Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mitochondriów związanych z translacją mRNA. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie komórek drożdży wyhodowanych w warunkach wzbogacających mitochondria. Drugim krokiem jest delikatne upiększanie komórek w obecności cyclo heide.

Następnie mitochondria są oddzielane od rozpuszczalnych składników przez wirowanie różnicowe. Ostatnim etapem jest ekstrakcja RNA z mitochondriów i próbek kontrolnych. Ostatecznie analiza północna służy do wykazania czystości i jakości RNA związanego z mitochondriami.

Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednym preparacie można wyizolować wiele rodzajów RNA. W związku z tym można przeprowadzić analizę porównawczą. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak celowanie wewnątrzkomórkowe i funkcja narządów.

W tej procedurze mitochondria zostaną oczyszczone od 100 do 150. Mililitry komórek drożdży wyhodowanych do OD 600 od jednego do 1,5 w temperaturze 30 stopni Celsjusza na niefermentującym wzroście. Średni. Odwirować komórki pod 3000-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant i ponownie przemyć osad wirówką z podwójnie destylowaną wodą.

Po odrzuceniu supernatantu zważyć osad komórkowy. Zwykle ze 100 mililitrów komórek uzyskuje się około 0,6 grama. Resus zawiesić pastylkę w jednym mililitrze buforu DTT na 0,5 grama komórek.

Ważne jest, aby potraktować komórki środkiem redukującym w celu zerwania wiązań dissiarczkowych w ścianie komórkowej, poprawiając w ten sposób hydrolizę, inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem. Następnie odwiruj komórki pod 3000-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad.

W jednym mililitrze xmal buforu liazy na 0,15 grama komórek nie dochodzi do wirowania. Zmierz OD 600 z 10 mikrolitrowej podwielokrotności komórek w 990 mikrolitrach wody i zapisz tę wartość. Dodaj świeżo przygotowaną liazę xmal do komórek, aby hydrolizować polimery glukozy w wiązaniach beta jeden trzy glukan i wytworzyć Sphero plast.

Od tego momentu Sphero plast należy przechowywać w roztworze izotonicznym, aby uniknąć lizy, inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Aby zweryfikować hydrolizę ściany komórkowej i sfery wytwarzania plastu, wymieszaj 10 mikrolitrów komórek z 990 mikrolitrami wody i zmierz OD 600 Płytki Sphero powinny ulegać z powodu różnicy osmotycznej, a OD 600 powinno być co najmniej dziesięciokrotnie mniejsze niż wartość określona przed dodaniem xmal liazy. Jeśli nie, kontynuuj inkubację z xmal liase przez kolejne 15 minut.

Ponownie zawiesić PHE Plast za pomocą 100 mililitrów pożywki regeneracyjnej i przenieść kulę plastu do kolby Helen Meyer. Inkubować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Ten etap rekonwalescencji jest konieczny, ponieważ translacja zostaje zatrzymana, a lokalizacja mRNA zostaje zakłócona podczas leczenia XYs.

Po godzinie dodaj 0,1 miligrama na mililitr, cyclo heide i przenieś Sphero plast do wstępnie schłodzonych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Edycja Cyclo Heide jest ważna dla zamrożenia związku rybosomów z mRNA. W ten sposób utrzymywane jest zależne od rybosomów asocjacja mRNA z mitochondriami.

Wirówka, kula plass o 3000 razy większej grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić sklarowany osad i przemyć dwukrotnie zimnym mannitolem. Bufor reus.

Zawiesić sferę plass za pomocą czterech mililitrów zimnego buforu manitol i przenieść zawiesinę do homogenizatora puchowego o pojemności 15 mililitrów wyposażonego w ciasno dopasowany tłuczek. Delikatnie rozbij kulę plass 15 pociągnięciami i przenieś lizat do 13-mililitrowej probówki. Odwiruj lizat przy 1500-krotności grawitacji przez sześć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Do granulowania jąder i nieuszkodzonych komórek. Ostrożnie przenieś super natin do nowej tuby. Odłóż na bok jeden mililitr lub 25% próbki jako próbkę niefrakcjonowaną lub całkowitą.

Przenieś 50 mikrolitrów tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 mikrolitrów czterech XLSB. W przypadku zachodniej analizy krwi RNA zostanie wytrącone z reszty całej próbki do analiz północnych i mikromacierzy. Odwiruj super natin 10 000 razy.

Grawitacja przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Aby opluć mitochondria, przenieś super natynę do nowej rurki i trzymaj ją na lodzie. To jest frakcja cytozolowa.

Przenieś 50 mikrolitrów tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 mikrolitrów czterech XLSB. W przypadku analizy western blot RNA zostanie wytrącone z reszty próbki cytozolowej do analiz północnych i mikromacierzy. Przemyć osad trzema mililitrami mannitolu, buforować i ponownie odwirować 10 000 razy.

Grawitacja przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Reus zawiesić osad z trzema mililitrami buforu mannitolu. Ta próbka zawiera mitochondria i jest określana jako frakcja mitochondriów.

Przenieś 50 mikrolitrów tej próbki do nowej probówki i dodaj 15 mikrolitrów czterech XLSB do analizy Western blot. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do każdej próbki jedną objętość ośmiu molowych guad dium, HCEL i dwie objętości wiru 100% etanolu i inkubuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować próbki pod ciśnieniem 10 000 razy większym niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Bądź ostrożny, ponieważ pellet może być niestabilny. Po umyciu osadu 70% etanolem reus, zawiesić osad w 400 mikrolitrach wolnej wody RNA i przenieść próbkę do nowej probówki einor.

Ponownie wytrącić RNA, dodając 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i dwie objętości wiru 100% etanolu i inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować próbki 20 000 razy. Grawitacja przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Wyrzucić supernatant i przemyć 70% etanolem. Wysuszyć na powietrzu granulat i zawiesić resus z RNA wolną od wody RNA. Próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Próbki mogą być następnie wykorzystane do analiz północnych lub mikromacierzy. Aby przygotować RNA do analizy mikromacierzy, najpierw zawiesić każdą osadkę MRNA uzyskaną z wytrącania guin HCL i etanolu z 650 mikrolitrami wolnej wody RNA i przenieść do zakręcanej probówki orph. Następnie dodaj 650 mikrolitrów kwaśnego chloroformu fenolowego i energicznie wiruj z maksymalną prędkością przez dwie minuty.

Przenieś 500 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki. Unikaj przyjmowania interfazy, ponieważ zawiera ona DNA. Należy również uważać, aby unikać przyjmowania fenolu, który może hamować reakcję odwrotnej transkrypcji.

Usunąć heparynę z próbki RNA przez wytrącanie chlorku litu. Dodać chlorek litu do końcowego stężenia dwóch molowców i inkubować próbki przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza następnego dnia. Rozmrozić próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirować 20 000 razy.

Grawitacja przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie wyrzuć sklarat i umyj osad wirówką do 80% etanolu. Ponownie wyrzuć szwadron na sucho i ponownie zawieś osad W 150 mikrolitrach RNA wolnej wody, aby usunąć resztki chlorku litu, ponownie wytrącić się 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu pH 5,3 i trzech objętościach 100% etanolu inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.

Wirować na najwyższych obrotach przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dokładnie umyj przezroczysty granulat 80% etanolem i wysusz na powietrzu. Na koniec ponownie zasymij osad 25 mikrolitrami wolnej wody RNA i utrzymuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Sukces tego protokołu w oddzielaniu mitochondriów zawierających frakcję od składników cytozolowych najlepiej testuje się, przeprowadzając analizę północną i zachodnią na próbkach z różnych etapów izolacji. W tym przykładzie próbki pochodziły sprzed frakcjonowania lub frakcji całkowitej, frakcji cytozolowej i frakcji mitochondrialnej. Analizę północną przeprowadzono dla następujących mRNA, COB i RNA.

Jest to transkrybowane wewnątrz mitochondriów, CO i MRNA, które koduje białko importowane do mitochondriów. CT, Mr.Nna, który koduje cytozolowe białko aktynowe i SEC 61, M nna, który koduje białko rezydentne ER. Dolny panel to niebieskie zabarwienie błony północnej, w którym wykryto dwa wyraźne pasma RNA 25 s i 18 s.

Ponieważ COB jest transkrybowany wewnątrz mitochondriów, jego sygnał powinien znajdować się wyłącznie w mitochondriach. Jak zaobserwowano w tym badaniu. Pojawienie się COB we frakcji cytozolowej będzie wskazywać na lizę mitochondriów podczas przygotowania.

ACO one koduje białko, które jest importowane do mitochondriów i pojawia się głównie we frakcji mitochondrialnej. Tomografia komputerowa koduje białko cytozolowe i dlatego pojawia się głównie we frakcji cytozolowej. Obecność SEC 61 we frakcji mitochondrialnej wskazuje na obecność składników ER w tej frakcji.

Sygnały RNA pojawiają się w obu frakcjach, co wskazuje na obecność rybosomów. Analizę zachodnią przeprowadzono dla następujących białek: mitochondriów POR one A, białka błony zewnętrznej hx, K one A, białka cytozolowego CUE one one oraz białka ER i RPL 39. Białko rybosomalne zgodnie z oczekiwaniami POR jeden sygnał wykryto tylko we frakcji mitochondrialnej.

Gdyby we frakcji cytozolowej wykryto jeden sygnał POR, sugerowałoby to dysocjację składników mitochondrialnych podczas przygotowania. Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, hx K one wykryto tylko we frakcji cytozolowej. Silny sygnał CUE one we frakcji mitochondrialnej wskazuje, że znaczne ilości materiału związanego z ER są koizolowane we frakcji mitochondrialnej.

Może to być wynikiem znanych kontaktów fizycznych między ER a mitochondriami. Sygnał RPL 39 pojawia się w obu frakcjach, ponownie potwierdzając obecność rybosomów w obu frakcjach, wyłączenie etapu odzyskiwania z zabiegu skutkuje zanikiem rybosomów z frakcji M, co wpłynie na asocjację mRNA z mitochondriami. Oprócz sprawdzenia jakości separacji między składnikami mitochondrialnymi i cytozolowymi, ważne jest potwierdzenie, że RNA lub białka w próbkach są nienaruszone i nie ma poważnych strat RNA lub białek podczas przygotowywania próbki.

Nienaruszone RNA i białka powinny być wykrywane jako odrębne prążki w analizach, jak pokazano tutaj. W przypadku c CCP jedno mRNA, które koduje białko importowane do mitochondriów, pojawienie się dodatkowych krótszych prążków lub rozmazów będzie wskazywać na degradację. Poważne straty spowodują znaczną różnicę między całkowitą a względną ilością sygnału, która nie została zaobserwowana, razem wzięta.

Wyniki te potwierdzają, że protokół ten jest skuteczną metodą izolacji mRNA, rybosomów i białek w jednej procedurze. Po tej procedurze można przeprowadzić metody obejmujące cały genom, takie jak sekwencja RNA lub analiza proteomiczna, w celu zidentyfikowania kluczowych i unikalnych cech funkcji narządów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować RNA związane z mitochondriami.