Name: Helisowa organizacja czynnika krzepnięcia krwi VIII na nanorurkach lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę krioelektronowej mikroskopii do badania struktury czynnika VIII krzepnięcia krwi zorganizowanego helikalnie na nanorurkach lipidowych. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazów błonowych kompleksów białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant National Scientist Development od American Heart Association: 10SDG3500034 i UTMB-NCB na start fundusze dla SSM. Autorzy dziękują Cryo-EM i Scientific Computing w Sealy Center for Structural Biology na UTMB (<a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a>), a także dr Steve'owi Ludtke i Edowi Egelmanowi za pomoc w algorytmach rekonstrukcji spiralnej 2D i 3D.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wymienić bufor ludzki FVIII-BDD14 i świński FVIII-BDD15 z buforem HBS-Ca (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7,4) i zagęścić do 1,2 mg/ml. Utrzymać roztwór białkowy w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotować nanorurki lipidowe (LNT), mieszając galaktozyloceramid (GC) i fosfatydyloserynę (PS) w stosunku 1:4 w/w w chloroformie. Odparować chloroform pod argonem i rozpuścić lipidy w buforze HBS do 1 mg/ml. Roztwór LNT należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Mikroskopia krioelektronowa FVIII-LNT
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki Cryo-EM
	<ol>
		<li>Rozładować żar na miedzianych siatkach Quantifoil R2/2 o siatce 300 (stroną węglową do góry) w mieszaninie gazuO2 iH2 przez 10 sekund przy 50 W.</li>
		<li>Wymieszać roztwory FVIII i LNT w buforze HBS-Ca w stosunku 1:1 w/w i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nanieś kroplę 2,5 μl próbki FVIII-LNT na siatkę hydrofilowej mikroskopii elektronowej w komorze nawilżanej Vitrobot Mark IV (wilgotność 100%).</li>
		<li>Osuszyć i błyskawicznie zamrozić siatkę (jedna plama na 3,5 sekundy, siła klesa 1) w cieczy C2H6, schłodzonej cieczą N2 w celu uzyskania amorficznego lodu.</li>
		<li>Kratki należy przechowywać w pojemnikach do przechowywania pod cieczą N2 (LN2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych Cryo-EM 
	UWAGA: JEM2100-LaB6 (rok 2010) wyposażony jest w system operacyjny TEMCON składający się z komputera podłączonego do mikroskopu elektronowego, ekranu z okienkami odczytującymi system próżniowy, system oświetlenia, HT, prądy soczewek i tak dalej oraz dwa panele: LEWY i PRAWY, umieszczone po obu stronach kolumny. Pokrętła X i Y BEAM SHIFT (SHIFT Y, SIFT Y) oraz pokrętła wielofunkcyjne (DEF/STIG) znajdują się na obu panelach. Na LEWYM panelu znajduje się pokrętło podświetlenia (BRIGTHNESS). Na PRAWYM panelu znajdują się: pokrętła powiększenia (MAG/CAM LENGTH) i ostrości (FOCUS) oraz trzy przyciski trybów obrazowania (MAG1, MAG2, LOWMAG) i dyfrakcji (DIFF). Nasze dane pozyskujemy w MAG1 w alfa 2. Minimalne warunki oświetlenia dawki (MDS) wymagane do akwizycji danych Cryo-EM są ustawiane za pomocą przycisków od F1 do F6, w górnym rzędzie na PRAWYM panelu. W tym protokole używane są ustawienia ogólne: F1 - podnieś/opuść ekran, F2 - tryb WYSZUKIWANIA, F3 - tryb FOCUS, F4 - tryb PHOTO, F5 - MDS OFF/ON i F6 - BEAM BLANK, służące do ochrony próbki przed uszkodzeniem przez promieniowanie poprzez odchylenie wiązki.
	<ol>
		<li>Umieść uchwyt kriograficzny w kriostacji i napełnij Dewara uchwytu i kriostacji LN2. Gdy temperatura osiągnie -192 °C, otwórz przesłonę na końcówce uchwytu, umieść wcześniej zamrożoną siatkę Cryo-EM w wyznaczonym miejscu i zabezpiecz za pomocą pierścienia clamp.</li>
		<li>Włóż kriouchwyt do mikroskopu elektronowego. Napełnij Dewara w uchwycie kriogenicznym i komorze antyzanieczyszczającej LN2. Poczekaj, aż uchwyt się ustabilizuje przez 30-60 minut. Naciśnij F6 i włącz filament. Gdy żarnik jest nasycony, naciśnij F6 i otwórz migawkę na uchwycie, aby view siatka.</li>
		<li>Naciśnij Low Mag/alpha 1 (ustawiony na 200X mag) i zlokalizuj obszary z cienkim lodem na siatce.</li>
		<li>Przełącz się na MAG 1/alpha 2, aby ustawić tryb dawki minimalnej (MDS) i uzyskać dane Cryo-EM przy niskich dawkach elektronów, bez uszkadzania próbki.
		<ol>
			<li>Naciśnij F2, aby ustawić tryb wyszukiwania. Ustaw powiększenie na 40 000x. Powiększ wiązkę za pomocą pokrętła BRIGTNESS do minimalnej dawki elektronów ~ 0,04 e-/Å2·s. Naciśnij DIFF, aby przejść do trybu dyfrakcji. Ustaw długość kamery na 120 cm za pomocą pokrętła MAG/CAM LENGHT. Zlokalizuj obszary na siatce w obrębie wstępnie wybranych obszarów w LOWMAG, które mają nanorurki lipidowe w otworach filmu węglowego.</li>
			<li>Naciśnij F4, aby ustawić tryb fotograficzny na powiększenie 40 000X i ustawić podświetlenie za pomocą pokrętła BRIGHTNESS na dawki 16-25 e-/Å2·s. Naciśnij przycisk Standard Focus, aby ustawić warunki ostrości, dostosowując wysokość Z preparatu za pomocą przycisków Z GÓRA/DÓŁ (PRAWY panel sterowania). Ustaw rozmycie w zakresie od -1,5 do -2,5 μm.</li>
			<li>Wyrównaj tryby SZUKAJ i ZDJĘCIE, rysując kwadrat w oknie LIVE VIEW na monitorze aparatu cyfrowego w trybie SZUKAJ, odpowiadający obszarowi, który ma być sfotografowany w trybie PHOTO.</li>
			<li>Naciśnij F3, aby ustawić tryb ostrości na powiększenie 100 000x. Oświetlenie ostrości w celu pokrycia układu CCD (promień ~4 - 5 cm) i poza osią, aby nie naświetlać obszaru, który ma być obrazowany w trybie PHOTO. Ustaw rozmycie na ~ -1.5 i -2.5 μm za pomocą pokrętła FOCUS i skoryguj astygmatyzm obrazu za pomocą pokręteł DEF/STIG.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz FVIII-LNT, który ma być obrazowany w trybie SZUKAJ, pobierając obrazy na żywo w oknie LIVE VIEW na monitorze aparatu cyfrowego. Wyśrodkuj FVIII-LNT w kwadracie narysowanym w oknie LIVE VIEW.</li>
		<li>Nagraj obraz cyfrowy na kamerze CCD przy efektywnym powiększeniu 52 000x i naświetlaniu 0,5 sekundy, przełączając się w tryb Zdjęcie i klikając przycisk ACQUIRE na monitorze cyfrowej kamery mikrograficznej. Warunki akwizycji obrazu są ustawiane, takie jak ślepa wiązka światła (SHUTTERS) otwarta tylko wtedy, gdy obraz jest rejestrowany w trybie PHOTO.</li>
		<li>Sprawdź jakość i rozmycie uzyskanego obrazu, naciskając CTRL-F, aby uzyskać szybką transformację Fouriera (FFT).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 3D Rekonstrukcja
UWAGA: Oprogramowanie do analizy obrazów używane do analizy 2D i 3D: EMAN2 i IHRSR są dostępne bezpłatnie. EMAN2 można pobrać ze strony http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Oprogramowanie IHRSR można pobrać u profesora Egelmana: egelman@virginia.edu. Ostatnie udoskonalenia IHRSR są uruchamiane w klastrze centrum zaawansowanych obliczeń w Teksasie: http://www.tacc.utexas.edu/ na Uniwersytecie Teksańskim w Austin. Algorytm rekonstrukcji 3D pokazany na rysunku 1 składa się z dwóch głównych kroków: po pierwsze, wybór jednorodnego zestawu segmentów spiralnych (cząstek) za pomocą algorytmów 2D wyrównania bez odniesienia (RFA) zaimplementowanych w EMAN 2, po drugie, uzyskanie rekonstrukcji 3D na podstawie parametrów spiralnych i algorytmów projekcji wstecznej włączonych do IHRSR. W pierwszym kroku wykorzystywane są programy opracowane do wyboru jednorodnych zestawów cząstek do rekonstrukcji 3D za pomocą algorytmów SPA dla pojedynczych cząstek, dla których EMAN2 został specjalnie opracowany i rozpowszechniony: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Ten krok został dostosowany do danych Cryo-EM. Drugi krok osiąga się za pomocą algorytmu IHRSR, który jest specjalnie zaprojektowany dla typu zespołów śrubowych otrzymanych z rekombinowanymi formami czynnika VIII. Algorytm ten został obszernie udokumentowany w literaturze naukowej12.
<ol>
	<li>Wykonaj analizę obrazu 2D za pomocą pakietu do naukowego przetwarzania obrazów EMAN2: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html16, aby wybrać zestawy jednorodnych cząstek (segmentów spiralnych) do rekonstrukcji śrubowej.
	<ol>
		<li>Wybierz mikrofotografie Cryo-EM z prostymi i dobrze zorganizowanymi rurkami spiralnymi za pomocą oprogramowania aparatu cyfrowego i narzędzi do wizualizacji.</li>
		<li>Odwracanie, normalizacja i filtrowanie pikseli rentgenowskich w graficznym interfejsie użytkownika e2workflow.py, opcja rekonstrukcji pojedynczych cząstek (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager</li>
		<li>Zaimportuj obrazy odwrócone, znormalizowane i przefiltrowane przez piksele rentgenowskie w graficznym interfejsie użytkownika e2helixboxer.py. Wybierz rurki spiralne FVIII-LNT i segmentuj je w rozdzielczości 256 x 256 pikseli (2,9 A/pix) z 90% nakładaniem za pomocą: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer</li>
		<li>Oceń rozmycie na podstawie oryginalnych mikrofotografii i zastosuj korekcję funkcji transferu kontrastu (CTF) (tylko korekcja fazy) do segmentów spiralnych z tych samych mikrofotografii z opcją e2ctf.py włączoną w e2workflow.py: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.</li>
		<li>Generuj początkowe zestawy cząstek (odcinków spiralnych) w e2workflow.py GUI - opcja SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.</li>
		<li>Oblicz średnie klas 2D za pomocą algorytmu e2refine2d.py, stosując klasyfikację k-średnich bez odniesienia, aby wybrać jednorodne zestawy danych o tej samej średnicy LNT i stopniu porządku spiralnego (Rysunek 2), postępując zgodnie ze skryptem: 'e2refine2d.py --iter=8 --naliref=5 --nbasisfp=8 --path=r2d_001 --input=INPUT.hdf --ncls=51 --simcmp=kropka --simalign=rotate_translate_flip --classaligncmp=kropka --classraligncmp=faza --classiter=2 --classkeep=0.8 --classnormproc=normalizować. edgemean --classaverager=mean --normproj –classkeepsig', odpowiednio zmieniając wartość ncls.
		<ol>
			<li>Klasyfikuj początkowy zestaw danych w 150 klasach 'ncls=151' w 8 iteracjach za pomocą 'classkeep=0.8', co oznacza, że cząstki o mniej niż 80% podobieństwie do średniej klasy są wykluczone z danej klasy. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d</li>
			<li>Połącz cząstki ze średnich klas z wyraźną dyfrakcją spiralną w e2display.py aby utworzyć pośredni zestaw danych.</li>
			<li>Sklasyfikuj pośredni zestaw danych w 50 klasach 'ncls=51', aby rozróżnić klasy o tej samej średnicy i stopniu uporządkowania.</li>
			<li>Połącz cząstki z klas o tej samej średnicy i stopniu uporządkowania w e2display.py, aby utworzyć ostateczny zestaw danych do rekonstrukcji trójwymiarowej: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj rekonstrukcję śrubową za pomocą algorytmu Iteracyjnej rekonstrukcji helisalnej przestrzeni rzeczywistej (IHRSR), zgodnie z opisem w Egelman17,18.
	<ol>
		<li>Oszacuj wzrost, Δz (A) helisy FVIII-LNT z połączonej transformaty Fouriera cząstek w końcowym zbiorze danych.</li>
		<li>Zdefiniuj kąt azymutalny ΔΦ (º), wykonując równoległe zagęszczenia IHRSR ze stałym Δz, zwiększając ΔΦ od 5° do 60° w krokach co 5°.</li>
		<li>Przeprowadzić 100 kolejnych cykli IHRSR dla każdego końcowego zestawu danych z cylindrem bez cech charakterystycznych jako objętością początkową i początkowymi parametrami spiralnymi Δz i ΔΦ, jak określono w ppkt 3.2.1 i 3.2.2.</li>
		<li>Sprawdzić końcowe objętości pod kątem zbieżności parametrów spiralnych i zgodności między średnimi klas z klasyfikacji 2D końcowego zestawu danych a prognozami z końcowej rekonstrukcji IHRSR.</li>
		<li>Nałóż symetrię do końcowych rekonstrukcji 3D, odpowiadającą asymetrycznemu rozkładowi jednostek obserwowanemu w końcowych asymetrycznych objętościach 3D: 4-krotnie dla ludzkiego FVIII-LNT i 5-krotnie dla FVIII-LNT świni. Uruchom kolejne 100 cykli udoskonalania, aby wygenerować ostateczną symetryczną rekonstrukcję 3D.</li>
		<li>Oblicz krzywą korelacji powłoki Fouriera dla obu objętości, rozdzielając najpierw odpowiedni zestaw danych na parzyste i nieparzyste: 'e2proc2d.py <infile> <outfile> --split=2'. Następnie uruchom 100 kolejnych uściśleń IHRSR zgodnie z opisem w 3.2.3. Oblicz FSC woluminów 3D utworzonych ze zbiorów danych parzystych i nieparzystych: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt --calcfsc=oddmap.mrc'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja i segmentacja woluminów FVIII-LNT w chimerze UCSF.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Otwórz ostatnie woluminy z kroku 3.2.5. w UCSF Chimera i ustaw poziom konturu na 0,005 w opcji NARZĘDZIA > DANE WOLUMINU > PRZEGLĄDARKA WOLUMINÓW.</li>
		<li>W NARZĘDZIACH > DANE WOLUMINU > MAPIE SEGMENTÓW wybierz objętość w zakładce MAPA SEGMENTÓW i kliknij SEGMENT, aby podzielić objętość na segmenty.</li>
		<li>Grupuj segmenty odpowiadające jednej komórce jednostkowej, zaznaczając za pomocą CTRL+SHIFT i klikając przycisk grupa.</li>
		<li>Pokoloruj segmenty według komórki jednostkowej i helisy za pomocą opcji ACTIONS > COLOR, aby podkreślić cechy konstrukcyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Tomografia elektronowa
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki FVIII-LNT barwionej ujemnie
	<ol>
		<li>Przygotować próbki FVIII-LNT jak do eksperymentów Cryo-EM.</li>
		<li>Żarzenie wyładowuje powlekaną węglem miedzianą siatkę o oczkach 300 (stroną węglową do góry) w mieszaninie gazuO2 iH2 przez 10 sekund przy 50 W, jak w przypadku eksperymentów Cryo-EM.</li>
		<li>Nanieś kroplę 2,5 μl zawiesiny FVIII-LNT z nanocząstkami złota koloidalnego 6 nm na siatkę, osusz nadmiar płynu i zabarwij ujemnie poprzez nałożenie 5 μl 1% roztworu octanu uranylu na 2 min. Zetrzyj nadmiar płynu i wysusz siatkę na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych z tomografii elektronowej
	<ol>
		<li>Przenieś siatkę do pojedynczego uchwytu przechyłu.</li>
		<li>Przenieś uchwyt do mikroskopu elektronowego.</li>
		<li>Automatyczne zbieranie serii pochylenia za pomocą oprogramowania SerialEM19 w krokach co 2° w zakresie kątowym od -60° do +60° i rejestrowanie obrazów za pomocą kamery CCD przy efektywnym powiększeniu 52 000x, rozogniskowaniu od -6 do -10 μm i dawce elektronów 150 - 170 elektronów/2·s na tomogram.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja tomografii elektronowej FVIII-LNT 
	Uwaga: Zrekonstruuj serie pochylonych pFVIII-LNT i hFVIII-LNT uzyskane w 4.2. z opcją ETomo w oprogramowaniu IMOD zgodnie z samouczkiem: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
	<ol>
		<li>Korzystając z okna terminala, otwórz tomogram w 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.</li>
		<li>Podziel tomogram na 4 za pomocą polecenia IMOD BINVOL, aby zmniejszyć rozmiar tomogramu.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni kąt, aby obrócić nanorurkę lipidową wzdłuż osi Y w tomogramie z pojemnikiem za pomocą polecenia IMOD ROTATEVOL.</li>
		<li>Obróć pełny tomogram za pomocą polecenia IMOD ROTATEVOL.</li>
		<li>Przytnij wybraną nanorurkę lipidową zorientowaną wzdłuż osi Y za pomocą polecenia IMOD CLIP RESIZE.</li>
		<li>Otwórz przycięty sub-tomogram za pomocą 3DMOD.</li>
		<li>Kliknij na tomogram, aby zobrazować ułożenie cząsteczek czynnika VIII wzdłuż wycinków w osi Z i wzdłuż osi Y w objętości subtomogramu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li>
<li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li>
<li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li>
<li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+hematology%22%5BJournal%5D)">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li>
<li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophilia%3A+new+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+%2F+the+Education+Program+of+the+American+Society+of+Hematology.+American+Society+of+Hematology.+Education+Program%22%5BJournal%5D)">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li>
<li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li>
<li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li>
<li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li>
<li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li>
<li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician%27s+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li>
<li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+%28N8%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li>
<li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII%3A+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego i można się z nimi bezpośrednio skontaktować w sprawie każdej z procedur opublikowanych w niniejszym manuskrypcie.

W niniejszej pracy przedstawiono metodologię rozróżniania między dwiema organizacjami związanymi z błoną wysoce homologicznych białek: ludzkimi i świńskimi FVIII samoorganizującymi się na nanorurkach lipidowych w warunkach występujących w organizmie człowieka.

W opisanej procedurze FVIII człowieka i świni są z powodzeniem zorganizowane spiralnie na nanorurkach lipidowych, co jest najbardziej krytycznym krokiem. Kolejnym krytycznym krokiem jest zachowanie próbki w c...

Czynnik krzepnięcia krwi VIII (FVIII) to duża glikoproteina składająca się z 2 332 aminokwasów zorganizowanych w sześć domen: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Po aktywacji trombiny FVIII działa jako kofaktor czynnika IXa w kompleksie tenazy związanym z błoną. Wiązanie aktywowanego FVIII (FVIIIa) z FIXa w sposób zależny od błony zwiększa wydajność proteolityczną FIXa ponad 105 razy, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnej krzepliwości krwi4. Pomimo ważnej roli, jaką FVIII odgrywa w krzepnięciu i tworzeniu kompleksu tenazy, funkcjonalna struktura FVIII związana z błoną nie została jeszcze rozwiązana.
Aby rozwiązać ten problem, opracowano pojedyncze dwuwarstwowe nanorurki lipidowe (LNT) bogate w fosfatydyloserynę (PS), zdolne do wiązania FVIII o wysokim powinowactwie 8,9 i przypominające aktywowaną powierzchnię płytek krwi10. Udowodniono, że konsekwentna spiralna organizacja FVIII związanego z LNT jest skuteczna w określaniu struktury stanu związanego z błoną FVIII za pomocą Cryo-EM5. Funkcjonalizowane LNT są idealnym systemem do badania oddziaływań białko-białko i białko-błona spiralnie zorganizowanych białek związanych z błoną przez Cryo-EM11,12. Cryo-EM ma przewagę nad tradycyjnymi metodami strukturalnymi, takimi jak krystalografia rentgenowska i NMR, ponieważ próbka jest przechowywana w środowisku najbliższym fizjologicznym (bufor, membrana, pH), bez dodatków i izotopów. W przypadku FVIII, badanie struktury związanej z błoną za pomocą tej techniki jest jeszcze bardziej istotne fizjologicznie, ponieważ LNT jest bardzo podobny pod względem wielkości, kształtu i składu do pseudopodiów aktywowanych płytek krwi, w których kompleksy Tenazy gromadzą się in vivo.
Wady i niedobór FVIII powodują hemofilię A, poważne zaburzenie krzepnięcia krwi dotykające 1 na 5 000 mężczyzn w populacji ludzkiej 4,6. Najskuteczniejszą terapią hemofilii A jest dożywotnie podawanie rekombinowanego ludzkiego FVIII (hFVIII). Znaczącym powikłaniem terapii rekombinowanej hemofilii A FVIII jest rozwój przeciwciał hamujących przeciwko postaci ludzkiej, które dotykają około 30% pacjentów z hemofilią A13. W tym przypadku stosuje się koncentrat FVIII (pFVIII) ze świni, ponieważ FVIII świni wykazuje niską reaktywność krzyżową z przeciwciałami hamującymi przeciwko ludzkiemu FVIII i tworzy funkcjonalne kompleksy z ludzkim FIXa7. Ustalenie organizacji błonowej zarówno świńskich, jak i ludzkich form FVIII jest ważne dla zrozumienia strukturalnych podstaw funkcji kofaktora FVIII i implikacji dla hemostazy krwi.
W tym badaniu opisujemy kombinację nanotechnologii lipidowej, Cryo-EM i analizy struktury, mającą na celu rozwiązanie związanej z błoną organizacji dwóch wysoce homologicznych form FVIII. Przedstawione dane Cryo-EM oraz struktury 3D dla spiralnie zorganizowanego FVIII świń i ludzi na ujemnie naładowanym LNT pokazują potencjał proponowanej nanotechnologii jako podstawy do wyznaczania struktury FVIII oraz czynników krzepnięcia i kompleksów związanych z błoną w fizjologicznym środowisku błonowym.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 z LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>pracujący na napięciu 200 kV</td></tr><tr><td>z oprogramowaniem TEMCON</td><td>JEOL Sp. z o.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Uchwyt kriogeniczny</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>schłodzony do -175 &deg; C</td></tr><tr><td>z regulatorem temperatury</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4,096 x 4,096 pikseli przy 15 &mu; Rozdzielczość fizyczna m/piksel</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa Solarus Model 950</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana 3 mm z powłoką węglową 300 mm</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>czyszczona plazmowo przez 10 sekund na dużej mocy</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 mesh</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Siatki Cu powlekane węglem 300 mesh z otworami o średnicy 2 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Octan uranylu dwuwodny</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>1% roztwór, filtrowany</td></tr><tr><td>ceramid galaktozylu</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoilo-sn-glicero-fosfo-L-seryna</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>Oprogramowanie EM Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM oprogramowanie EMAN</td><td>do pobrania</td><td></td> za darmo<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM software Spider</td><td>do pobrania</td><td></td> za darmo<td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM software IHRSR</td><td>do pobrania</td><td></td> za darmo <td>Programy dostępne od Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>EM software (IMOD)</td><td>do pobrania</td> <td>za darmo</td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM software (SerialEM)</td><td>do pobrania</td><td></td> za darmo<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>do pobrania</td><td></td> za darmo<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

helisowa organizacja czynnika krzepnięcia krwi viii na nanorurkach lipidowych

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Mikroskopia krioelektronowa (Cryo-EM)1 to potężne podejście do badania struktury funkcjonalnej białek i kompleksów w stanie uwodnionym i środowisku błonowym2.
Czynnik krzepnięcia VIII (FVIII)3 to wielodomenowa glikoproteina osocza krwi. Wada lub niedobór FVIII jest przyczyną hemofilii typu A - ciężkiego zaburzenia krzepnięcia. Po aktywacji proteolitycznej FVIII wiąże się z proteazą serynową czynnikiem IXa na ujemnie naładowanej błonie płytek krwi, co ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego krzepnięcia krwi4. Pomimo kluczowej roli, jaką FVIII odgrywa w krzepnięciu, informacje strukturalne dotyczące jego stanu związanego z błoną są niekompletne5. Rekombinowany koncentrat FVIII jest najskuteczniejszym lekiem przeciwko hemofilii typu A, a dostępny w handlu FVIII może być wyrażany jako człowiek lub świnia, oba tworzące funkcjonalne kompleksy z ludzkim czynnikiem IXa6,7.
W tym badaniu prezentujemy kombinację mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM), nanotechnologii lipidów i analizy struktury zastosowanej do rozwiązania struktury związanej z błoną dwóch wysoce homologicznych form FVIII: ludzkiej i świńskiej. Opisano metodologię opracowaną w naszym laboratorium w celu spiralnego uporządkowania dwóch funkcjonalnych rekombinowanych form FVIII na ujemnie naładowanych nanorurkach lipidowych (LNT). Reprezentatywne wyniki pokazują, że nasze podejście jest wystarczająco czułe, aby zdefiniować różnice w organizacji helisowej między dwoma wysoce homologicznymi w sekwencji (86% identyczności sekwencji) białkami. Podano szczegółowe protokoły dotyczące organizacji spiralnej, krio-EM i pozyskiwania danych tomografii elektronowej (ET). Omówiono dwuwymiarową (2D) i trójwymiarową (3D) analizę struktury zastosowaną do uzyskania rekonstrukcji 3D FVIII-LNT człowieka i świni. Przedstawione struktury FVIII-LNT u ludzi i świń wskazują na potencjał proponowanej metodyki do obliczania funkcjonalnej, związanej z błoną organizacji czynnika krzepnięcia krwi VIII w wysokiej rozdzielczości.

Rekombinowany ludzki i świński FVIII zostały pomyślnie zorganizowane helikalnie na ujemnie naładowanej pojedynczej dwuwarstwie LNT, przypominającej powierzchnię aktywowanej płytki krwi. Helikalna organizacja ludzkiego i świńskiego FVIII-LNT była spójna na zebranych mikrografiach cyfrowych (Rysunek&#160;2). &#160;Kontrolne LNT oraz helikalne rurki ludzkiego i świńskiego FVIII-LNT zostały wybrane i segmentowane za pomocą interfejsu GUI e2helixboxer.py, a wstępne zestawy danych utworzono za...

Prezentujemy kombinację mikroskopii krioelektronowej, nanotechnologii lipidowej i analizy struktury zastosowanej do rozdzielenia struktury związanej z błoną dwóch wysoce homologicznych form FVIII: ludzkiej i świńskiej. Opisano metodologię opracowaną w naszym laboratorium w celu spiralnego uporządkowania dwóch funkcjonalnych rekombinowanych form FVIII na ujemnie naładowanych nanorurkach lipidowych (LNT).

Helisowa organizacja czynnika krzepnięcia krwi VIII na nanorurkach lipidowych

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można określić strukturę heli czynnika VIII zorganizowanego na nanorurkach lipidowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez najpierw zorganizowanie spiralnego oczyszczonego czynnika VIII na nanorurkach lipidowych i zebranie danych z mikroskopii krioelektronowej w temperaturze ciekłego azotu i niskich dawkach elektronów. Następnie obliczana jest struktura związana z błoną czynnika VIII, łącząc pojedyncze cząstki i algorytmy rekonstrukcji spiralnej 3D.Następnie zbierane są dane z tomografii elektronowej i generowana jest rekonstrukcja 3D. Ostatecznie obliczone struktury nanorurek lipidowych czynnika VIII są weryfikowane poprzez segmentację objętości 3D i porównanie ich z rekonstrukcjami tomografii. Zaprezentowana metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej i krzepnięcia krwi, takie jak to, jaka jest organizacja czynnika VIII związana z błoną i jak odnosi się do jego funkcji w krzepnięciu.Szóstka laboratoryjna GM 2100 jest wyposażona w system operacyjny TE con składający się z komputera podłączonego do mikroskopu elektronowego. Ekran z okienkami odczytującymi syste

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Heliczna organizacja czynnika krzepnięcia krwi VIII na nanorurach lipidowych

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Procedura nawleczenia ran kłutych w celu tworzenia hemostatycznej skrzepliny jest przedstawiona tutaj. Powstałe skrzepliny są duże i mają średnicę setek mikronów. W związku z tym odpowiednie są podejścia do obrazowania objętościowego. Sugerujemy zmontowaną transmisyjną mikroskopię elektronową o dużym obszarze jako podejście o wysokiej rozdzielczości dostępne dla wielu osób i szczegółowo opisując protokół przygotowawczy.

Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę krioelektronowej mikroskopii do badania struktury czynnika VIII krzepnięcia krwi zorganizowanego helikalnie na nanorurkach lipidowych. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazów błonowych kompleksów białkowych.

Helisowa organizacja czynnika krzepnięcia krwi VIII na nanorurkach lipidowych

Przeglądaj więcej filmów