółu jest reprezentowana jako % robaków, które przeżyły (rysunek 1A).</li>
</ol>
6. Test reakcji na dotyk
<ol>
	<li>Szczegółowy opis tego protokołu został przedstawiony w: Hart, Anne C., ed. Behavior (July 3, 2006), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
	<ol>
		<li>Aby ocenić reakcję na dotyk, zidentyfikuj poruszające się robaki i delikatnie dotknij boku głowy robaka (w pobliżu środkowej części gardła) szpikulcem do rzęs (ryc. 3).</li>
		<li>Jeśli robak porusza się do tyłu, oceniony jako responsywny, jeśli nie, oceniony jako niereagujący (Rysunek 1B). Powtórz ten krok 10-15 razy dla każdego robaka w odstępach 10 sekund. Zbadaj co najmniej 10 robaków w każdej grupie, aby uzyskać dokładne dane. Ten sam test można zastosować do oceny zmian lokomotorycznych do przodu po lekkim dotknięciu tylnej ściany ciała. Pamiętaj, aby nie dotykać głowy ani ogona robaka, ponieważ stymuluje to wyraźne zachowanie.</li>
		<li>Na koniec włącz szczepy kontroli genetycznej [N2 Bristol typu dzikiego dla pozytywnego, mutant mec (mechanosensoryczny) dla ujemnego - np. CB1338 mec-3 (e1338)IV], aby skalibrować siłę, z jaką dotykać robaków. Zbyt ostra stymulacja wywoła reakcję behawioralną u mutantów mec, zbyt mała nie wywoła efektu u dzikich grup kontrolnych N2</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Modyfikacje neuronalne
<ol>
	<li>Aby uwidocznić modyfikacje neuronów po AS, użyj szczepu, który wyraża GFP w neuronach mec reagujących na dotyk4,5. Neurony te mają długie wyrostki, które przebiegają wzdłuż ściany ciała i są łatwe do oceny pod kątem nieprawidłowości morfologicznych. Ponadto informacje morfologiczne można zintegrować z behawioralnymi pomiarami funkcji neuronów, jak opisano powyżej. Jednym ze szczepów, który można wykorzystać do tego celu, jest TU2583, który jest dostępny w Centrum Genetyki C. elegans i zawiera zintegrowany transgen uIs25 eksprymujący GFP z promotora mec-18 lub alternatywnie TU2562, który zawiera zintegrowaną fuzję mec-3::GFP.</li>
	<li>Przygotuj podkładkę z agarozą.
	<ol>
		<li>Rozpuść 2% agarozy w wodzie, doprowadź do 1x M9 z 10x bulionem i utrzymuj roztwór w temperaturze 70 °C.</li>
		<li>Umieść kroplę (~20 μl) tego roztworu na szkiełku podstawowym (25 mm x 75 mm), które zostało umieszczone między dwoma innymi szkiełkami, z których każde ma pojedynczy kawałek taśmy na spodniej stronie.</li>
		<li>Umieść ostatnie szkiełko szkiełkowe prostopadłe do pierwszego na wierzchu 2% roztworu agarozy i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej. Powinno to utworzyć podkładkę o grubości taśmy.</li>
		<li>Zdejmij górny szkiełko i dodaj 10 μl M9 zawierającego 0,1% tetramizolu, który unieruchomi robaki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś kilka (~10) żywych robaków na 2% zjeżdżalnię agarozową. Umieść na nich szkiełko nakrywkowe i zwizualizuj GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektywem 100X przy odpowiednim oświetleniu.</li>
	<li>Uszkodzone neurony będą wykazywać cytozolowy ciąg błony perłowej wzór w procesach, składający się z wielu punctum (ryc. 2A) i / lub nieprawidłowości, w których procesy wydają się być przerwane (ryc. 2B). Policz punctum i nieprawidłowości w obu neuronach dla każdego robaka, używając w sumie co najmniej 10 robaków.</li>
</ol>
8. Laboratoryjna komora hipoksyjna
<ol>
	<li>Szczelny, hermetyczny pojemnik w stylu Tupperware można doposażyć w komorę beztlenową. Zadbaj o to, aby wybrać pojemnik, który jest tak mały, jak to tylko możliwe. Mały pojemnik szybciej tworzy środowisko niedotlenienia i łatwiej go zmieścić w kąpieli wodnej (ryc. 4).</li>
	<li>Wykonaj dwa otwory w pokrywie (można to zrobić śrubokrętem lub podgrzewając kleszcze i wciskając w pokrywkę) i włóż plastikowy lub metalowy łącznik pasujący do rurki (Rysunek 5A). Użyj kleju, który można umieścić pod wodą, a także twardnieje po wyschnięciu, unikając przesuwania złącza, a tym samym zmniejszając możliwość wycieku (rysunek 5B).</li>
	<li>Pojemnik należy umieścić w łaźni wodnej tak, aby był całkowicie zanurzony (rysunek 4). Aby zanurzyć pojemnik, użyj obciążnika do butelki lub ciężarka do nurkowania.</li>
	<li>Jedno z połączeń rurki posłuży do wprowadzenia mieszaniny gazów, a druga rurka będzie działać jako redukcja ciśnienia, dlatego należy ją pozostawić pod wodą, aby pojemnik był szczelnie odcięty od środowiska zewnętrznego (rysunek 4).</li>
	<li>Skład powietrza można modulować za pomocą specjalnie wykonanych gazów, regulatorów przepływu masowego lub dowolnej aparatury, która miesza pożądane gazy. Przepływ gazu powinien być kontrolowany, ponieważ wysoki przepływ może powodować nadmierne parowanie. Na przykład w pojemniku o pojemności 250 ml 100 ml/min gazu zapewni dobrą przestrzeń dla robaków i odpowiedni topnik.</li>
	<li>Długość przewodów powinna być ograniczona do minimum, ponieważ mogą one przepuszczać gaz, umożliwiając wejścieO2. Ważne jest, aby unikać stosowania rurek silikonowych, Tygon, ponieważ materiały te są przepuszczalne dla wymiany gazowej. Preferujemy rurki polipropylenowe lub nylonowe. Rurki szklane lub metalowe dobrze utrzymują gazy, ale są również trudniejsze w obróbce.</li>
</ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+Funct.+Genom.+Proteom%22%5BJournal%5D)">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li>
<li>Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li>
<li>Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin%2FIGF+receptor+homolog+DAF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li>
<li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li>
<li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li>
<li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li>
<li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287(2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088(2012).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li>
<li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li>
<li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme%2C+Ndi1%2C+in+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288(2011).</li>
<li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

AS jest szeroko stosowany u C. elegans do modelowania obrażeń IR. W tym protokole należy podkreślić kilka kluczowych punktów: C. elegans są odporne na szeroki wachlarz urazów, co uzasadnia potrzebę 3 jednoczesnych zniewag (upał, głód i niedotlenienie), aby osiągnąć śmierć przy użyciu tego systemu. Sama anoksja nie zabija robaków w tym oknie czasowym14. Ponadto wzrost temperatury jest dodatkowym stresem, dlatego ważne jest, aby uważnie monitorować. Ściśle mówiąc, głód sam w sobie nie przyczynia się znacząco do obserwowanego stopnia śmiertelności7, ale wydaje się, że zmniejsza zmienność wśród eksperymentalnych powtórzeń. Biorąc pod uwagę, że z dnia na dzień może występować znaczna zmienność, niezwykle ważne jest porównywanie próbek prowadzonych bezpośrednio równolegle i powtarzanie eksperymentów przez wiele dni. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki są mierzone dla trzech oddzielnych płytek po 50-100 robaków/warunki eksperymentalne, a następnie są one uśredniane i traktowane jako pojedyncza replika eksperymentalna. Ogólnie rzecz biorąc, od siedmiu do dziewięciu powtórzeń wydaje się być wystarczających do osiągnięcia lub wykluczenia istotności statystycznej.
Stadium rozwojowe robaków wykorzystanych w eksperymencie również musi być dokładnie monitorowane, ponieważ podatność różnych stadiów na uszkodzenie ZA różni się znacznie15,16. Stosowanie młodych dorosłych jest standardem, a robaki w stadium larwalnym (L3 i L4) wydają się być bardziej odporne na szkodliwe działanie ZZSK (dane niepublikowane).
Protokół ten przedstawia dwa sposoby przeprowadzania eksperymentów, jeden przy użyciu aparatury laboratoryjnej (przy użyciu pojemników typu Tupperware i wejścia gazowego11), a drugi przy użyciu komercyjnej komory hipoksyjnej4,6. Anoksję można osiągnąć za pomocą innych środków, które zużywają tlen, jak opisano w innym miejscu13,17. Zastosowanie alternatywnych technik w celu stworzenia środowiska hipoksyjnego może zmienić czas inkubacji AS niezbędny do wytworzenia pożądanej ilości śmierci. Celowanie w przeżycie ~20% jest idealnym punktem wyjścia do badania interwencji ochronnych, podczas gdy 80% jest podobnie idealne dla interwencji, które nasilają szkodliwe skutki ZZSK. Kolejnym ważnym zastrzeżeniem jest czas, w którym obserwator ocenia martwe/żywe robaki. Jeśli czas analizy zostanie wydłużony poza 24 godziny, dane mogą być mylące, ponieważ martwe robaki stają się coraz trudniejsze do zidentyfikowania. Może to wynikać z faktu, że tusze robaków stają się z czasem stosunkowo przezroczyste, ale także z faktu, że zapłodnione zarodki mogą rozwinąć się w potomstwo pośmiertne wewnątrz tusz i zakłócać je w miarę pojawiania się.
Analiza morfologii neuronów może być zmodyfikowana tak, aby przyjrzeć się wzorcom ekspresji białek18,fragmentacji jądra 4 i innym parametrom19 poprzez podstawienie szczepu robaka, który wyraża odpowiedni marker kodowany genetycznie. Ostatnim zastrzeżeniem jest to, że wizualizacja procesów neuronalnych powinna być wykonana w czasie krótszym niż 30 minut po umieszczeniu robaków na szkiełku. Zwierzęta trzymane pod narkozą na szkiełkach przez dłuższy czas mogą wykazywać uszkodzenia niezależne od AS. Dostosuj liczbę zwierząt na slajdzie do czasu potrzebnego na ich śledzenie i analizowanie.

C. elegans to nicień, który od czasu jego wprowadzenia przez Brennera1 został powszechnie przyjęty jako wielokomórkowy eukariotyczny organizm modelowy. Jest to tani, prosty i wszechstronny model, który umożliwia łatwe powiązania między zmianami genetycznymi a zmianami fenotypowymi2.
Niedokrwienie charakteryzuje się brakiem składników odżywczych i dopływu tlenu do tkanki, po którym następuje reperfuzja, gdy wytwarzany jest wyrzut reaktywnych form tlenu3 i dochodzi do większości uszkodzeń. W 2002 r. opracowano model niedokrwienia/reperfuzji (IR) u C. elegans 4 polegający na poddaniu całego robaka działaniu niedotlenienia, niedoboru składników odżywczych i stresu cieplnego przez około 20 godzin, a następnie 24 godziny w normalnych warunkach. Chociaż ten model jest technicznie stanem głodu beztlenowego (AS), śmierć komórki zachodzi poprzez mechanizmy, które są konserwatywne u ssaków, w tym uszkodzenia wywołane przez utleniacze podczas reperfuzji5. Ponadto, podobnie jak w przypadku podczerwieni u ssaków, uszkodzeniom wywołanym przez AS u C. elegans można zapobiec poprzez wstępne kondycjonowanie niedokrwienne6,7 lub wstępne kondycjonowanie anestezjologiczne8,9.
Poniższe protokoły pokazują, jak naśladować IR u C. elegans za pomocą modelu AS, jak oceniać nieprawidłowości morfologiczne i behawioralne wynikające z AS, oraz jak dostosować protokół w sposób, który pozwala na przeprowadzenie eksperymentu przy niższej inwestycji początkowej przy użyciu specjalnie zaprojektowanej, łatwej do skonstruowania alternatywy komory.

<table><tbody><tr><td>N2&nbsp; szczep</td><td>CGC</td><td></td><td>Szczep typu dzikiego. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td>CGC</td><td>TU2583</td><td>zintegrowany transgen fluorescencyjny używany do znakowania neuronów dotykowych.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>kanoniczny mutant mec-3, który jest niewrażliwy na dotyk.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>Rurka do mikrowirówki</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td>Inkubator niskotemperaturowy <td>Nikon USA</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td><td>Model 2005</td><td></td></tr><tr><td>Szpikulec</td><td></td><td></td> do <td>rzęs Wykałaczkę do rzęs można przygotować, przymocowując&nbsp; rzęsę do drewnianej wykałaczki, a następnie umieszczając wykałaczkę w szklanej pipecie Pasteura (Rysunek 3).</td></tr><tr><td>Hypoxic Chamber</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>Schowek na rękawice hipoksyjne wyposażony w katalizator paladowy i kontroler CO2.</td></tr></tbody></table>

model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u c. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protokoły dotyczące anoksji/głodu w organizmie modelu genetycznego C. elegans symulują niedokrwienie/reperfuzję. Robaki są oddzielane od pokarmu bakteryjnego i umieszczane w stanie anoksji na 20 godzin (symulowane niedokrwienie), a następnie przenoszone do normalnej atmosfery z jedzeniem (symulowana reperfuzja). Ten eksperymentalny paradygmat skutkuje zwiększoną śmiertelnością i uszkodzeniem neuronów, a także przedstawiono techniki oceny żywotności organizmu, zmian w morfologii procesów neuronów dotyku, a także wrażliwości na dotyk, która reprezentuje behawioralne wyjście funkcji neuronalnych. Na koniec opisano metodę budowy inkubatorów hipoksyjnych przy użyciu zwykłych kuchennych pojemników do przechowywania. Dodanie jednostki sterującej przepływem masowym pozwala na wprowadzanie zmian w mieszaninie gazów w niestandardowych inkubatorach, a łaźnia z obiegiem wody pozwala zarówno na kontrolę temperatury, jak i ułatwia identyfikację nieszczelności. Ta metoda stanowi tanią alternatywę dla dostępnych na rynku jednostek.

Poddanie C. elegans 20 h AS w temperaturze 26 °C w specjalnie wykonanej komorze inkubacyjnej, zgodnie z opisem (Sekcja 3.6.2), doprowadziło do znacznej śmiertelności (Rycina 1A)5. Następnie wykonane obrazowanie fluorescencyjne punktacji i pęknięć w znakowanych GFP wypustkach neuronalnych osobników, które przeżyły, potwierdziło obecność nieprawidłowości morfologicznych (Rycina 2). Osobniki te wykazywały również słabą reakcję na delikatny dotyk ściany ciała (Rycina 1B). Model ten był wykorzystywany przez wiele grup badawczych do analizy wpływu predyspozycji genetycznych, interwencji farmakologicznych oraz plastyczności metabolicznej na efekty zależne od AS4-6,8,9,12,13.
<img alt="Wykresy słupkowe przedstawiające przeżywalność i reakcję na dotyk w grupach kontrolnej i AS; analiza odpowiedzi biologicznej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przeżywalność i reakcja na dotyk C. elegans po AS. A) Procent nicieni wykazujących przeżywalność 24 h po AS. Szczep N2 stanowi genetyczne tło typu dzikiego, a KWN85 zawiera zintegrowany transgen znakujący neurony mec białkiem GFP. B) Reakcja żywych C. elegans (szczep N2) na bodźce dotykowe po AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat nieprawidłowości neuronów z obrazami mikroskopowymi, wykresy słupkowe A i B przedstawiające wyniki analizy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Modyfikacje neuronów dotykowych po AS. Nieprawidłowości neuronów dotykowych (PLML i PLMR), takie jak pokręcone wypustki i przerwy (A) lub gromadzenie się agregatów GFP w wypustkach (B), były monitorowane u przeżyłych znieczulonych C. elegans po AS.
<img alt="Drobnoporowaty emiter, źródło jonizacji, układ eksperymentu MS, analiza białek, zbliżenie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pęseta z rzęsy. Zmontowana pęseta z rzęsy. Na wstawce szczegół rzęsy przyklejonej do drewnianego wykałaczkowego trzonka.
<img alt="Układ do zbierania gazu w zbiorniku z wodą, schemat pokazujący dopływ/odpływ gazu, stabilizację ciężaru butelki." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Samoróbka komory hipoksycznej w kąpieli wodnej. Zamknięty pojemnik przygotowany do rozpoczęcia eksperymentu. Strzałki wskazują wlot i wylot gazu oraz obciążenie w postaci butelki, które zapobiega wypływaniu pojemnika na powierzchnię.
<img alt="Złączniki rurek szczelnego pojemnika; układ eksperymentalny do badania transferu płynów; schemat." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Szczegóły wewnętrznej i zewnętrznej strony pokrywy pojemnika. A) Zewnętrzna strona pokrywy pojemnika, przedstawiająca rurkę i jej złącznik przymocowany do wcześniej wykonanego otworu. B) Zewnętrzna strona pokrywy pojemnika, przedstawiająca złącznik rurki przymocowany do wcześniej wykonanego otworu.

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odwzorowanie niedokrwienia i reperfuzji u sea elegance. Osiąga się to poprzez przeniesienie sea elegance do mikrorurki i wypłukanie bakterii. Drugim krokiem jest stworzenie środowiska anoksycznego.Przy użyciu wykonanej laboratoryjnie komory hipoksycznej zwierzęta poddaje się anoksji przez 20 godzin, a następnie po 24 godzinach przenosi do warunków tlenowych. Ostatnim krokiem jest ocena liczby martwych zwierząt oraz ocena reakcji na dotyk. Modyfikacje neuronalne są również obserwowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.W rezultacie wywołanie anoksji i głodzenia u C. elegans służy do odtworzenia warunków odpowiadających niedokrwieniu i urazom występującym u wyższych eukariontów w łatwiejszym i bardziej elastycznym modelu genetycznym. Przewagą tych technik nad tradycyjnymi metodami symulacji niedokrwienia w izolowanych sercach komórkowych jest fakt, że C. elegans stanowi bardzo potężny model genetyczny, a fakt, że są to organizmy przenośne, pozwala na stosowanie wielu różnych płynów i technik. Dodatkowo pokazujemy, jak zamiast drogiej komory hipoksycznej lub środowiskowej, użyć laboratoryjnej komory hipoksycznej i środowiskowej, której koszt wyniesie zaledwie kilka dolarów.Zazwyczaj osoby zajmujące się tą kwestią powinny zwrócić uwagę na kilka kluczowych punktów, takich jak na przykład płukanie buforów, duża ostrożność podczas oceny nicieni oraz utrzymywanie stałej temperatury i poziomu tlenu. Wszystkie te czynniki mogą wpłynąć na wynik eksperymentu. Aby przygotować niestandardową komorę hipoksyczną, można przystosować szczelny pojemnik typu Tupperware jako komorę anoksyczną. Należy wybrać jak najmniejszy pojemnik, ponieważ mały pojemnik szybciej tworzy środowisko hipoksyczne i łatwiej mieści się w kąpieli wodnej.W pokrywce wykonaj dwa otwory o rozmiarze dopasowanym do plastikowego lub metalowego złącznika pasującego do rurek. Zabeziecz złącznik za pomocą kleju wodoodpornego, który twardnieje po wyschnięciu, aby zapobiec przesuwaniu się złącznika i tym samym zmniejszyć ryzyko wycieku. Alternatywnie można użyć uszczelki neoprenowej, aby pomóc w uszczelnieniu złącznika w pojemniku. Umieść pojemnik w kąpieli wodnej w taki sposób, aby był całkowicie zanurzony.Aby zanurzyć pojemnik, należy użyć obciążnika do butelek lub obciążnika nurkowego. Jedno z przyłączy rurki posłuży do wprowadzania mieszaniny gazowej, a druga rurka będzie pełnić funkcję zaworu upustowego.Należy zatem pozostawić go pod wodą, aby pojemnik był odizolowany od środowiska zewnętrznego. Aby rozpocząć hodowlę C. elegans zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować bufor M9 i usunąć tlen poprzez nasycenie azotem na 30 minut przed eksperymentem, utrzymując go w lodzie. W pokrywkach probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, w których umieszczone zostaną nicienie podczas głodzenia w warunkach anoksji, należy wykonać mały otwór.Otwór umożliwia wymianę gazową bez konieczności pozostawiania pokrywki otwartej, co mogłoby doprowadzić do nadmiernego odparowania pożywki. Do każdej płytki 35 mm zawierającej młode dorosłe nicienie należy dodać 1 mL natlenionego buforu M9 o temperaturze pokojowej. Należy zachować ostrożność, aby nie usunąć bakterii z płytki.Po około jednej minucie nicienie powinny pływać w buforze M9. Następnie pokryj końcówkę pipety o objętości 1 ml albuminą surowicy bydlęcej (BSA), pipetując i wydmuchując sterylnym 1% roztworem BSA. Ostrożnie przechyl płytkę z nicieniami w buforze M9 i usuń bufor M9 z tego samego miejsca, w którym został dodany.Następnie przenieś zawiesinę do przygotowanych probówek do mikrowirówki. Pozostaw próbki na lodzie, aż nicienie opadną na dno probówek. Usuń z probówek taką ilość M9, jaka jest możliwa, nie naruszając przy tym osadu z nicieniami.Następnie dodaj jeden mililitr schłodzonego i napowietrzonego medium M9 i pozostaw probówkę na lodzie, aż nicienie opadną na dno. Powtórz ten etap płukania trzykrotnie. Podczas ostatniego płukania usuń medium M9, tak aby w probówce pozostało około 100 µL.Następnie umieść probówki z nicPONiami w odtlenowanym buforze M9 w komorze i zamknij ją, doprowadzając gaz z ciągłym przepływem azotu o wartości 100 ml/min. Umieść pojemnik w kąpieli wodnej o temperaturze 26 °C. Upewnij się, że rurka wylotowa jest całkowicie zanurzona w wodzie, aby zapobiec cofaniu się powietrza, oraz że w systemie nie ma żadnych nieszczelności.Następnie należy inkubować nicienie w temperaturze 26°C przez 20 godzin. Po inkubacji za pomocą pipety z końcówką pokrytą BSA nanieść sea elegance na płytkę z pożywką NGM (nematode growth media) o średnicy 35 mm. Płytki należy inkubować w temperaturze 20°C przez 24 godziny. Po tym czasie nicienie będą gotowe do oceny.Używając platynowej igły, delikatnie dotknij czubka głowy żywego nicienia. Nicienie po dotknięciu powinny poruszyć się do tyłu; jeśli nie reagują, należy je zakwalifikować jako martwe. Sporadycznie zdarza się, że nicień nie poruszy się do tyłu, lecz wykaże lekki ruch głową na boki; mimo że technicznie nie jest on martwy, z niemal całkowitą pewnością wyginie w ciągu kilku godzin, dlatego należy go zakwalifikować jako martwego.Powtórz ten krok od 10 do 15 razy dla każdego nicienia w odstępach dziesięciosekundowych. Zbadaj co najmniej 10 nicieni w każdej grupie, aby uzyskać dokładne dane do wizualizacji modyfikacji neuronalnych po głodzeniu w warunkach anoksji. Użyj szczepu wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego lub GFP w neuronach mech reagujących na dotyk.Nanieś kroplę 2% roztworu ARO na szkiełko przedmiotowe umieszczone pomiędzy dwiema innymi szkiełkami, które mają na dolnej krawędzi przyklejony pojedynczy kawałek taśmy. Połóż ostatnie szkiełko prostopadle do pierwszego na powierzchni 2% roztworu ARO i pozostaw do schłodzenia w temperaturze pokojowej. Powinno to utworzyć warstwę o grubości taśmy.Następnie zdejmij górny preparat i dodaj 10 µL M9 zawierającego 0,1% tetraole, co unieruchomi nicienie. Przenieś około 10 żywych nicieni na preparat z 2% agarozą i przykryj je szkiełkiem podstawowym. Wizualizuj GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 100x przy odpowiednim oświetleniu.Uszkodzone neurony będą wykazywać w wypustkach cytoplazmatyczny obraz „sznura pereł”, składający się z wielu punktów i/lub nieprawidłowości w miejscach, w których wypustki wydają się być przerwane. Należy policzyć punkty i nieprawidłowości w obu neuronach dla każdego osobnika, wykorzystując łącznie co najmniej 10 osobników. Poddanie *C. elegans* 20-godzinnej anoksji i głodzeniu w temperaturze 26 stopni Celsjusza w wykonanej laboratoryjnie komorze inkubacyjnej doprowadziło do znaczącej śmiertelności.Osobniki, które przeżyły, wykazywały również słabą reakcję na lekki dotyk ściany ciała. Następujące obrazowanie fluorescencyjne punktowych zagęszczeń oraz pęknięć w procesach neuronalnych znakowanych GFP u osobników przeżywających potwierdziło obecność nieprawidłowości morfologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować niedokrwienie.Obserwacja w komorach hipoksycznych wykonanych w laboratorium pozwala na pomiar śmiertelności oraz modyfikacji neurologicznych u *Caenorhabditis elegans*. Model ten był wykorzystywany przez wiele grup badawczych do analizy wpływu interwencji w obrębie kanałów jonowych oraz metabolizmu na przeżywalność i śmierć w warunkach hipoksji.

an-anoxia-starvation-model-for-ischemiareperfusion-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Model anoksji-głodu dla niedokrwienia/reperfuzji w C. elegans

Niniejsza praca szczegółowo opisuje sposób wykorzystania komór hipoksji z przepływem ciągłym do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2 w celu zrozumienia reakcji biologicznych na obniżone stężenie O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dostosować go do szerokiego zakresu stężeń O2 oraz różnych systemów...

Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

Źródło: Chen, Y. i in., Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje test martwicy mięśni u C. elegans (Caenorhabditis elegans) z użyciem patogennych szczepów Aeromonas . Poprzez karmienie zielonych białek fluorescencyjnych (GFP) na płytkach z nasionami Aeromonas, test modeluje infekcję bakteryjną i ujawnia uszkodzenia tkanek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Postępująca utrata struktury mięśniowej i sygnału...

Badanie martwicy mięśni u C. elegans wywołane przez patogenny szczep aeromonas

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Nicień Caenorhabditis elegans jest doskonałym modelem do analizy interakcji gospodarz-patogen. Opisano tutaj protokół zakażenia robaka paciorkowcami z grupy mitis i określenia aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny przeciwkoH2O2wytwarzanej przez tę grupę organizmów.

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Poznaj model niedokrwienia/reperfuzji w C. elegans przy użyciu beztlenowej komory. Metoda pozwala ocenić śmiertelność, zmiany neuronalne i reakcje behawioralne w niedokrwieniu.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów