Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-maze

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostego testu z wykorzystaniem labiryntu w kształcie litery Y w celu zbadania zmysłu węchu u Drosophila melanogaster. Osiąga się to poprzez najpierw poddanie much głodówce przez 16 do 18 godzin, aby zmotywować je do eksploracji nowych środowisk z bodźcami lotnymi. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie układu labiryntu Y zawierającego źródła zapachów na papierze filtracyjnym, takie jak kwas octowy w rozpuszczalniku w porównaniu z samym rozpuszczalnikiem.

Trzecim krokiem jest szybkie i delikatne wprowadzenie much do probówki startowej. Po kilku godzinach ostatnim etapem jest ocena lokalizacji much w labiryncie. Ostatecznie, na podstawie danych uzyskanych z labiryntu w kształcie litery Y, wyniki mogą wykazać reakcję na substancję zapachową.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy postanowiliśmy opracować prosty i niedrogi sposób testowania odpowiedzi węchowej u muszek. Przewagą tej techniki nad innymi opcjami jest to, że pozwala ona muchom podjąć decyzję, czy poziom stresu jest zbyt wysoki. Procedurę zaprezentuje Megan Simon, doktorantka z mojego laboratorium. Do realizacji tego protokołu należy przygotować izogeniczną linię muszek o stabilnych i wyraźnych fenotypach behawioralnych. Każde takie stado będzie służyć jako kontrola referencyjna w teście węchowym; w przypadku każdego szczepu genetycznego wykorzystywanego w eksperymencie, należy przeprowadzić krzyżowanie wsteczne ze szczepem referencyjnym przez pięć pokoleń.

W każdym krzyżowaniu wstecznym sparuj pojedyncze samice szczepu eksperymentalnego z kilkoma izogenicznymi samcami. W przypadku eksperymentów węchowych utrzymuj muszki owocówki na standardowej pożywce kukurydzianej z antybiotykiem w cyklu świetlnym 12:12 i w temperaturze 25°C.

Doświadczenia powinny być zawsze przeprowadzane w temperaturze 25 °C i przy oświetleniu w dalekiej czerwieni widma, niewidocznej dla drosophila. Między eksperymentami, przed przeprowadzeniem analizy następnego ranka, musi być również możliwa pełna wentylacja pomieszczenia. Na koniec dnia należy przenieść kohorty od 10 do 20 linii eksperymentalnych do szklanych fiolek, w których wilgoć zapewniony zostanie za pomocą wilgotnego ręcznika.

Muchy należy przetestować w ciągu 16 do 18 godzin, w przeciwnym razie mogą one zginąć następnego dnia z powodu odwodnienia lub głodu. Zmontuj labirynt w kształcie litery Y. Rozpocznij od połączenia łącznika w kształcie litery Y z dwiema szklanymi fiolkami za pomocą łączników piankowych z przyciętymi końcówkami pipet, które tworzą kanały; ich zwężający się kształt sprawia, że są to przejścia jednokierunkowe.

Trzecie ramię litery Y jest połączone z rurką załadowczą wykonaną z szerokiej części końcówki pipety, która umożliwia przejście z fiolki załadowczej do punktu wyboru labiryntu. Za każdym zwężającym się tunelem znajduje się szklana fiolka, z których jedna musi zostać załadowana substancją zapachową. Są to bolusy o objętości 40 µL nasączone w kwadratach papieru tkankowego o boku 28 mm.

To, która z dwóch probówek zawiera substancję zapachową, powinno być zmieniane losowo przed każdym testem. Krótko schłodź muchy na lodzie, aby spowolnić ich ruchy. Czynność tę należy przeprowadzić pod daleką czerwienią z żarówek LED; następnie w temperaturze 25 °C delikatnie przenieś grupę much do probówki ładunkowej i wprowadź muchy testowe do labiryntu w kształcie litery Y.

Nie należy stosować anestezji gazowej. Bardzo ważne jest, aby przenieść muchy do fiolki ładunkowej w sposób szybki i delikatny. Jest to w rzeczywistości najtrudniejszy etap eksperymentu, ponieważ muchy muszą szybko się obudzić przed rozprzestrzenieniem się pozostałych osobników w masie Y.

Należy pozwolić muchom na eksplorację labiryntu przez 24 godziny, aby maksymalna liczba osobników przedostała się do jednej z dwóch szklanych probówek. Liczba much obecnych w poszczególnych probówkach służy do obliczenia indeksu olfaktorycznego. Do wartości uzyskanych na podstawie zachowania do 10 much należy zastosować standardowe metody statystyczne.

Jeśli 10 kohort much nie daje spójnych wyników, badania można przeprowadzić z użyciem 20 kohort much. Aby wyczyścić elementy labiryntu, należy namoczyć je w rozmontowanym stanie w RBS 35 MD przez noc. Następnie należy przepłukać je wodą z kranu, a na koniec wodą DI przed suszeniem na powietrzu.

Standardowe reakcje na substancję zapachową z wykorzystaniem labiryntu w kształcie litery Y obejmują przyciąganie, obojętność lub unikanie. Na przykład muchy z kantonu silnie unikają 10% kwasu octowego, podczas gdy nie unikają 10% kwasu fenylooctowego.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że ten test zapachowy odzwierciedla sztuczne środowisko dla much. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy w arenie lub testy wewnętrzne, aby potwierdzić reakcje węchowe much w różnych warunkach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak w prosty sposób testować reakcje węchowe Drosophila melanogaster przy użyciu testu SW.