Name: In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania polirybosomów do badania translatomii tkanki ośrodkowego układu nerwowego in vivo. Technika ta umożliwia izolację RNA związanego z rybosomami z małych ilości materiału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF), Biologię Systemów Sygnalizacji w Raku (Helmholtz Alliance on Systems Biology) oraz Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi DKFZ. 
Przestroga: Aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek RNAza, należy podjąć podstawowe środki ostrożności w celu uniknięcia zanieczyszczenia RNAzy i przygotować wszystkie wodą uzdatnioną DEPC.
1. Przygotowanie gradientów sacharozy
<ol>
	<li>Przygotować 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 i 50% roztwory sacharozy (patrz Tabela 1). Przygotowanie gradientów należy rozpocząć od powolnego dodawania 2 ml 50% roztworu sacharozy na dno probówki ultrawirówki z poliallomeru. Zamrozić warstwę, umieszczając probówki na 20 minut w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodawać kolejne warstwy przy malejącej zawartości sacharozy z etapami zamrażania pomiędzy nimi, kończąc na 17,5% sacharozy. Podczas dodawania roztworów sacharozy należy utrzymywać gradienty na lodzie, aby zapobiec rozmrażaniu warstw znajdujących się pod spodem.</li>
	<li>Gradienty sacharozy należy przygotować na świeżo na dzień przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, należy przygotować gradienty z wyprzedzeniem, przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze 4 °C w noc poprzedzającą eksperyment.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek (rdzeń kręgowy i/lub mózg)
<ol>
	<li>Znieczulić mysz przez przedawkowanie ksylazyny i ketaminy w NaCl i perfuzję przezsercową 20 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 200 μg / ml CHX, który unieruchamia rybosomy na powiązanych transkryptach. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na szczypanie palców u stóp.</li>
	<li>Szybko wyodrębnij tkankę. Otwórz czaszkę grzbietowo i wyekstrahuj mózg. Wykonaj laminektomię całego kręgosłupa piersiowego i lędźwiowego i usuń rdzeń kręgowy. Użyj odpowiednio całego mózgu (~400 mg) lub 4-centymetrowego kawałka rdzenia kręgowego (~90 mg).</li>
	<li>Przenieść tkankę do lodowatego buforu homogenizacyjnego A (patrz Tabela 1) (rdzeń kręgowy: 1 ml; mózg: 4 ml) i pokroić w małe kawałki czystym skalpelem, aby umożliwić zwiększony wychwyt cykloheksymidu. Wszystkie dalsze kroki wykonuj na lodzie.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut i homogenizować tkankę mechanicznie za pomocą homogenizatora Dounce. Starannie kontrolowana homogenizacja jest konieczna, aby zapewnić, że jądra pozostaną nienaruszone. Traktuj wszystkie próbki dokładnie w ten sam sposób, aby zapewnić porównywalność. Uwaga: dla tkanki mózgowej: Rozbij tkankę przez 5 pociągnięć ciasno dopasowanym tłuczkiem. W przypadku tkanki rdzenia kręgowego: przeciąć przez 5 uderzeń luźno dopasowanym tłuczkiem, a następnie 5 kolejnych uderzeń ciasno dopasowanym tłuczkiem.</li>
	<li>Weź podwielokrotności (400 μl dla mózgu i 200 μl dla rdzenia kręgowego), błyskawicznie zamroź i przechowuj w temperaturze -80 °C w celu całkowitej izolacji RNA.</li>
	<li>Usunąć jądra i nienaruszone fragmenty komórek i tkanek przez odwirowanie przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Wirowanie z niską prędkością zapobiega utracie rybosomów.</li>
	<li>Lizować fragmenty błony w supernatance wolnej od jąder przez 30 minut, dodając detergenty NP-40 i deoksycholanu sodu (każdy do końcowego stężenia 1%).</li>
</ol>
3. Flotacja mieliny
<ol>
	<li>Ten etap usuwa z próbki składniki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zamaskowałyby sygnał w profilu polirybosomu. Najpierw należy wstępnie schłodzić wiadra ultrawirówki i wirnik w temperaturze 4 °C i przygotować 2 M, 1,1 M i 0,9 M roztwory sacharozy (patrz tabela 1).</li>
	<li>Wymieszać lizat z 1,22 objętości 2 M roztworu sacharozy i przenieść do probówki z ultrawirówki polietylenowej. Napełnić wszystkie probówki do równej objętości 10 ml 1,1 M roztworem sacharozy, a następnie ostrożnie nałożyć je na 0,9 M roztwór sacharozy.</li>
	<li>Umieść probówki ultrawirówek we wstępnie schłodzonych wiadrach do ultrawirówek. Wirować przez 3 godziny w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Podczas tego procesu rybosomy osadzają się w osadzie, podczas gdy składniki tłuszczowe unoszą się w górę i pozostają w supernatancie.</li>
</ol>
4. Frakcjonowanie gradientu sacharozy
<ol>
	<li>Usunąć supernatant i rozpuścić osad w buforze homogenizacyjnym B (patrz Tabela 1). Zmierzyć absorbancję przy długości fali 260 nm dla każdej próbki za pomocą urządzenia Nanodrop lub równoważnego urządzenia i znormalizować ilości obciążenia zgodnie z wartością absorbancji.</li>
	<li>Umieść gradienty sacharozy (przygotowanie opisano w poprzednim rozdziale) we wstępnie schłodzonych wiadrach ultrawirówek. Ostrożnie ułóż próbki na wierzchu gradientu. Dodaj jeden pusty gradient sacharozy jako kontrolę techniczną.</li>
	<li>Dostosuj wagę każdego wiadra za pomocą bufora homogenizacyjnego. Odwirowywać próbki przez 1,5 godziny w temperaturze 285 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotowanie frakcjonatora Isco należy rozpocząć na 30 minut przed końcem wirowania. Jeśli używany jest inny model frakcjonatora, postępuj zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Ustaw odpowiednią czułość (0,2 AUFS dla mózgu lub 0,05 AUFS dla rdzenia kręgowego) dla lampy UV i włącz ją w celu rozgrzania. Zamontuj przekłuwacz do rurek, podłącz go za pomocą pompy walcowej do 60% roztworu sacharozy przez przebijak do rurki.</li>
		<li>Przetestuj konfigurację, pompując sacharozę (natężenie przepływu: 1 ml/min), w szczególności upewnij się, że nie ma wycieków w rurkach, które wprowadzą pęcherzyki do gradientu.</li>
		<li>Absorpcja ślepego tła poprzez ręczne pompowanie bufora gradientu do detektora UV i korygowanie linii bazowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć z wirnika wiadra ultrawirówki zawierające gradienty sacharozy z osadzonymi próbkami i umieścić je na lodzie. Unikaj podbijania gradientów, aby zapobiec utracie rozdzielczości.</li>
	<li>Uruchom gradienty na frakcjonatorze. Najpierw uruchom puste gradienty, aby ocenić absorpcję tła i zapewnić odpowiednią konfigurację techniczną.
	<ol>
		<li>Przymocuj gradient do detektora UV i przebij spód rurki za pomocą przebijacza do rurek. Rozpocznij pompowanie 60% sacharozy, która przemieści gradient z osadzonymi próbkami w górę przez detektor UV i do dozownika kropli.</li>
		<li>Absorbancja przy 260 nm jest udokumentowana w celu wygenerowania profilu absorpcji próbki, z pikami wskazującymi na sedymentację mRNA związanych z podjednostkami rybosomalnymi, monosomami, a następnie rosnącą liczbą rybosomów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy podzielić na 20 frakcji za pomocą dozownika kropli (po 600 μl każda, w probówkach o pojemności 2 ml).</li>
</ol>
5. Izolacja RNA od poszczególnych frakcji
<ol>
	<li>Dodaj 10% SDS do końcowego stężenia 1% do poszczególnych frakcji i dobrze wymieszaj, aby rozwinąć białka i zdysocjować rybosomy. Na tym etapie próbki można zamrozić w temperaturze -80 °C. W zależności od kwestii, którą należy rozwiązać, frakcje można łączyć zgodnie z profilem absorbancji.</li>
	<li>Wyizoluj RNA za pomocą kwaśnej ekstrakcji fenolem/chloroformem, która usuwa również zanieczyszczające ślady DNA.
	<ol>
		<li>Dodać jedną objętość kwaśnego fenolu/chloroformu (podgrzanego do temperatury suchej) do każdej próbki, ogrzewać przez 10 minut w temperaturze 65 °C, a następnie uwolnić ciśnienie pod wyciągiem.</li>
		<li>Odwirować próbki przez 20 minut przy 17 000 x g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Należy pamiętać o odwróceniu faz w gęstszych frakcjach sacharozy, gdzie faza wodna może znajdować się na dnie po odwirowaniu.</li>
		<li>Dodać jedną objętość izopropanolu, 1/9 objętości octanu sodu (pH 5,2) i 1 μl GlycoBlue do każdej próbki w celu wytrącenia RNA. Próbki należy przechowywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut przy 17 000 x g i 4 °C. GlycoBlue zapewnia wizualizację osadu. Usuń supernatant, umyj pelet raz lodowatym 80% etanolem i suchym powietrzem pelletem. Rozpuść osad w wodzie wolnej od RNAzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo ilość RNA za pomocą Nanodrop i przeanalizuj integralność RNA za pomocą chipa Bioanalyzer. RNA, które jest uzyskiwane za pomocą prezentowanego protokołu, nadaje się do wszystkich najnowocześniejszych testów o wysokiej przepustowości, w tym mikromacierzy i głębokiego sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li>
<li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li>
<li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li>
<li>Brittis, P. a, Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a, Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. -J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li>
<li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).</li>
<li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes%3A+postnatal+development+and+experimental+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li>
<li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Chociaż frakcjonowanie polirybosomów nie jest nową techniką, pozostaje szczególnie trudne. W oparciu o materiał wejściowy może być konieczna znaczna optymalizacja. Dotyczy to zwłaszcza próbek OUN in vivo , gdzie często ograniczeniem jest ilość materiału, a składniki tkanki tłuszczowej utrudniają izolację translujących mRNA. Większość opublikowanych protokołów frakcjonowania dotyczy linii komórkowych drożdży lub ssaków, a istnieją ustalone protokoły dla mózgu12,13,14. W przeciwieństwie do tego, nie ma prawie żadnych publikacji opisujących frakcjonowanie rdzenia kręgowego, a poprzednie protokoły wymagały połączenia rdzenia kręgowego od dużej liczby zwierząt15. Z tych powodów wprowadzono kilka istotnych modyfikacji w celu dostosowania protokołu frakcjonowania do tkanek OUN, w tym pojedynczego rdzenia kręgowego myszy. Immobilizacja rybosomów cykloheksymimidem odbywa się podczas perfuzji zwierzęcej, aby uniknąć dysocjacji rybosomów podczas długiego procesu ekstrakcji tkanek. Następnie polisomalne RNA są ekstrahowane w określony sposób, aby zmaksymalizować wydajność polirybosomów. Po pierwsze, kontrolowana homogenizacja tkanki poprzez douncing, utrzymuje jądro w stanie nienaruszonym i zapobiega zanieczyszczeniu DNA. Jądro jest następnie niezawodnie usuwane przez odwirowanie. Połączenie detergentów NP-40 i deoksycholanu sodu zapewnia lizę retikulum endoplazmatycznego i uwalnianie rybosomów związanych z jego błoną. Ponadto składniki pochłaniające promieniowanie UV w mielinie bogatej w lipidy zaciemniają profile polirybosomów. Flotacja mieliny jest zatem konieczna, gdzie gęste związki, takie jak polirybosomy, są granulowane, a lżejsze związki, takie jak mielina, unoszą się i są usuwane16. Polirybosomy są następnie sedymentowane w gradiencie sacharozy od 17,5% do 50%. Zamiast ręcznego nakładania warstw i zamrażania każdej warstwy sacharozy, gradienty można również przygotować za pomocą miksera gradientów. Ekstrakcja RNA z frakcji przy użyciu kwaśnego fenolu/chloroformu pozwala na usunięcie DNA przy minimalnej utracie RNA. Jednak odwrócenie faz może wystąpić przy gęstych frakcjach sacharozy (powyżej frakcji 16).
Protokół ten zapewnia przewagę nad innymi konwencjonalnymi metodami, które dotyczą poziomu tłumaczenia. Na przykład, zarówno pomiar fosforylowanego S6 (wybitny marker translacji), jak i znakowanie powstających łańcuchów radioizotopami dostarczają informacji na temat globalnych poziomów translacji, ale niewiele mówią o tym, co konkretnie jest tłumaczone. Z drugiej strony frakcjonowanie polirybosomów pozwala nie tylko na ocenę globalnej translacji, ale także na tożsamość translujących mRNA i powiązanych białek regulatorowych. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym można przeprowadzić na izolowanych RNA w celu szybkiego odczytu wybranych mRNA, a mikromacierze i sekwencjonowanie RNA nowej generacji można przeprowadzić do badań całego genomu. Przedstawione tutaj optymalizacje pozwalają na stosowanie tej techniki przy minimalnej ilości tkanek OUN, zmniejszając w ten sposób liczbę potrzebnych zwierząt i poprawiając ogólną jakość eksperymentu poprzez skrócenie czasu przetwarzania tkanek. Z drugiej strony technika ta nie jest w stanie odróżnić rybosomów zatrzymanych od translujących. Transkrypty przenoszące zatrzymane rybosomy będą osadzać się w ciężkich frakcjach, o czym należy pamiętać podczas interpretacji danych.
Istnieją ostatnio opisane techniki, a mianowicie RiboTaq i TRAP, w których rybosomy są znakowane odpowiednio znacznikami epitopów lub reporterami w sposób specyficzny dla typu komórki i powiązanymi mRNA izolowanymi przez immunoprecypitację17,18. Technikę tę można połączyć z frakcjonowaniem polirybosomów, aby zapewnić odczyt o wysokiej rozdzielczości dla określonych populacji komórek. Odciskanie rybosomów to kolejna nowatorska technika, która polega na trawieniu nukleazy w celu wygenerowania małych fragmentów lub "śladów" mRNA, które są chronione przez rybosomy. Biblioteki są następnie generowane z tych footprintów i sekwencjonowane. Metoda ta zapewnia specyficzną dla kodonu analizę całego genomu podczas translacji i jest w stanie zidentyfikować zablokowane rybosomy, kodony start inne niż AUG i małe otwarte ramki odczytu w górę, czego nie można osiągnąć przez frakcjonowanie polirybosomów19. Jednak frakcjonowanie polirybosomów można połączyć z profilowaniem rybosomów w celu wyizolowania strawionych fragmentów zawierających pojedyncze rybosomy, wzbogacając w ten sposób o gatunki molekularne potrzebne do przygotowania biblioteki, w której często wymagana jest wysoka czystość próbki. Podsumowując, frakcjonowanie polirybosomów jest elastyczną metodą o trwałym znaczeniu i może być łączona z różnymi dalszymi zastosowaniami, w tym testami całego genomu, takimi jak sekwencjonowanie nowej generacji.

Ekspresja genów jest determinowana przez połączone działanie transkrypcji, translacji i stabilności mRNA i białek, przy czym translacja ma najbardziej dominujący wpływ1. Obecnie jest oczywiste, że każdy z tych kroków jest ściśle regulowany. Mikro-RNA, tworzenie granulek RNA, alternatywna i cytoplazmatyczna poliadenylacja to tylko niektóre przykłady potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów2,3. Każdy z tych mechanizmów oddziela transkrypcję od translacji i wpływa na proteom w interesującym nas systemie biologicznym. Tak więc, co nie jest zaskakujące, same poziomy mRNA są niedoskonałym odczytem poziomów białka4. Proteomika ilościowa zapewnia najbardziej bezpośrednią ocenę ekspresji genów, jednak pomimo ostatnich postępów, nadal istnieją znaczne ograniczenia w zakresie czułości i rozdzielczości sekwencji białek. Dlatego zajęcie się translatomem, repertuarem translacji mRNA, stanowi doskonały kompromis między badaniem transkryptomu a proteomem. Jest dokładniejsza niż transkryptomika w ocenie końcowej ekspresji genów i zapewnia zarówno wyższy zasięg, jak i rozdzielczość sekwencji niż proteomika.
W systemach ssaków większość zdarzeń translacji rozpoczyna się od inicjacji zależnej od czapeczki. Grupa eukariotycznych czynników inicjacyjnych wraz z małą podjednostką rybosomalną 40S gromadzi się w czapeczce 5' mRNA. Kompleks następnie skanuje mRNA, a po osiągnięciu kodonu start AUG rekrutuje dużą podjednostkę rybosomalną 60S, tworząc kompletny rybosom 80S. Faza wydłużania przebiega wraz z ruchem rybosomu wzdłuż mRNA, a czynniki wydłużające pomagają w włączaniu aminokwasów z załadowanych tRNA do powstającego łańcucha peptydowego. Wiele rybosomów może przebiegać wzdłuż jednego mRNA jednocześnie, a wykazano, że liczba powiązanych rybosomów koreluje z szybkością syntezy białek5,6. To sprawia, że obciążenie rybosomalne jest wiarygodnym wskazaniem do translacji i umożliwia separację aktywnie translujących mRNA w oparciu o szybkość sedymentacji. Oprócz kwantyfikacji translujących mRNA, można uzyskać informacje o sekwencji w celu identyfikacji motywów zaangażowanych w regulację translacji. Również białka wiążące RNA i inne czynniki translacyjne mogą być izolowane z różnych frakcji, co ułatwia badanie i odkrywanie powiązanych białek regulatorowych.
W układzie nerwowym kontrola translacyjna została powiązana z takimi procesami jak magazynowanie, transport i lokalna synteza białek mRNA. Wykazano, że stożki wzrostu zawierają specyficzną zlokalizowaną pulę mRNA, odrębną od reszty aksonu7. Ponadto aksony posiadają zdolność do miejscowej syntezy białek8,9. W rezultacie, lokalna kontrola translacji stała się kluczowym tematem badań w neurobiologii. Potencjał frakcjonowania polirybosomów w celu rozwiązania tego problemu został zilustrowany w kilku badaniach, w których technika ta została wykorzystana do zbadania przewodnictwa aksonów w rozwoju rdzenia kręgowego i wykazano zależną od aktywności translację BDNF w mózgu10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank' s zrównoważony roztwór soli</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tuba, cienkościenna, poliallomer, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>uwaga</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>niebezpieczeństwo</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>ostrzeżenie</td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>roztwór fluorku fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>niebezpieczeństwo</td></tr><tr><td>RNasin Plus Inhibitor RNazy</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>niebezpieczeństwo</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>ostrzeżenie</td></tr><tr><td>Kwas-fenol: Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>niebezpieczeństwo</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tkanka do skakania Młynek, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, Wiadro wahadłowe, Tytan, 6 x 14 ml, 40 000 obr/min, 285 000 x&nbsp; g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Frakcjonator gradientu gęstości</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

W ekspresję genów zaangażowanych jest wiele procesów, w tym transkrypcja, translacja i stabilność mRNA i białek. Każdy z tych etapów jest ściśle regulowany, wpływając na ostateczną dynamikę obfitości białka. Na etapie translacji istnieją różne mechanizmy regulacyjne, co sprawia, że same poziomy mRNA nie są wiarygodnym wskaźnikiem ekspresji genów. Ponadto lokalna regulacja translacji mRNA jest szczególnie zaangażowana w funkcje neuronalne, co sprawia, że "translatomika" znajduje się w centrum uwagi neurobiologii. Przedstawiona metoda może być wykorzystana do łączenia transkryptomiki i proteomiki.
Tutaj opisujemy istotne modyfikacje techniki frakcjonowania polirybosomów, która bada translatom w oparciu o powiązanie aktywnie translowanych mRNA z wieloma rybosomami i ich różnicową sedymentację w gradientach sacharozy. Tradycyjnie, praca z próbkami in vivo, szczególnie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), okazała się trudna ze względu na ograniczoną ilość materiału i obecność składników tkanki tłuszczowej. Aby rozwiązać ten problem, opisany protokół jest specjalnie zoptymalizowany do stosowania z minimalną ilością materiału OUN, jak wykazano przy użyciu pojedynczego rdzenia kręgowego i mózgu myszy. Krótko mówiąc, tkanki OUN są ekstrahowane, a translujące rybosomy są unieruchamiane na mRNA za pomocą cykloheksymidu. Następnie przeprowadza się flotację mieliny w celu usunięcia składników bogatych w lipidy. Frakcjonowanie przeprowadza się na gradiencie sacharozy, w którym mRNA są rozdzielane zgodnie z ich ładunkiem rybosomalnym. Wyizolowane frakcje nadają się do szeregu dalszych testów, w tym nowych technologii oznaczania całego genomu.

Rycina 2 przedstawia reprezentatywne profile polirybosomów po frakcjonowaniu. Profile mózgu i rdzenia kręgowego wykazują charakterystyczne krzywe absorpcji, opisane wcześniej dla linii komórkowych. mRNA związane z małymi podjednostkami rybosomalnymi (40S) sedymentują w lżejszych frakcjach i pojawiają się jako pierwszy pik na profilu, a następnie pojawiają się mRNA związane z dużą podjednostką rybosomalną (60S) oraz monosomem (80S). mRNA związane z wieloma rybosomami sedymentują w cięższych frakcjach, przy czym kolejne piki wskazują na zwiększającą się liczbę związanych rybosomów. Na podstawie profilu można ocenić ogólną translację. Przykładowo, tkanka mózgowa ma wyższy stosunek polirybosomów do monosomów niż tkanka rdzenia kręgowego, co wskazuje na bardziej aktywną translację.
RNA wyekstrahowane z poszczególnych frakcji oceniono za pomocą analizatora Bioanalyzer, co wykazało rozkład 18S i 28S rRNA. 18S rRNA pojawia się wcześniej w profilu, zgodnie z tym, że małe podjednostki rybosomalne sedymentują w lżejszych frakcjach sacharozy. Typowe wydajności całkowitego RNA wynoszą 10-20 µg dla mózgu i 2-4 µg dla rdzenia kręgowego. Wydajności RNA z poszczególnych frakcji wynoszą odpowiednio do 4 µg dla mózgu i 0,8 µg dla rdzenia kręgowego, w zależności od frakcji. Pusty gradient sacharozy wykazuje już pewną absorpcję tła przy 260 nm ze względu na obecność DTT. Tło to można odjąć podczas analizy danych w celu normalizacji wartości próbek. Obróbka EDTA doprowadziła do zaniku pików polirybosomów, co dowodzi, że profil sedymentacji wynika z procesu translacji.
<img alt="Schemat przepływu pracy od perfuzji przezsercowej do RNA-seq; wirowanie, ekstrakcja fenolowa, analiza." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1. Schemat postępowania i potencjalne zastosowania frakcjonowania polirybosomów in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Brain and spinal cord sucrose gradients; polysome profiles; absorbance, mRNA fraction; graphs." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2. (A) Typowe profile poliribosomów mózgu i rdzenia kręgowego wraz z oceną wyekstrahowanego RNA za pomocą Bioanalizatora. (B) Rozkład mRNA Gapdh w frakcjach określony metodą qRT-PCR. (C) Profilem polirybosomów dla pustego gradientu oraz mózgu z i bez zastosowania EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>bufor gradientowy 2x</td>
			<td>30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl22, 600 mM NaCl, 200 µg/ml cykloheksymida (CHX), 2mM ditiotreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 17,5%</td>
			<td>8,67 g sacharozy, 25 ml 2x buforu gradientowego, uzupełnić do 50 ml wodą z DEPC20 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 25,6%</td>
			<td>12,8 g sacharozy, 25 ml buforu gradientowego 2x, uzupełnić do 50 ml wodą DEPC H20 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 33,8%</td>
			<td>16,9 g sacharozy, 25 ml 2x buforu gradientowego, uzupełnić do 50 ml wodą z DEPC20 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 41,9%</td>
			<td>20,95 g sacharozy, 25 ml buforu gradientowego 2x, dopełnić do 50 ml wodą DEPC H20 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 50%</td>
			<td>25 g sacharozy, 25 ml 2x buforu gradientowego, do objętości 50 ml wody DEPC20 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3</td>
			<td>bufor do homogenizacji A</td>
			<td>0,25 M sacharozy, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl22, 25 mM KCl</td>
			<td>200 µg/ml CHX, 1x inhibitor proteaz Roche complete, 1 mM DTT, 1 mM fenylometanosulfonylofluoridek (PMSF), 100 J/ml RNAsin </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1</td>
			<td>2M roztwór sacharozy</td>
			<td>68,4% sacharozy, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl22, 25 mM KCl</td>
			<td>100 µg/ml CHX, 1x Roche kompletny inhibitor proteaz, 1 mM DTT, 1 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1</td>
			<td>1,1 M roztwór sacharozy</td>
			<td>38,5% sacharozy, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl22, 25 mM KCl</td>
			<td>100 µg/ml CHX, 1x kompletny inhibitor proteaz Roche, 1 mM DTT, 1 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1</td>
			<td>roztwór sacharozy 0,9 M</td>
			<td>30,8% sacharozy, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl22, 25 mM KCl</td>
			<td>100 µg/ml CHX, 1x Roche kompletny inhibitor proteaz, 1 mM DTT, 1 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1</td>
			<td>bufor do homogenizacji B</td>
			<td>0,25 M sacharozy, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl22, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1%t deoksycholan sodu </td>
			<td>200 µg/ml CHX, 1x inhibitor proteaz Roche complete, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 J/ml RNAsin </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista buforów i roztworów.

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja translacyjnych cząsteczek mRNA w pierwotnej tkance ośrodkowego układu nerwowego (CNS). Protokół rozpoczyna się od wyizolowania odpowiednich tkanek z myszy w obecności cykloheksymidu. Następnie przeprowadza się homogenizację mechaniczną i lizę w detergencie.Następnie przeprowadzane jest flotowanie mieliny, które usuwa tłuszczowe komponenty lipidowe tkanek, które mogłyby maskować profile polirybosomów. Osad zawierający rybosomy i powiązane z nimi mRNA jest sedymentowany w gradiencie sacharozy w celu oddzielenia mRNA związanych z rybosomami. Następnie gradient jest frakcjonowany, aby uzyskać profil polirybosomów, w którym każdy pik reprezentuje mRNA związane z określoną liczbą rybosomów lub podjednostek rybosomalnych.Następnie oczyszcza się frakcje zawierające polirybosomy w celu uzyskania RNA do dalszych zastosowań. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość pracy z niewielkimi ilościami tkanki OUN oraz jej wszechstronność w dalszych zastosowaniach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad translacją w układzie nerwowym, takie jak zmiany poziomów translacji w różnych warunkach oraz rola translacji, czynników regulacyjnych i motywów sekwencyjnych.Mówiąc ogólnie, osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ materiały z OUN pobrane in vivo są zazwyczaj ograniczone, a komponenty statyczne obecne w tkance mogą maskować profile polirybosomów. Po transkardialnej perfuzji myszy za pomocą HBSS z cykloheksydymą, należy szybko przystąpić do ekstrakcji tkanki. Otwórz czaszkę od strony grzbietowej i wyjmij mózg. Przenieś mózg do lodowatego buforu A i bezpośrednio posiekaj tkankę mózgową.Następnie wykonaj laminektomię kręgosłupa piersiowego i lędźwiowego. Usuń cztery centymetry rdzenia kręgowego i przenieś go do lodowatego buforu A na lodzie. Posiekaj oddzielne fragmenty tkanek, aby zwiększyć ich pochłanianie cykloheksanidu, a następnie inkubuj na lodzie przez 15 minut.Następnie rozdrobnij tkanki za pomocą homogenizatora, aby zapewnić nienaruszone jądra komórkowe. Tkanka mózgu wymaga pięciu ruchów ciasno dopasowanym tłuczkiem, po czym przenieś tkankę z siatki do probówek. Tkanka rdzenia kręgowego wymaga pięciu ruchów luźno dopasowanym tłuczkiem, a następnie kolejnych pięciu ruchów tłuczkiem ciasno dopasowanym.Następnie należy pobrać aliquoty do izolacji całkowitego RNA: 200 µL rdzenia kręgowego oraz 400 µL homogenatu mózgu. Należy je zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby usunąć jądra komórkowe, niezniszczone fragmenty komórek i tkanek, tkanki należy odwirować przy 500 G przez 10 minut.Zebrać supernatant zawierający retikulum endoplazmatyczne z przyłączonymi do niego rybosomami, a osad zawierający jądra komórkowe odrzucić. Następnie lizeć fragmenty błon retikulum endoplazmatycznego, aby uwolnić rybosomy, dodając detergenty NP 40 oraz deksozołowany siarczan sodu, każdy do stężenia końcowego 1%. Próbki inkubować przez 30 minut na lodzie. Jednym z wyzwań podczas pracy z tkankami układu nerwowego jest obecność mieliny i innych komponentów bogatych w lipidy w profilach polisomów.Aby rozwiązać ten problem, należy wprowadzić proces modelowania flotacji w celu usunięcia tych komponentów przed rozpoczęciem pracy. Wstępnie schłodź kubełki i wirnik ultrawirówki do temperatury 4 °C. Następnie zmieszaj zebrane lizaty z 1,22 objętości 2 M sacharozy.Przenieś każdą mieszaninę do polietylenowej probówki do ultrawirówki i dopełnij objętość w probówkach do 10 ml sacharozą 1,1 M. Następnie ostrożnie nałóż na wierzch warstwę sacharozy 0,9 M. Teraz przenieś probówki do schłodzonych koszyków i zrównoważ je buforem B. Umieść zrównoważone koszyki w schłodzonym rotorze i uruchom wirówkę przy 100 000 G. Przez trzy godziny w temperaturze 4°C rybosomy i RNA utworzą osad pod zawieszonymi lipidami.Po wirowaniu do flotacji mieliny należy usunąć nadsącz i rozpuścić osady zawierające rybosomy w buforze B. Następnie należy zmierzyć absorbancję roztworów rybosomów przy 260 nanometrach za pomocą aparatu NanoDrop. Na podstawie tych wartości należy oszacować całkowite stężenia RNA. Teraz należy przenieść próbki na przygotowane gradienty sacharozy.Należy uważać, aby nie zaburzyć gradientów, oraz dołączyć pusty gradient jako kontrolę. Zrównoważyć schłodzone wirowki z próbkami w taki sam sposób jak poprzednio. Następnie wirować w centrifugach przy 285 000 G przez półtorej godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Podczas wirowania w wirówce należy przygotować frakcjonator. Najpierw ustawić czułość lampy UV. Następnie przymocować nakłuwacz probówek do frakcjonatora i połączyć go za pomocą rurki z butelką zawierającą 60% sucrose.Przy użyciu pompy perystaltycznej rozpocznij pompowanie sacharozy do frakcjonatora z prędkością 1 ml/min. Sprawdź, czy nie występują nieszczelności powodujące przedostawanie się pęcherzyków powietrza i uszczelnij odpowiednie połączenia. Następnie ręcznie wpompuj bufor gradientowy do detektora UV, aby ustawić linię bazową.Po ostrożnym wyjęciu próbek z ultrawirówki, unikając gwałtownych wstrząsów, należy wprowadzić jedną z nich do frakcjonatora, a następnie przebić dno probówki za pomocą przebijaka. Rozpocząć pompowanie 60% sacharozy, aby wypchnąć gradient przez detektor UV do dozownika kropelkowego. Zarejestrować profil absorbancji przy 260 nanometrach.Zabierz 20 frakcji z dozownika kropelkowego do probówek o pojemności dwóch mililitrów. Zbierz 600 µL na każdą frakcję, a następnie przystąp do przetwarzania gradientów próbek w każdej frakcji, dodając 10% SDS do końcowego stężenia 1% SDS i wymieszaj dokładnie. Następnie wyizoluj RNA, stosując ekstrakcję kwasowym fenolem i chloroformem.Zacznij od dodania jednej objętości kwasowego chloroformu fenylowego w temperaturze pokojowej, a następnie podgrzewaj probówki do 65 °C przez 10 minut. Po podgrzaniu ostrożnie otwórz fiolki w dygestorium, aby zwolnić ciśnienie. Następnie odwiruj frakcje przy 17 000 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej i zbierz fazę wodną, która może znajdować się nad lub pod sacharozą.Następnie dodaj jedną objętość izopropanolu, jedną dziewiątą objętości octanu sodu oraz jeden mikrolitr glyco blue. Wytrąć RNA przez co najmniej godzinę w temperaturze -80 °C, a następnie odwiruj go w wirówce, aby uzyskać osad. Następnie przemyj osady raz schłodzonym 80% ethanolem i po ponownym odwirowaniu RNA wysusz osady na powietrzu, resuspenduj je w wodzie i przystąp do dalszych analiz.Alternatywnie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Pusty gradient sacharozy wykazuje pewną absorpcję tła przy 260 nm ze względu na obecność DTT. Tło to można odjąć podczas analizy danych w celu normalizacji wartości próbek; profile RNA mózgu i rdzenia kręgowego wykazują charakterystyczne krzywe absorpcyjne, a mRNA związane z małymi podjednostkami rybosomalnymi sedymentują w lżejszych frakcjach, pojawiając się wcześniej na profilu.Po nich następują duże podjednostki rybosomalne oraz mRNA związane z jednym rybosomem; mRNA związane z wieloma rybosomami sedymentują w późniejszych frakcjach. Obróbka próbek EDTA doprowadziła do zaniku pików polirybosomów, co wykazało, że profil sedymentacji wynikał z procesu translacji. Do tej techniki można dołączyć dodatkowe metody, takie jak Ribot attack i trap, w celu przeprowadzenia badań translacji specyficznych dla danego typu komórek.Po tym przełomie technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neurobiologii do zgłębiania roli regulacji translacji w rozwoju neuronów oraz w chorobach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić frakcjonowanie polisomów z niewielkich ilości tkanki OUN oraz jak oczyścić RNA do późniejszych zastosowań w wybranych analizach.

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo Badanie translatomu ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie poliribosomów

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę frakcjonowania polirybosomów do badania translatomii tkanki ośrodkowego układu nerwowego in vivo. Technika ta umożliwia izolację RNA związanego z rybosomami z małych ilości materiału.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Przeglądaj więcej filmów