Name: Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji mRNA związanych z mitochondriami drożdży przy użyciu frakcjonowania różnicowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów translacji zlokalizowanej w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy doktorom Erez Eliyahu, Danielowi Melamedowi, Ophry Pines i Doronowi Rapaportowi za pomoc i komentarze podczas ustanawiania tego protokołu. Prace te są finansowane przez Fundusz Bezpieczeństwa Wewnętrznego (grant nr 1193/09).

1. Oczyszczanie mitochondriów
Zważ granulkę komórek. Około 0,6 g uzyskuje się ze 100 ml komórek.
<ol>
	<li>Hodować 100-150 ml komórek drożdży do OD600 = 1-1,5 w temperaturze 30 °C na niefermentującym pożywce wzrostowej, takiej jak pożywka wzrostowa na bazie galaktozy, w celu wzbogacenia mitochondriów.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj osad podwójnie destylowaną wodą i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu DTT na 0,5 g komórek. Ważne jest, aby potraktować komórki środkiem redukującym w celu zerwania wiązań dwusiarczkowych w ścianie komórkowej, poprawiając w ten sposób hydrolizę.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 30 °C, delikatnie wstrząsając. W międzyczasie zważ 6 mg zymoliazy na 1 g komórek i zawieś ją w buforze Zymolyase Buffer.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu zymoliazy na 0,15 g komórek. Nie wirować.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 z 10 μl podwielokrotności komórek w 990 μl wody.</li>
	<li>Dodaj Zymoliazę (krok 1.5) do komórek, aby hydrolizować polimery glukozy w wiązaniach β-1,3-glukanu i wytworzyć sferoplasty. Na tym etapie sferoplasty powinny być przechowywane w roztworze izotonicznym, aby uniknąć lizy.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C (dla optymalnej aktywności zymolyazy), delikatnie wstrząsając. Aby zweryfikować hydrolizę ściany komórkowej i wytwarzanie sferoplastów, należy zmieszać 10 μl komórek z 990 μl wody. Oczekuje się, że sferoplasty ulegną lizie z powodu różnicy osmotycznej, a OD600 powinien być co najmniej 10-krotnie mniejszy niż wartość określona w kroku 1.9. Jeśli nie, kontynuuj inkubację z zymoliazą przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant, ponieważ osad może być niestabilny.</li>
	<li>Przemyć sferoplasty buforem zymoliazy i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić sferoplasty za pomocą 100 ml pożywki Recovery. Przenieść sferoplasty do kolby Erlenmeyera i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Ten etap odzyskiwania jest konieczny, ponieważ podczas leczenia zymoliazą translacja zostaje zatrzymana, a lokalizacja mRNA zostaje zakłócona (Figura 1B).</li>
	<li>Dodać 0,1 mg/ml CHX i przenieść sferoplasty do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodatek CHX jest ważny dla zamrożenia asocjacji rybosomów z mRNA. W ten sposób utrzymywana jest zależna od rybosomów asocjacja mRNA z mitochondriami.</li>
	<li>Odwirować sferoplasty o stężeniu 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie zimnym buforem mannitolowym.</li>
	<li>Zawiesić sferoplasty za pomocą 4 ml zimnego buforu mannitolowego i przenieść je do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml wyposażonego w ściśle przylegający tłuczek. Delikatnie rozbij sferoplasty za pomocą 15 pociągnięć i przenieś lizat do probówki o pojemności 13 ml.</li>
	<li>Odwirować lizat przy stężeniu 1 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Odłożyć 1 ml (25%) próbki jako próbkę niefrakcjonowaną ("próbka całkowita"). Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4X LSB do analizy western blot. Wytrącić RNA z reszty próbki "całkowitej" (patrz Protokół 3, Wytrącanie RNA).</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia mitochondriów.</li>
	<li>Przenieść supernatant (~3 ml) do nowej probówki i trzymać go na lodzie. To jest frakcja "cytozolowa". Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4x LSB do analizy western blot. Wytrącić RNA z reszty próbki "cytozolowej" (patrz Protokół 3, Wytrącanie RNA).</li>
	<li>Przemyć osad 3 ml buforu mannitolowego i ponownie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą 3 ml buforu mannitolowego. Ta próbka zawiera mitochondria i jest określana jako frakcja "mitochondriów". Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4x LSB do analizy western blot.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Do każdej próbki dodać jedną objętość 8 M chlorowodorku guanidyny i dwie objętości 100% etanolu. Wirować i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Bądź ostrożny, ponieważ pellet może być niestabilny.</li>
	<li>Przemyć granulat 70% EtOH.</li>
	<li>Zawiesić osad w 400 ml wody wolnej od RNaz i przenieść próbkę do nowej probówki Eppendorfa.</li>
	<li>Ponownie wytrącić RNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 i dwie objętości 100% EtOH. Wirować i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 70% EtOH.</li>
	<li>Wysuszyć granulki na powietrzu i ponownie zawiesić wodą wolną od RNaz. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki mogą być używane do analizy północnej19 lub analizy mikromacierzy18 (patrz Protokół 3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie RNA do analizy mikromacierzy
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić mRNA z kroku 2.2 za pomocą 650 ml wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Aby usunąć wszelkie pozostałości DNA lub białka, dodaj równą objętość (650 ml) kwaśnego fenolu:chloroformu (5:1, pH 4,7) i energicznie wiruj. Wirować z maksymalną prędkością przez 2 min.</li>
	<li>Przenieść 500 ml górnej fazy (fazy wodnej) do nowej probówki. Unikaj przyjmowania interfazy, ponieważ zawiera ona DNA. Należy również uważać na przyjmowanie fenolu, który może hamować reakcję odwrotnej transkrypcji.</li>
	<li>Próbka RNA zawiera znaczną ilość heparyny, która jest silnym inhibitorem odwrotnej transkryptazy. W związku z tym w przypadku znakowania RT-PCR lub mikromacierzy należy go usunąć. Usunąć heparynę przez wytrącanie LiCl: dodać LiCl do końcowego stężenia 2 M i inkubować próbki przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozmrażać próbki w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzuć sklarowany osad i umyj osad 80% etanolem. Ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić osad w 150 ml wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Aby usunąć resztki LiCl, należy ponownie wytrącić 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,3 i 3 objętościach 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Dokładnie umyć przezroczyste osady 80% etanolem i wysuszyć na powietrzu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 25 ml wody wolnej od RNaz i utrzymywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami znakowania i hybrydyzacji RNA opisanymi w18,20.</li>
</ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Postęp technologiczny w obrazowaniu zaowocował narzędziami o wysokiej rozdzielczości do badania lokalizacji mRNA. Dziś można zmierzyć ruch nawet pojedynczej cząsteczki mRNA w skali czasowejms 23-26. Jednak tradycyjne podejścia biochemiczne, takie jak to opisane powyżej, są również pouczające i w niektórych przypadkach są preferowane. Izolacja biochemiczna umożliwia oczyszczanie dużego repertuaru mRNA i białek, a zatem jest preferowana w badaniach całego genomu. W pojedynczej izolacji można uzyskać wystarczając...

Komórki eukariotyczne są zorganizowane w odrębne przedziały o określonych funkcjach. Aby spełnić swoją funkcję, każdy przedział zawiera unikalny zestaw białek, które są niezbędne do jego aktywności. Możliwym mechanizmem, za pomocą którego białka te zbliżają się do swojego przedziału, jest miejscowa translacja1,2. W tym procesie białko jest syntetyzowane w miejscu przeznaczenia przez rybosomy i mRNA, które się tam znajdują. Wśród prawdopodobnych zalet miejscowej translacji jest zwiększona skuteczność celowania w białka, zmniejszone zapotrzebowanie na białka opiekuńcze i umożliwienie mechanizmów regulacji specyficznych dla miejsca. Ponadto zlokalizowane mRNA i rybosomy mogą być odizolowanym rezerwuarem maszynerii translacyjnej w przypadku stresu komórkowego, gdy ogólna translacja jest zahamowana.
Mitochondria stały się w ostatnich latach centralnym modelem do badania miejscowej translacji. Większość białek mitochondriów jest kodowana w jądrze, translowana w cytozolu i importowana do organelli. Różne dowody wskazują, że wiele z tych białek jest wytwarzanych w procesie lokalnej translacji. Początkowo badania mikroskopii elektronowej i frakcjonowania biochemicznego wykryły rybosomy związane z mitochondriami3-5. Badania te zostały następnie potwierdzone in vivo przez prace nad specyficznymi mRNA, które okazały się importowane tylko w sposób kotranslacyjny6,7. Badania całego genomu dotyczące związku mRNA z mitochondriami wykazały, że znaczna część mRNA jest zlokalizowana w pobliżu mitochondriów8-10. Niektóre z tych mRNA zostały dodatkowo scharakteryzowane metodami fluorescencji in vivo, takimi jak FISH lub mTAG9,11. Prosta interpretacja tego związku jest taka, że te mRNA służą jako szablony do zlokalizowanej translacji.
Mechanizmy, za pomocą których te mRNA zbliżają się do mitochondriów, są nieznane. Wykazano, że domeny niekodujące (przede wszystkim 3' UTR) są zaangażowane w asocjację mRNA z mitochondriami12. Domeny te mogą służyć jako miejsce wiązania białek wiążących RNA, które pośredniczą w ich transporcie. Badania na drożdżach wykazały, że członek rodziny białek PUM (Puf3) wspiera asocjację mRNA z mitochondriami8,13. Prawdopodobną rolą Puf3, która opiera się na funkcjach innych członków rodziny, jest hamowanie translacji, gdy mRNA jest w drodze14. W ten sposób mRNA mogą być transportowane w stanie nieulegającym translacji przez białka wiążące RNA, które oddziałują z regionami niekodującymi. Alternatywnie, duża część prac sugeruje, że transport zachodzi podczas syntezy białka. W szczególności wykazano, że inhibitory translacji wpływają na asocjację mRNA8,13. Ponadto wykazano, że translowane cechy, takie jak AUG, sekwencja kierowania mitochondrialnego (MTS) lub regiony ORF, pomagają w lokalizacji8,11,15. Wykazano również, że białko opiekuńcze z rodziny Hsp70 i receptor białkowy na zewnętrznej błonie mitochondriów wspierają asocjację mRNA, co dodatkowo sugeruje, że cechy kodowanego białka są ważne dla lokalizacji mRNA16. Jest to zgodne z modelem, w którym białko powstające z rybosomem służy jako element rozpoznający do kierowania kompleksu mRNA-rybosom-białko do mitochondriów17.
Zlokalizowane translacje w pobliżu mitochondriów badano różnymi metodami, w tym mikroskopią elektronową (w celu wizualizacji rybosomów)3, FISH9, zielonym RNA (w celu wykrycia specyficznych mRNA)11 oraz frakcjonowaniem biochemicznym (w celu wykrycia zarówno RNA, jak i rybosomów)10,18. Podczas gdy pierwsze metody wykrywają lokalizację in vivo i mogą umożliwiać wizualizację dynamiki transportu, druga pozwala na wykrycie wielu różnych mRNA w jednym eksperymencie. Ponadto w przypadku frakcjonowania biochemicznego domeny kodujące lub niekodujące nie muszą być zmieniane, dlatego można ocenić ich specyficzne role. Frakcjonowanie biochemiczne jest z powodzeniem stosowane od wielu lat, do izolacji wielu różnych przedziałów komórkowych. Jego zasady i ograniczenia są dobrze znane i można łatwo modyfikować istniejące protokoły do różnych celów. Niezbędne oprzyrządowanie jest standardem w wielu laboratoriach, dlatego jest to zwykle metoda pierwszego wyboru do badania lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Opisujemy protokół, który został zoptymalizowany pod kątem izolacji mRNA, podczas gdy rybosomy są związane z mitochondriami. Protokół ten jest zatem optymalny do badania czynników zaangażowanych w zlokalizowaną translację w pobliżu mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td> Bactopepton <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td></td><td></td><td>Nie autoklawuj</td></tr><tr><td>pożywki</td><td></td><td></td> wzrostowej <td>galaktozy Do wzbogacania mitochondriów należy użyć dowolnego niefermentującego źródła węgla, takiego jak pożywka wzrostowa na bazie galaktozy sterylizowana 1% ekstrakt drożdżowy, 2% baktopepton, 2% galaktoza</td></tr><tr><td>0,1 M Tris-HCl, pH 9,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl, pH 7,6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Bufor</td><td></td><td></td> DTT <td>0,1 M TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Odświeżaj za każdym razem</td></tr><tr><td>1,2 M Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; </td><td></td><td></td><td></td></tr> m <tr><td>filtr Bufor</td><td></td><td></td> zymoliazy <td>1,2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Przefiltruj ten bufor (0.2 &#956; m) i przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>Zymoliaza 20T</td><td></td><td></td><td>20 000 U/g</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>regeneracyjna Pożywka wzrostowa na bazie galaktozy uzupełniona 1 M Sorbitol</td></tr><tr><td>0,1 mg/ml Cykloheksymid (CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,6 M Mannitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mg/ml Heparyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> mannitolu <td>0,6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH 7,6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Dodaj na świeżo: 0,5 mg/ml heparyny, 0,1 mg/ml CHX i 1 mM (PMSF). Przefiltruj ten bufor i użyj go lodowato</td></tr><tr><td>zimny 8 M Guanidynium-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% i 70% Etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M Octan sodu, pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl roztwór</td><td></td><td></td><td></td>podstawowy</tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6,8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Merkaptoetanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol niebieski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% &#946;-merkaptoetanol i 0,02% błękit bromofenolowy</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce o pojemności 15 ml wyposażony w ściśle przylegający tłuczek</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mrna związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Większość białek mitochondrialnych jest zakodowana w jądrze i musi być importowana do organelli. Import może nastąpić, gdy białko jest syntetyzowane w pobliżu mitochondriów. Poparcie dla tej możliwości wynikają z ostatnich badań, w których wykazano, że wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest zlokalizowanych w pobliżu mitochondriów. Wraz z wcześniejszymi dowodami związku rybosomów z błoną zewnętrzną, wyniki te sugerują zlokalizowany proces translacji. Takie zlokalizowane tłumaczenie może poprawić wydajność importu, zapewnić unikalne miejsca regulacji i zminimalizować przypadki ekspresji ektopowej. Do scharakteryzowania czynników i elementów, które pośredniczą w tłumaczeniu zlokalizowanym, zastosowano różne metody. Standardem wśród nich jest frakcjonowanie subkomórkowe przez wirowanie różnicowe. Zaletą tego protokołu jest izolacja mRNA, rybosomów i białek w jednej procedurze. Można je następnie scharakteryzować za pomocą różnych metod molekularnych i biochemicznych. Co więcej, metody transkryptomiczne i proteomiczne mogą być stosowane do uzyskanego materiału, umożliwiając w ten sposób wgląd w cały genom. Wykorzystanie drożdży jako organizmu modelowego do takich badań ma zalety w postaci szybkości, kosztów i prostoty. Co więcej, zaawansowane narzędzia genetyczne i dostępne szczepy deleczujące ułatwiają weryfikację czynników kandydujących.

Niniejszy protokół umożliwia oddzielenie frakcji zawierającej mitochondria od składników cytozolu. Najlepszym sposobem sprawdzenia skuteczności tej procedury jest przeprowadzenie analizy northern oraz analizy western (Rycina 1) próbek z poszczególnych etapów izolacji. Na podstawie tych analiz wyznacza się trzy parametry jakości izolacji. Po pierwsze, sprawdza się, czy RNA lub białka w próbkach są nienaruszone – będą one widoczne jako wyraźne prążki w analizach. Procesy degradacji spowodują pojawienie się...

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów związanych z translującymi się mRNA. Osiąga się to najpierw poprzez zebranie komórek drożdży hodowanych w warunkach wzbogacających w mitochondria. Drugim krokiem jest delikatna liza komórek w obecności cykloheksyloimidolidu.Następnie mitochondria zostają oddzielone od komponentów rozpuszczalnych za pomocą wirowania różnicowego. Ostatnim etapem jest ekstrakcja RNA z mitochondriów oraz próbek kontrolnych. W końcowej fazie wykorzystuje się analizę northern, aby wykazać czystość i jakość RNA związanego z mitochondriami.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyizolowania wielu rodzajów RNA w ramach jednej preparatyki. Dzięki temu można przeprowadzić analizę porównawczą. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak kierowanie wewnątrzkomórkowe oraz funkcja organelli.W tej procedurze mitochondria zostaną oczyszczone z 100 do 150 ml komórek drożdży wyhodowanych do OD 600 od 1 do 1,5 w temperaturze 30 °C na niefermentowalnej pożywce wzrostowej. Komórki należy wirować przy 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz, a osad przemyć wodą dwukrotnie desty

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu badania mechanizmów zlokalizowanych procesów translacji

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Mitochondria mają wyspecjalizowane rybosomy, które różnią się od swoich bakteryjnych i cytoplazmatycznych odpowiedników. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mitoribosomy można uzyskać z ich natywnego przedziału w komórkach HEK. Metoda polega na izolacji mitochondriów z komórek zawiesinowych, a następnie oczyszczeniu mitoribosomów.

Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Ta praca wyjaśnia, jak przekształcić mitochondria drożdży za pomocą metody biolistycznej. Pokazujemy również, jak selekcjonować i oczyszczać transformanty oraz jak wprowadzić pożądaną mutację w docelowej pozycji w genomie mitochondrialnym.

Transformacja mitochondrialna w drożdżach piekarskich w celu zbadania translacji i składania kompleksów oddechowych

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę izolacji mRNA związanych z mitochondriami drożdży przy użyciu frakcjonowania różnicowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów translacji zlokalizowanej w biologii komórki.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Przeglądaj więcej filmów