Name: Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Poznaj technikę immunohistochemii całego preparatu do wizualizacji neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne różnicowania się neuronów węchowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Program MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Prywatnych Uniwersytetach oraz grant JSPS Young Scientist B dla H.T. Chcielibyśmy podziękować Ohtake Norihito za montaż klipów wideo.

1. Przygotuj talerz z jabłkami
<ol>
	<li>Wymieszaj 12,5 g agaru, 125 ml 100% dostępnego w handlu soku jabłkowego, 12,5 g glukozy i 375 mlH2O. Mieszaninę podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 1 do 2 minut i przelać do 3-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Krzyżówka genetyczna
<ol>
	<li>Zastosować następującą reprezentatywną krzyżówkę genetyczną:</li>
</ol>
Or49a-mCD8::GFP/CyO x w1118
3. Protokół preparacji i barwienia
<ol>
	<li>Znieczul muchę, a następnie przetnij głowę muchy pionowo, trzymając ją za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Ostrożnie umieść czułki zawierające porcję na talerzu z jabłkami.</li>
	<li>Wytnij trzeci segment anteny za pomocą cienkich nożyczek do preparowania.</li>
	<li>Umieścić 90 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w 0,1% PBST (PBS z 0,1% Triton X-100)) na środku naczynia hodowlanego ze szklanym dnem.</li>
	<li>Delikatnie przenieś wypreparowane czułki ostrą igłą bezpośrednio do roztworu utrwalającego. W razie potrzeby fizycznie zanurz anteny w roztworze za pomocą igły.</li>
	<li>Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej (RT). Umyj anteny w 0,4% PBST (PBS z 0,4% Triton X-100), 3x 10 minut w każdej, trzymając je w tym samym naczyniu. Użyj żółtych końcówek, aby usunąć i dodać roztwór PBST. Za każdym razem należy stosować 90 μl roztworu myjącego. 
	UWAGA: Nie umieszczaj naczynia w shakerze podczas immunohistochemii. Przed wyjęciem lub dodaniem roztworu do naczynia należy za pomocą igły umieścić wszystkie czułki na środku naczynia i ostrożnie dodać lub usunąć roztwór z krawędzi naczynia.</li>
	<li>Zatkać czułki 90 μl 5% normalnej surowicy końskiej w 0,1% PBST na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po usunięciu roztworu blokującego inkubować czułki z 90 μl przeciwciał pierwszorzędowych w 0,1% PBST zawierającym 5% surowicy końskiej przez 48 godzin w temperaturze 4 °C w wilgotnym pojemniku, jak opisano wcześniej8.</li>
	<li>Umyj anteny 6 razy po 10 minut w 0,4% PBST.</li>
	<li>Inkubować czułki z 90 μl przeciwciał drugorzędowych w 0,1% PBST zawierającym 5% surowicy końskiej przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Myć 6 x 10 minut używając 0,4% PBST.</li>
	<li>Aby zamontować anteny, usuń PBST z naczynia hodowlanego tak bardzo, jak to możliwe i stopniowo wprowadzaj do anten dwa różne stężenia glicerolu. Najpierw dodaj 40% glicerolu do naczynia na 1 do 2 minut; Następnie usuń to i dodaj 80% glicerolu.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij czułki (w tym 80% glicerolu) z naczynia hodowlanego za pomocą żółtej końcówki i umieść je na szkiełku. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Anteny są teraz gotowe do zobrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction.</a> C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).</li>
<li>Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+onset+of+odorant+receptor+expression+in+the+developing+zebrafish+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system.</a> Neuron. 16, 23-34 (1996).</li>
<li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li>
<li>Stockinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+that+governs+Drosophila+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior.</a> Cell. 121, 795-807 (2005).</li>
<li>Endo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+of+Notch+targets+in+olfactory+receptor+neuron+diversification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification.</a> Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Suh, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+population+of+olfactory+sensory+neurons+mediates+an+innate+avoidance+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila.</a> Nature. 431, 854-859 (2004).</li>
<li>Sachse, S., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inhibition+for+temporal+and+spatial+odor+representation+in+olfactory+output+neurons%3A+A+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study.</a> J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117, 965-979 (2004).</li>
<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sekcja opisywanej przez nas anteny Drosophila jest prosta i łatwa do wykonania w warunkach laboratoryjnych. Aby zapewnić udaną sekcję, konieczne jest użycie nożyczek o cienkich krawędziach. Podczas barwienia immunologicznego wypreparowanej anteny ważne jest, aby inkubować je w pojemniku wypełnionym wilgocią, aby uniknąć parowania roztworu przeciwciała. Wypreparowana antena ma tendencję do unoszenia się w roztworze. Użycie 0,1% Tritonu w PBS podczas etapów utrwalania i blokowania ułatwi zanurzenie anteny w roztwo...

System węchowy służy do rozróżniania ogromnej różnorodności cząsteczek zapachowych, a następnie do wysyłania wynikowych informacji do wyższych ośrodków mózgu. Dane te są wykorzystywane do precyzyjnej kontroli podstawowych zachowań zwierząt, takich jak karmienie i krycie1-6. Ponieważ każdy typ neuronu węchowego jest związany z określonym zestawem zapachów, zróżnicowanie neuronów receptorów węchowych (ORN) jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania układu węchowego7.
Genetyka Drosophila umożliwia nam przeprowadzenie badań na poziomie pojedynczej komórki, obejmujących mechanizmy molekularne związane z rozwojem ORN i funkcją fizjologiczną 8-16. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca czułków Drosophila umożliwiło nam bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w dywersyfikację neuronów receptorów węchowych (ORN)7. W tym miejscu przedstawiamy wyczerpujący opis prostej metody, aby to osiągnąć.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop preparacyjny Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr>Badania rozwojowe<td>anty-ELAV Szczur</td><td>Hybridoma Bank</td><td>7E8A10</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Mysz anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Osioł IgG</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Osioł Anty-Szczurzy IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr></tbody></table>

znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie drosophila

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Cząsteczki odorantu wiążą się ze swoimi docelowymi receptorami w precyzyjny i skoordynowany sposób. Każdy receptor rozpoznaje określony sygnał i przekazuje tę informację do mózgu. W związku z tym określenie, w jaki sposób informacje węchowe są przekazywane do mózgu, modyfikując zarówno percepcję, jak i zachowanie, zasługuje na badania. Co ciekawe, pojawiają się dowody na to, że transdukcja komórkowa i czynniki transkrypcyjne są zaangażowane w różnicowanie neuronu receptora węchowego. Tutaj zapewniamy solidną metodę znakowania immunologicznego całej góry do oznaczania organizacji neuronów receptora węchowego in vivo. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy wszystkie neurony receptorów węchowych z przeciwciałem anty-ELAV, znanym markerem pan-neuronalnym i Or49a-mCD8::GFP, neuronem receptora węchowego specyficznie wyrażanym w neuronie Nba za pomocą przeciwciała anty-GFP.

Kluczowym czynnikiem warunkującym powodzenie niniejszego protokołu jest zapewnienie szybkiego przeprowadzenia zarówno sekcji, jak i fiksacji. Równie istotne jest użycie precyzyjnych nożyczek i pęset. Po immunobarwieniu anteny znakowane fluorescencyjnie badano pod mikroskopem konfokalnym. Zazwyczaj wykonujemy przekroje o grubości 1µm przy użyciu obiektywu 20x. Znakowaliśmy neurony receptorowe węchowe (ORNs) typu Nba7 za pomocą Or49a-mCD8::GFP i liczyliśmy liczbę ORNs Nba w antenach typu dzikiego. Reporter mCD8-...

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wizualizacja neuronów receptorowych węchu za pomocą barwienia całych preparations anten. Najpierw znieczul muchę, aby przeciąć jej głowę w płaszczyźnie pionowej. Następnie umieść wypreparowaną głowę muchy na płytce z agarosem.Następnie odciąć trzeci segment anteny i umieścić go w szalku hodowlanym z szklanym dnem w celu przeprowadzenia immunohistochemii. Po zamocowaniu anten na szkiełku przedmiotowym można zwizualizować różne typy neuronów receptorowych węchu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pracujemy nad układem węchowym.Układ węchowy służy do rozróżniania ogromnej liczby różnych cząsteczek. Szeroki zakres odrębnych neuronów węchowych występujących w tym systemie umożliwia precyzyjne i skoordynowane przesyłanie informacji z receptorów docelowych do neuronów w mózgu. Dzisiaj opiszemy metodę barwienia całych czułków w celu wykrycia zróżnicowania tych neuronów receptorowych węchowych.Aby zapewnić pomyślne barwienie całego preparatu oraz czułków, kluczowe jest przygotowanie świeżej partii utrwalacza bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu. Znieczul muchę, a następnie wykonaj pionowe cięcie głowy, trzymając ciało owada pęsetą. Następnie os

whole-mount-immunolabeling-olfactory-receptor-neurons-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Całkowite mikroskopowe znamiennictwo immunologiczne neuronów receptorowych węchowych na czułku Drosophila

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj technikę immunohistochemii całego preparatu do wizualizacji neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila. Ta metoda pozwala badać mechanizmy molekularne różnicowania się neuronów węchowych.

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Przeglądaj więcej filmów