Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest selektywne znakowanie aktywnych komórek fagocytarnych, które usuwają zwłoki komórkowe po udarze. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie komponentów do reakcji wzmocnienia sygnału opartej na Tite. Drugim krokiem jest przygotowanie sekcji.

Następnie przeprowadza się reakcję znakowania przy użyciu enzymu krowianki, topoizomerazy i odpowiedzialnych sond fluorescencyjnych. Ostatnim krokiem jest wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego w oparciu o IDE. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do oceny klirensu fagocytarnego martwych komórek w odcinkach tkanek ogniskowego niedokrwienia mózgu.

Usuwanie martwych komórek przez fagocyty odgrywa ważną rolę w regeneracji mózgu po niedokrwieniu. Przedstawiona metoda określa efektywność tego procesu poprzez znakowanie tylko tych rozmiarów pego, które aktywnie usuwają martwe komórki. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w niedokrwienny mózg, może być również wykorzystana do badania uszkodzeń niedokrwiennych w innych narządach i tkankach.

Gdzie ważny jest kwaśny klirens martwych komórek. Chociaż wzmocnienie sygnału IDE lub etap TSA następuje w końcowym etapie etykietowania, przygotowanie do tej reakcji może zająć ponad godzinę. Dlatego wygodniej jest najpierw zrobić odczynniki TSA.

Pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworu podstawowego fluoro four TYROM o stężeniu 300 mikrolitrów DMSO do plików z odczynnikami tyrom zawartymi w zestawie do etykietowania TSA. Następnie przygotuj bufor do płukania TNT, aby całkowicie rozpuścić odczynnik blokujący. Przygotowując bufor blokujący TNB, powoli dodawaj go małymi porcjami, mieszając, stopniowo podgrzewaj roztwór do 55 stopni Celsjusza.

Przy ciągłym mieszaniu roztwór będzie wyglądał na mleczny i przed użyciem należy go doprowadzić do temperatury pokojowej i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego stosowania W tej procedurze szkiełka przygotowuje się z wyprzedzeniem, montując sekcje o grubości pięciu mikrometrów. Wyciąć z tkanki utrwalonej w formalinie. Najpierw potraktuj skrawki ksylenem przez 15 minut, ponownie nawodnij je poprzez serię płukań etanolem, a następnie dwa płukania w wodzie.

Następnie przygotuj roztwór roboczy proteinazy K, rozcieńczając roztwór podstawowy do 50 mikrogramów na mililitr w PBS. Najtrudniejszą częścią tego eksperymentu jest określenie idealnej długości czasu dla kontroli trawienia proteinazy K, przy czym zarówno krótszy, jak i dłuższy czas trawienia może być potrzebny do zapewnienia sukcesu w zależności od wielkości i rodzaju tkanki. Dodać odpowiednią objętość roztworu roboczego białka ACE K do skrawków i inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Po inkubacji umyć skrawki w wodzie destylowanej dwa razy przez pięć minut każda. Podczas namaczania skrawków przygotuj mieszankę do etykietowania zawierającą aktywną sondę. Aby przygotować aktywny roztwór sondy, należy połączyć oligonukleotydy z wodą, jeden tris molowy, HCL i topoizomerazę krowianki dostarczone w zestawie, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić aktywację sondy.

Po drugim okresie mycia wyjmij sekcje ze słoika i odessaj pozostałą wodę. Gdy będziesz gotowy, nałóż aktywny roztwór sondy przygotowany wcześniej pokryć. Wsuń sekcje i inkubuj je przez 15 minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Po inkubacji zanurz szkiełka w wodzie, aby delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe. Umyj szkiełka w wodzie trzy razy po pięć minut każde. Po ostatnim płukaniu przykryj skrawki tkanki buforem blokującym TNB i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

W tym czasie należy przygotować rozcieńczenie od 1 do 100 koniugatów peroksydazy sprączkowanej i peroksydazy chrzanu. S-A-H-R-P w buforze blokującym TNB, wyjmij szkiełka i odessaj bufor blokujący TNB. Przed nałożeniem roztworu S-A-H-R-P należy użyć odczynnika w ilości wystarczającej do pokrycia całego wycinka tkanki.

Po przykryciu inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej Po inkubacji umyć szkiełka trzy razy po pięć minut każde. W buforze do przemywania TNT w temperaturze pokojowej należy przygotować rozcieńczenie od 1 do 50 materiału wyjściowego fluoro four TY IDE w jednym rozcieńczalniku do amplifikacji x bezpośrednio przed użyciem. Odpipetować roztwór na szkiełka podstawowe całkowicie pokrywające wycinek tkanki.

Ponieważ roztwór nie może być ponownie użyty, należy wyrzucić pozostałą niewykorzystaną część. Inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez trzy do 10 minut. Monitoruj fluorescencję.

Zwiększaj pod mikroskopem, aż w tym czasie pojawią się pierwsze ślady struktur. Szybko przejdź do etapu prania. Umyj szkiełka trzy razy po pięć minut każde.

W TNT Bufor do płukania w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Po umyciu dodaj roztwór zapobiegający blaknięciu z DPI i szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj wyniki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zdjęcia te pokazują dwa przykłady klirensu kwasowego PHA. Plama jądrowa jest pokazana w niebieskiej fluorescencji, a odpowiedzialna sonda topograficzna vac jest pokazana na zielonych diagramach fluorescencyjnych zdarzeń przedstawionych na tych obrazach, pokazujących jądra fagocytów i pochłonięte tiki dodatkowe jądra na różnych etapach trawienia. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu dowiesz się, jak używać odpowiedzialnych sond fluorescencyjnych w skrawkach tkanek. Będziesz także w stanie selektywnie oznaczać aktywne idee, usuwając martwe komórki w niedokrwiennym mózgu.