Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów związanych z translującymi się mRNA. Osiąga się to najpierw poprzez zebranie komórek drożdży hodowanych w warunkach wzbogacających w mitochondria. Drugim krokiem jest delikatna liza komórek w obecności cykloheksyloimidolidu.

Następnie mitochondria zostają oddzielone od komponentów rozpuszczalnych za pomocą wirowania różnicowego. Ostatnim etapem jest ekstrakcja RNA z mitochondriów oraz próbek kontrolnych. W końcowej fazie wykorzystuje się analizę northern, aby wykazać czystość i jakość RNA związanego z mitochondriami.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyizolowania wielu rodzajów RNA w ramach jednej preparatyki. Dzięki temu można przeprowadzić analizę porównawczą. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak kierowanie wewnątrzkomórkowe oraz funkcja organelli.

W tej procedurze mitochondria zostaną oczyszczone z 100 do 150 ml komórek drożdży wyhodowanych do OD 600 od 1 do 1,5 w temperaturze 30 °C na niefermentowalnej pożywce wzrostowej. Komórki należy wirować przy 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz, a osad przemyć wodą dwukrotnie destylowaną i ponownie odwirować.

Po odlaniu nadsączu należy zważyć osad komórkowy. Z 100 mililitrów zawiesiny komórek zazwyczaj otrzymuje się około 0,6 grama osadu. Następnie należy resuspendować osad w buforze DTT w ilości 1 mililitr na każde 0,5 grama komórek.

Ważne jest potraktowanie komórek środkiem redukującym w celu zerwania mostków dwusiarczkowych w ścianie komórkowej, co poprawia hydrolizę. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 30 °C przy delikatnym wstrząsaniu. Następnie wirować komórki z prędkością 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz i resuspender osad.

W jednym mililitrze buforu xmal liase na 0,15 grama komórek nie stosować wortexowania. Zmierzyć OD 600 dla 10 µL alikwoty komórek w 990 µL wody i zapisać tę wartość. Dodać świeżo przygotowany xmal liase do komórek, aby zhydrolizować polimery glukozy w wiązaniach beta 1-3 glukanu i wytworzyć sferoplasty.

Od tego momentu sferoplasty należy przechowywać w roztworze izotonicznym, aby uniknąć lizy; inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C przy delikatnym wstrząsaniu. Aby zweryfikować hydrolizę ściany komórkowej i powstanie sferoplastów, zmieszać 10 µL komórek z 990 µL wody i zmierzyć OD 600. Oczekuje się, że sferoplasty ulegną lizie z powodu różnicy osmotycznej, a wartość OD 600 powinna być co najmniej dziesięciokrotnie niższa od wartości ustalonej przed dodaniem xmal liase. W przeciwnym razie należy kontynuować inkubację z xmal liase przez kolejne 15 minut.

Resuspender PHE Plast w 100 mililitrach pożywki regeneracyjnej i przenieść sferę plast do kolby typu Helen Meyer. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy potrząsaniu. Ten etap regeneracji jest niezbędny, ponieważ podczas traktowania XYs translacja zostaje zatrzymana, a lokalizacja mRNA zaburzona.

Po jednej godzinie dodać 0,1 mg/mL cykloheksymidy i przenieść sferoplastach do schłodzonych wcześniej stożkowych probówek o pojemności 50 mL. Dodanie cykloheksymidy jest istotne w celu zablokowania asocjacji rybosomów z mRNA. Dzięki temu utrzymana zostaje zależna od rybosomów asocjacja mRNA z mitochondriami.

Wirować sfery plazmy z prędkością 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i przemyć dwukrotnie zimnym buforem mannitolowym.

Resuspender sferoplasty w 4 mL zimnego buforu mannitolowego i przenieść zawiesinę do homogenizatora o pojemności 15 mL wyposażonego w ściśle dopasowany tłuczek. Delikatnie rozbić sferoplasty za pomocą 15 pociągnięć i przenieść lizat do probówki o pojemności 13 mL. Odwirować lizat z prędkością 1 500 ×g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.

Aby odwirować jądra i nieuszkodzone komórki. Ostrożnie przenieść nadsącz do nowej probówki. Odstawić 1 mL lub 25% próbki jako próbkę niefrakcjonowaną lub całkowitą.

Przenieś 50 µL tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 µL four XLSB. Do analizy western blot z krwi, z pozostałej części całkowitej próbki zostanie wytrącone RNA do analizy northern blot oraz analizy mikromacierzowej. Odwiruj nadsącz z prędkością 10 000 ×g.

Wirowanie w polu grawitacyjnym przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Abyt osadzić mitochondria, przenieść nadsącz do nowej probówki i przechowywać go w lodzie. Jest to frakcja cytozolowa.

Przenieś 50 µL tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 µL buforu XLSB. W celu przeprowadzenia analizy western blot, RNA zostanie wytrącone z pozostałej części próbki cytozolu do analiz northern i mikromacierzy. Przemyj osad trzema ml mannitolu w buforze i ponownie odwiruj przy 10 000 ×g.

Wirowanie w polu grawitacyjnym przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie osad resuspenderować w 3 mL buforu mannitolowego. Próbka ta zawiera mitochondria i jest określana jako frakcja mitochondrialna.

Przenieś 50 µL tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 µL buforu XLSB do analizy Western blot. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do każdej próbki jedną objętość 8 M guanidyny, HCEL oraz dwie objętości 100% etanolu, wymieszaj w wirówce typu vortex i inkubuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze -20 °C. Odwiruj próbki z prędkością 10 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Odlej nadsącz. Należy zachować ostrożność, ponieważ osad może być niestabilny. Po przemyciu osadu 70% ethanolem, resuspenduj go w 400 µL wody wolnej od RNaz i przenieś próbkę do nowej probówki typu Eppendorf.

Ponownie wytrąć RNA, dodając 0,1 objętości trzy molarnego octanu sodu pH 5,2 oraz dwie objętości 100% etanolu, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze -20 °C. Próbki wirować z prędkością 20 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Odlej nadsącz i przemyj osad 70% ethanol. Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zawieś go w wodzie wolnej od RNaz. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -80 °C.

Próbki mogą zostać następnie wykorzystane do analizy northern lub mikroarray. Aby przygotować RNA do analizy mikroarray, w pierwszej kolejności każdą pelletkę mRNA otrzymaną po wytrącaniu w HCl z guanidyną i etanolem należy zawiesić w 650 µL wody wolnej od RNaz i przenieść do probówki z nakrętką. Następnie należy dodać 650 µL kwaśnego fenolu z chloroformem, intensywnie wymieszać w wstrząsarku typu vortex i wirować z maksymalną prędkością przez dwie minuty.

Przenieś 500 µL górnej fazy wodnej do nowej probówki. Należy unikać pobierania interfazy, ponieważ zawiera ona DNA. Należy również uważać, aby nie pobrać fenolu, który może hamować reakcję odwrotnej transkrypcji.

Usuń heparynę z próbki RNA poprzez wytrącanie chlorkiem litu. Dodaj chlorek litu do stężenia końcowego 2 M i inkubuj próbki przez noc w temperaturze -20 °C. Następnego dnia rozmroź próbki w temperaturze 4 °C i odwiruj z prędkością 20 000 ×g.

Wirowanie w polu grawitacyjnym przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odlać nadsącz i wyprać osad w 80% ethanolu w wirówce. Ponownie odlać nadsącz, wysuszyć na powietrzu i zawiesić osad w 150 microliters wody wolnej od RNA; aby usunąć wszelkie pozostałości osadu chlorku litu, ponownie zastosować 0,1 objętości trzy molarnego octanu sodu pH 5.3 oraz trzy objętości 100% Ethanolu, a następnie inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.

Wiruj z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przemyj przezroczysty osad 80% etanolem i wysusz na powietrzu. Na koniec resuspenduj osad w 25 µL wody wolnej od RNaz i przechowuj próbki w temperaturze -80 °C.

Skuteczność niniejszego protokołu w oddzielaniu frakcji zawierającej mitochondria od komponentów cytozolowych najlepiej zweryfikować, przeprowadzając analizę Northern oraz analizę Western na próbkach pobranych na różnych etapach izolacji. W tym przykładzie próbki pochodziły z etapu przed frakcjonowaniem (frakcja całkowita), z frakcji cytozolowej oraz z frakcji mitochondrialnej. Analizę Northern przeprowadzono dla następujących mRNA: COB oraz RNA.

Jest to transkrybowane wewnątrz mitochondriów; CO1 to mRNA kodujące białko importowane do mitochondriów, ACT1 to mRNA kodujące cytozolowe białko aktyny, a SEC61 to mRNA kodujące białko rezydujące w ER. Dolny panel przedstawia barwienie błękitem metylenowym membrany northern, na której wykryto dwa wyraźne prążki RNA: 25 s oraz 18 s.

Ponieważ COB jest transkrybowany wewnątrz mitochondriów, jego sygnał powinien występować wyłącznie w mitochondriach, co zaobserwowano w niniejszym badaniu. Pojawienie się COB w frakcji cytozolowej będzie wskazywać na lizę mitochondriów podczas przygotowania próbek.

ACO1 koduje białko importowane do mitochondriów, które występuje głównie w frakcji mitochondrialnej. ACT1 koduje białko cytozolowe, w związku z czym występuje ono głównie w frakcji cytozolowej. Obecność SEC61 w frakcji mitochondrialnej wskazuje na obecność komponentów ER w tej frakcji.

Sygnały RNA występują w obu frakcjach, co wskazuje na obecność rybosomów. Analizę Westerna przeprowadzono dla następujących białek: POR1 (białko błony zewnętrznej mitochondriów), COX4 (białko mitochondrialne), GAPDH (białko cytozolowe), CALR (białko ER) oraz RPL39 (białko rybosomalne). Zgodnie z oczekiwaniami, sygnał POR1 wykryto wyłącznie we frakcji mitochondrialnej.

Wykrycie sygnału POR1 w frakcji cytozolowej sugerowałoby dysocjację komponentów mitochondrialnych podczas przygotowania próbek. Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, hxK1 został wykryty wyłącznie we frakcji cytozolowej. Silny sygnał CUE1 we frakcji mitochondrialnej wskazuje, że we frakcji mitochondrialnej współizolowane są znaczne ilości materiału związanego z ER.

Może to być wynik znanych kontaktów fizycznych między ER a mitochondriami. Sygnał RPL 39 pojawia się w obu frakcjach, co ponownie potwierdza obecność rybosomów w obu frakcjach; pominięcie etapu odzyskiwania w procedurze skutkuje zniknięciem rybosomów z frakcji M, co wpłynie na asocjację mRNA z mitochondriami. Oprócz weryfikacji jakości separacji między komponentami mitochondrialnymi a cytozolowymi, ważne jest potwierdzenie, że RNA lub białka w próbkach są nienaruszone i nie doszło do znacznych strat RNA lub białek podczas przygotowania próbek.

Nienaruszone RNA i białka powinny być wykrywane jako wyraźne prążki w analizach, tak jak pokazano tutaj. W przypadku mRNA c CCP, które koduje białko importowane do mitochondriów, pojawienie się dodatkowych krótszych prążków lub rozmyć będzie wskazywać na degradację. Poważne ubytki skutkowałyby znaczną różnicą między całkowitą a względną ilością sygnału, czego w ogólnym rozrachunku nie zaobserwowano.

Wyniki te potwierdzają, że niniejszy protokół jest skuteczną metodą izolacji mRNA, rybosomów i białek w ramach jednej procedury. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić analizy obejmujące cały genom, takie jak RNA-Seq lub analiza proteomiczna, w celu zidentyfikowania kluczowych i unikalnych cech funkcji organelli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu izolacji RNA związanego z mitochondriami.