Name: Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę selektywnego etykietowania aktywnych fagocytów w udarze mózgu za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych. Technika ta pozwala ocenić klirens martwych komórek w tkance niedokrwiennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty R01NS062842 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (V.V.D.) oraz przez granty R21 NS064403 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health poprzez ARRA (V.V.D.) i R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, Narodowe Instytuty Zdrowia (V.V.D.).

Metoda jest odpowiednia dla utrwalonych formaldehydem, zatopionych w parafinie skrawków tkanki. Technika ta jest tutaj zademonstrowana w jej zastosowaniu do eksperymentalnego udaru mózgu u szczurów.
1. Przygotowanie komponentów do systemu wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA)
Chociaż ulepszenie oparte na TSA jest używane w końcowym etapie etykietowania, przygotowanie do tej reakcji może zająć więcej niż 1 godzinę. Dlatego wygodnie jest przygotować odczynniki TSA przed rozpoczęciem etykietowania.
<ol>
	<li>Zrobić roztwór podstawowy tyramidu fluoroforowego. Użyć odczynnika tyramidowego fluoroforowego dostarczanego w oddzielnych fiolkach z zestawem do etykietowania TSA. Dodać 300 μl DMSO do fiolki z odczynnikiem tyramidu. Roztwór podstawowy tyramidu fluoroforowego jest stabilny przez co najmniej 3 miesiące, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor do płukania TNT zawierający: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. W razie potrzeby 0,3% Triton X-100 można zastąpić 0,05% Tween-20. Alternatywnie PBS może być używany jako bufor do mycia.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący TNB zawierający: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% odczynnik blokujący (dostarczany z zestawem). Aby całkowicie rozpuścić odczynnik blokujący, powoli dodawaj go małymi porcjami do buforu, mieszając. Podgrzewać ten roztwór stopniowo do temperatury 55 °C, ciągle mieszając. Może to zająć 30-60 minut. Roztwór będzie mleczny. Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sekcji
Użyj szkiełek z zamontowanymi sekcjami o grubości 5 μm, wyciętymi z tkanek utrwalonych formaliną.
<ol>
	<li>Traktuj skrawki ksylenem przez 15 minut.</li>
	<li>Nawadniaj sekcje w następujący sposób: moczyć w 96% EtOH 2x przez 5 min każda; moczyć w 80% EtOH przez 5 min; myć wodą 2x po 5 min każda.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy proteinazy K, rozcieńczając roztwór podstawowy proteinazy K do 50 μg/ml w PBS.</li>
	<li>Dodaj roztwór roboczy proteinazy K do sekcji. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 °C. Objętość roztworu i czas trawienia mogą wymagać dostosowania w zależności od wielkości skrawków i typów tkanek. Dla małego (poniżej 5 mm średnicy) przekroju wystarczy 50 μl roztworu proteinazy. W przypadku przekroju średniej wielkości (~10 mm średnicy) dodać 100 μl roztworu proteinazy K. W przypadku bardzo dużych odcinków objętość rozwiązania może być skalowana w górę. We wszystkich przypadkach należy zadbać o to, aby nie dopuścić do nadmiernego trawienia odcinków, co prowadzi do całkowitej utraty sygnału i niszczy morfologię tkanek. Dzieje się tak często, gdy czas inkubacji przekracza 25 minut.</li>
	<li>Umyj sekcje w wodzie destylowanej 2x po 5 min każdy. Przygotuj mieszankę do etykietowania zawierającą aktywną sondę, gdy sekcje znajdują się w wodzie.</li>
</ol>
3. Barwienie oparte na VACC TOPO
<ol>
	<li>Przygotuj aktywny roztwór sondy, łącząc następujące elementy: 
	Woda - 11,75 μl 
	1 M Tris-HCl, pH 7,4 - 1,25 μl 
	100 pmol 12-zasadowego oligonukleotydu samobójczego - 1 μl 
	100 pmol oligonukleotydu adapterowego - 1 μl 
	50 pmol VACC TOPO - 10 μl</li>
	<li>Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej (23 °C) przez 15 minut, aby umożliwić aktywację sondy.</li>
	<li>Weź skrawki ze słoika do mycia i odessaj pozostałą wodę. Następnie nanieść aktywny roztwór sondy przygotowany w kroku 3.1 (25 μl na odcinek ~10 x 10 mm).</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe należy nakryć i inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 °C. Zanurzyć szkiełka podstawowe w wodzie, aby delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe. Prać w wodzie 3x po 5 min.</li>
</ol>
4. Wzmocnienie sygnału TSA
<ol>
	<li>Skrawki tkanek przykryć przygotowanym wcześniej buforem blokującym TNB i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej (23 °C).</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:100 koniugatów streptawidyny i peroksydazy chrzanowej (SA-HRP) w buforze blokującym TNB. Odessać bufor blokujący TNB i zastosować roztwór SA-HRP. Inkubować szkiełka z SA-HRP przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj odpowiedniej objętości odczynnika, aby pokryć wycinek tkanki, zwykle 100 μl na sekcjon.</li>
	<li>Myj szkiełka 3x po 5 minut w buforze do płukania TNT (lub PBS) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczenie 1:50 wywaru tyramidowego fluoroforu w 1x rozcieńczalnik Amplifikacji z zestawu. Odpipetować roztwór roboczy tyramidu fluoroforowego na każde szkiełko. Użyj wystarczającej ilości roztworu roboczego, aby całkowicie pokryć wycinek tkanki, zwykle 100 μl na sekcję. Przygotuj roztwór roboczy tyramidu fluoroforowego bezpośrednio przed każdym etykietowaniem. Roztwór nie może być ponownie użyty, więc po oznakowaniu wyrzuć każdą niewykorzystaną jego część.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 3 do 10 minut. Monitorować wzrost fluorescencji pod mikroskopem, aż pojawią się pierwsze oznaki struktur. Szybko przejdź do etapu prania.</li>
	<li>Szkiełka myć 3x po 5 minut w buforze do płukania TNT (lub PBS) w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
	<li>Dodaj roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI i szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Do wizualizacji fluorescencji DAPI i FITC należy użyć zestawu filtrów pasmowo-przepustowych: 
	wzbudzenie FITC D490/40, emisja 520/10; Wzbudzenie DAPI D360/40, emisja 460/20 lub podobne.</li>
</ol>

<ol><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li>
<li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li>
<li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li>
<li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus-faced+microglia%3A+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li>
<li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li>
<li>TSA Fluorescence Systems. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf">http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK%2FCdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep.+%22%5BJournal%5D)">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809(2012).</li>
<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym filmie pokazujemy, w formacie sekcji tkanki, jak oznaczać aktywne fagocyty, które usuwają śmierć komórki w ogniskowym niedokrwieniu mózgu. Przedstawiona technika jest pierwszym podejściem, które w szczególności oznacza tylko te komórki gospodarki odpadami, które pochłonęły i aktywnie trawią zwłoki komórkowe. To sprawia, że jest korzystny w stosunku do innych istniejących metod znakowania komórek fagocytarnych, które nie mają tej zdolności. 
W metodzie wykorzystuje się ogólny i selektywny...

Udar niedokrwienny powoduje głębokie zmiany w tkance mózgowej, której dotyczy problem. Inicjuje masywną śmierć komórki, co prowadzi do szybkiej aktywacji rezydentnych komórek fagocytarnych pochodzenia mikroglejowego. Uruchamia również infiltrację niedokrwionego mózgu przez różne typy profesjonalnych fagocytów pochodzących z krwi, w tym neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne i mastoczne1,2.
Nadal dyskutuje się, czy ta reakcja na uraz niedokrwienny odgrywa pozytywną czy negatywną rolę. Chociaż fagocytoza po udarze może być korzystna, ponieważ usuwa martwe komórki i tłumi stan zapalny, generuje również toksyczne reaktywne formy tlenu, wpływając na przeżycie neuronów i nasilając uszkodzenia tkanek1-5.
Podczas gdy kilka typów komórek fagocytarnych infiltruje niedokrwiony mózg, nie wszystkie z nich uczestniczą w gospodarce odpadami, pochłaniając zwłoki komórek i torując drogę procesom regeneracyjnym1-3. Stwarza to wymóg selektywnej identyfikacji komórek gospodarujących odpadami, które przeprowadzają fagocytarny klirens śmierci komórki w udarze mózgu. Podczas obrazowania takich aktywnych komórek gospodarujących odpadami ważne jest również znalezienie odpowiedzi na pytanie, jak skutecznie rozkładają one pochłonięte zwłoki komórek. Skuteczna i całkowita degradacja DNA umierającej komórki w fagocytozie jest niezbędna, ponieważ zapobiega samouodparnianiu się i uwalnianiu patologicznego materiału jądrowego6.
Tutaj prezentujemy nowe sondy, które wykorzystują specyficzne pęknięcia DNA jako markery aktywnych komórek fagocytarnych. Te charakterystyczne pęknięcia powstają wyłącznie podczas rozpadu pochłoniętych jąder w funkcjonalnych komórkach gospodarki odpadami. Dlatego sondy selektywnie znakują tylko te fagocyty, które pochłaniają i aktywnie trawią zwłoki komórkowe. Pozwalają również na obserwację intensywności i zakończenia rozpadu DNA po pochłonięciu. Sondy są pomocne w ocenie intensywności i skuteczności klirensu fagocytarnego. 
Nowe sondy opierają się na markerze nieopartym na białku i dlatego mogą być szczególnie korzystne w badaniach nad udarem, w których rozległe uszkodzenie niedokrwienne może zakłócić morfologię komórkową lub zubożyć markery białkowe, zwłaszcza w strefie niedokrwiennej rdzenia.
Zasada techniki jest przedstawiona na rysunku 1. Rysunek przedstawia sondy oligonukleotydowe w kształcie spinki do włosów ligowane przez enzym topizomerazę krowianki (VACC TOPO) do końców DNA 5'OH generowanych przez lizosomalną DNazę II podczas trawienia DNA7.

<table><tbody><tr><td>Ksylen</td><td>JT Baker</td><td>9490-22</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza etanolowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>PBS Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Krowianka Topoizomeraza I</td><td>Vivid Technologies</td><td></td><td>5 pmol/&mu; l zapas</td></tr><tr><td>12-zasadowy zwis samobójczy oligonukleotyd</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGA CCT GC<silny>B< / silny> GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B &ndash; Biotyna-dT; 100 pmol/&mu; l zapasy w ddH2O&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Adapter Oligonukleotyd</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/&mu; l zapasy w ddH2O</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, PH 7,4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td></td></tr><tr><td>TSA, system fluoresceinowy&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td></td><td></td>NEL701A001KT</tr><tr><td>1 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td><td>nakrywkowe 22 x 22 mm lub 22 x 40 mm szklane lub plastikowe. Podczas reakcji preferowane są szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego, ponieważ łatwiej je usunąć z sekcji.</td></tr><tr><td>Sekcje mózgu szczura Mózg</td><td></td><td></td><td>szczura pobrany 48 godzin po rozrodczości udaru niedokrwiennego, jak opisano w Didenko et al11. 5-6 &mu; Skrawki o grubości M wycięte z utrwalonych w paraformaldehydzie bloków tkanek zatopionych w parafinie. Używaj naładowanych i wstępnie oczyszczonych szkiełek.&nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera wideo i oprogramowanie</td><td>Micromax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Opisujemy nowe podejście histochemiczne do wizualizacji klirensu fagocytarnego w ogniskowym niedokrwieniu mózgu. Podejście to pozwala na badanie eliminacji martwych komórek w udarze mózgu przez fagocyty gospodarujące odpadami dowolnej linii komórkowej. Chociaż w niedokrwionym mózgu obecne są liczne komórki różnego pochodzenia, które są zdolne do fagocytozy, tylko część z nich aktywnie pochłania i trawi zwłoki komórek. Selektywna wizualizacja, kwantyfikacja i analiza takiego aktywnego gospodarowania odpadami fagocytarnymi są pomocne w ocenie reakcji mózgu na niedokrwienie. Skuteczne usuwanie śmierci komórkowej jest ważne dla regeneracji mózgu po urazie niedokrwiennym, ponieważ otwiera drogę do późniejszych procesów regeneracyjnych. Nieoczyszczenie zwłok skutkowałoby reakcją toksyczną wywołaną przez niezdegradowane DNA i białka. W opisanej procedurze wykorzystuje się sondy fluorescencyjne selektywnie ligowane przez wirusową topoizomerazę do charakterystycznych pęknięć DNA powstających we wszystkich fagocytach podczas pochłaniania i trawienia komórek nieodwracalnie uszkodzonych przez niedokrwienie. Metoda ta jest nowym narzędziem do badania reakcji mózgu na uszkodzenie niedokrwienne.

Zasada techniki znakowania aktywnych fagocytów odpowiedzialnych za usuwanie odpadów została przedstawiona na Rysunku 1. Schemat obrazuje, że detekcja przebiega w trzech etapach. Pierwszy etap obejmuje aktywację sondy (Rysunek 1A); w drugim etapie aktywowana sonda jest ligowana do specyficznych pęknięć DNA w sekcjach tkankowych (Rysunek 1C); trzeci etap obejmuje amplifikację sygnału fluorescencyjnego (Rysunek 1D</...

Prezentujemy nową technikę fluorescencji do selektywnego znakowania in situ aktywnych komórek fagocytarnych, które usuwają zwłoki komórek po udarze. Podejście to jest ważne dla oceny reakcji mózgu na niedokrwienie, ponieważ tylko niewielka część fagocytów obecnych w niedokrwionym mózgu uczestniczy w usuwaniu śmierci komórki.

Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest selektywne znakowanie aktywnych komórek fagocytarnych, które usuwają zwłoki komórkowe w przebiegu udaru. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie komponentów do reakcji wzmocnienia sygnału opartej na metodzie Tite, a następnie przygotowanie przekrojów tkankowych.Następnie przeprowadza się reakcję znakowania z wykorzystaniem enzymu topoizomerazy wirusa vaccinia oraz podatnych sond fluorescencyjnych. Ostatnim etapem jest wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego w oparciu o IDE. W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną do oceny klirensu fagocytycznego martwych komórek w przekrojach tkankowych ogniskowego niedokrwienia mózgu.Usuwanie martwych komórek przez fagocyty odgrywa istotną rolę w regeneracji mózgu po niedokrwieniu. Przedstawiona metoda określa efektywność tego procesu poprzez znakowanie wyłącznie tych fagocytów, które aktywnie usuwają martwe komórki. Choć metoda ta pozwala na analizę niedokrwionego mózgu, może być ona również wykorzystana do badania uszkodzeń niedokrwiennych w innych narządach i tkankach.W przypadkach, gdy kwaśne oczyszczanie martwych komórek za pomocą FA jest istotne, należy pamiętać, że choć wzmocnienie sygnału IDE lub etap TSA odbywa się w końcowej fazie znakowania, przygotowanie do tej reakcji może zająć ponad godzinę. Dlatego wygodniej jest przygotować odczynniki TSA w pierwszej kolejności.Pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworu zapasu fluoro four TYROM poprzez dodanie 300 µL DMSO do plików odczynnika tyrom dołączonych do zestawu do znakowania TSA. Następnie należy przygotować bufor płuczący TNT, aby całkowicie rozpuścić odczynnik blokujący. Podczas przygotowywania buforu blokującego TNB należy dodawać go powoli, małymi porcjami podczas mieszania, stopniowo podgrzewając roztwór do 55 °C.Przy ciągłym mieszaniu roztwór stanie się mleczny; należy go doprowadzić do temperatury pokojowej przed pobraniem alikwotów, a do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20°C. Do tej procedury preparaty są przygotowywane z wyprzedzeniem poprzez montowanie skrawków o grubości 5 µm, wyciętych z tkanki utrwalonej w formalinie. Najpierw należy poddać skrawki działaniu ksylenu przez 15 minut, a następnie rehydratować je poprzez serię przemyć etanolem, a na koniec dwukrotnie przemyć w wodzie.Następnie należy przygotować roztwór roboczy proteinazy K, rozcieńczając roztwór stokowy w PBS do stężenia 50 µg/mL. Najtrudniejszą częścią tego eksperymentu jest ustalenie optymalnego czasu trawienia proteinazą K; w zależności od wielkości i rodzaju tkanki może być konieczne zastosowanie kontroli z krótszymi i dłuższymi czasami trawienia, aby zapewnić sukces procesu. Do skrawków należy dodać odpowiednią objętość roztworu roboczego proteinazy K i inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 °C.Po inkubacji przemyć preparaty w wodzie destylowanej dwukrotnie przez pięć minut za każdym razem. Podczas moczenia preparatów przygotować mieszaninę znakującą zawierającą aktywną sondę. Aby przygotować roztwór aktywnej sondy, połączyć oligonukleotydy z wodą, buforem Tris-HCl 1 M oraz topoizomerazą vaccinia dostarczoną w zestawie, wymieszać delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w celu aktywacji sondy.Po drugim etapie płukania wyjmij skrawki ze słoika i odessij pozostałą wodę. Następnie nanieś przygotowany wcześniej roztwór sondy aktywnej tak, aby całkowicie pokrył skrawki. Przykryj skrawki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 23 °C.Po inkubacji zanurz szkiełka w wodzie, aby delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe. Przemyj szkiełka wodą trzykrotnie, za każdym razem przez pięć minut. Po ostatnim płukaniu pokryj skrawki tkanek buforem blokującym TNB i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.W tym czasie przygotować rozcieńczenie 1:100 koniugatów streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (S-A-H-R-P) w buforze blokującym TNB. Wyjąć preparaty i odessać bufor blokujący TNB. Przed nałożeniem roztworu S-A-H-R-P należy użyć takiej ilości odczynnika, aby pokrył on cały przekrój tkanki.Po przykryciu inkubować preparaty przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć preparaty trzykrotnie, po pięć minut za każdym razem. W buforze płuczącym TNT przygotować bezpośrednio przed użyciem rozcieńczenie roztworu Fluoro-4-Tide w stosunku 1:50 w 1x rozcieńczalniku do amplifikacji. Nanieść roztwór pipetą na preparaty, całkowicie pokrywając przekrój tkanki.Ponieważ roztworu nie można ponownie wykorzystać, należy zutylizować każdą pozostałą, niewykorzystaną jego część. Inkubować preparaty w temperaturze pokojowej przez od 3 do 10 minut. Monitorować fluorescencję.Zwiększ powiększenie pod mikroskopem do momentu, aż pojawią się pierwsze zarysy struktur. Szybko przejdź do etapu płukania. Płucz preparaty trzy razy po pięć minut.W buforze TNT w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Po przemyciu dodać roztwór antyblaknący z DPI i nakryć szkiełkiem podstawowym. Wyniki obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.Zdjęcia te przedstawiają dwa przykłady oczyszczania kwasowego PHA. Barwienie jąder komórkowych dappy jest widoczne w fluorescencji niebieskiej, a sonda liable vac topo w fluorescencji zielonej. Schematy zdarzeń przedstawionych na tych obrazach ukazują jądra fagocytów oraz pochłonięte jądra zewnątrzkomórkowe w różnych stadiach trawienia. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje około trzech godzin.Po obejrzeniu tego filmu dowiesz się, jak stosować żywe sondy fluorescencyjne w przekrojach tkankowych. Będziesz także w stanie selektywnie znakować aktywne ides, eliminując martwe komórki w niedokrwionym mózgu.

assessing-phagocytic-clearance-cell-death-experimental-stroke

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena fagocytarnego usuwania obumierających komórek w eksperymentalnym udarze mózgu za pomocą łączących się fluorescencyjnych sond

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Modele in vivo szczurów są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów patologicznych i celów terapeutycznych dla udaru niedokrwiennego. W niniejszej pracy opisano wykonywanie barwienia immunofluorescencyjnego w wycinkach mózgu z zawałem po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów.

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Poznaj metodę selektywnego etykietowania aktywnych fagocytów w udarze mózgu za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych. Technika ta pozwala ocenić klirens martwych komórek w tkance niedokrwiennej.

Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów