Name: Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza myszy. Technika mikrochirurgiczna umożliwia uzyskanie czystych kolonii komórkowych do badań nad regeneracją tkanek zębowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Xiu-Ping Wangowi za początkową pomoc w kulturach DESC. Autorzy są częściowo finansowani ze stypendiów i grantów z National Institutes of Health (K99-DE022059 dla A.H.J., K12-GM081266 dla M.G.C., K08-DE022377-02 dla O.H. i R01-DE021420 dla O.D.K.).

1. Sekcja dolnych półżuchw od dorosłej myszy
<ol>
	<li>Przed wykonaniem tego protokołu należy uzyskać niezbędną zgodę instytucjonalną i upewnić się, że przestrzegasz wszystkich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami. Poddaj zwierzę eutanazji przy użyciu standardowych procedur zatwierdzonych przez IACUC. Do tej pracy zastosowano uduszenieCO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
	<ol>
		<li>OPCJONALNIE: Oddziel głowę od reszty ciała za pomocą żyletki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń skórę od dolnej wargi do dekoltu.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie między dwoma dolnymi siekaczami, które są luźno połączone. Po zastosowaniu nacisku żuchwa zostanie podzielona na dwie połowy.</li>
	<li>Zaklinuj skalpel między kłykciem szczęki a skroniowym stawem żuchwowym i przetnij wzdłuż mięśnia żuchwy, aby odłączyć szczękę.</li>
	<li>Usuń wszystkie mięśnie, ścięgna i więzadła, aż pozostanie tylko kość.</li>
</ol>
2. Odizoluj siekacz
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela #15 ostrożnie ogol kość pod kątem 45° od dystalnego końca do bliższego końca błoniastego. Użyj końcówki skalpela, aby usunąć pozostałą kość, w tym fragmenty kości na krawędzi. Powoli zacznij dłubać w językowej płytce korowej żuchwy, zaczynając tuż poniżej 3zęba trzonowego.</li>
	<li>Kontynuuj, aż siekacz będzie czysty, ostrożnie pracując w kierunku obszaru, w którym znajduje się CL.</li>
	<li>Usuń dolny pęczek nerwu wyrostka zębodołowego.</li>
	<li>Wykonaj czyste cięcie, aby najpierw usunąć kość i tkanki proksymalnie do CL.</li>
	<li>Wykonaj drugie cięcie dystalnie skalpelem, mniej więcej poniżej 2. zęba trzonowego. Obszar siekacza bliższego jest następnie wycinany poprzez wprowadzenie skalpela między kość a przyśrodkową powierzchnię siekacza bliższego. Należy to zrobić ostrożnie, aby nie rozerwać tkanki. Ruch nacięcia jest proksymalno-dystalny. 
	ALTERNATYWNY KROK: 
	Usuń jak najwięcej kości wzdłuż obszaru nad siekaczem. Po oczyszczeniu obszaru ostrożnie usuń cały siekacz za pomocą kleszczy w rozmiarze 5, aby zająć się częścią szkliwa znajdującą się najbliżej obszaru CL.</li>
	<li>Umieść wypreparowaną tkankę (izolowaną CL, jak na rysunku 3E, lub cały siekacz, jak w alternatywnym kroku 2.5) w 2% kolagenazie w 1X PBS przez 3-4 godziny w temperaturze 4 °C na płytce o niskiej przyczepności. W przypadku siekaczy 1-10 należy użyć 100 μl na studzienkę w płytce 12-dołkowej. W przypadku więcej niż 10 siekaczy należy użyć 500 μl na studzienkę w 6-dołkowej płytce o niskiej przyczepności.</li>
</ol>
3. Mikropreparowanie wargowej pętli szyjnej
<ol>
	<li>Usuń obszar CL z kolagenazy i umieść w zimnym podłożu DMEM/F12.</li>
	<li>Delikatnie pociągnij dolny koniec CL za pomocą kleszczy w rozmiarze 5 lub strzykawki insulinowej (1 cm3, 28 G 1/2); mezenchyma rozpadnie się, podczas gdy nabłonek pozostanie nienaruszony. Widoczny będzie CL i przylegający do niego nabłonek, który rozciąga się bocznie jako struktura przypominająca "skrzydło".</li>
	<li>Usuń pączek wierzchołkowy z sąsiedniego nabłonka, wykonując nacięcie w kształcie litery V po obu stronach i natychmiast umieść w zimnym DMEM/F12 na lodzie.</li>
	<li>Powtórz dla wszystkich CL, zbierz w 1,5 ml probówce do mikrofuge.</li>
	<li>Zakręć probówkę do mikrofuge z próbkami, usuń pożywkę, zastąp 100 μl roztworu do oddzielania komórek.</li>
	<li>Inkubować tkanki w roztworze do oddzielania komórek przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dysocjuj tkanki, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o niskiej przyczepności 1 000 μl. Komórki można również umieścić w sterylnym sitku do komórek, aby uzyskać dysocjację.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, płytki na plastikowej hodowli tkankowej lub innym pożądanym materiale.</li>
</ol>
4. Pierwotna kultura DESC
<ol>
	<li>Komórki płytki w 6-dołkowej płytce o stężeniu 1-6 x 104 komórki/ml w pożywce DESC, która składa się z DMEM/F12 uzupełnionego rekombinowanym białkiem EGF myszy w stężeniu 20 ng/ml, białka rekombinowanego FGF w stężeniu 25 ng/ml, 1X suplement B27 i 1% roztwór antybiotyku (penicylina, 100 U/ml, streptomycyna, 50 μg/ml).</li>
	<li>Hodować komórki posiane na 6-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w 1 ml pożywki DESC. Nie należy zakłócać początkowych hodowli przez 5 dni po posiewie, aby umożliwić adhezję komórek i tworzenie kolonii.</li>
	<li>Przy pierwszej wymianie nośnika należy wymienić połowę objętości (500 μl) starego nośnika na połowę objętości (500 μl) nowego nośnika. Sprawdź kolonie pod mikroskopem podczas zmiany pożywki.</li>
	<li>Po pierwszej zmianie pożywki należy kontynuować wymianę pożywki (1-2 ml) co 2 dni. Sprawdź kolonie pod mikroskopem podczas zmiany pożywki.</li>
</ol>
5. Opisy przejścia
<ol>
	<li>Odessać pożywkę i umyć komórki 3x wstępnie podgrzanym PBS.</li>
	<li>Dodaj wstępnie podgrzaną 0,25% trypsynę-EDTA w roztworze soli fizjologicznej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut, aby DES się odczepiły.</li>
	<li>Dodaj pożywkę DESC, aby zneutralizować trypsynę, delikatnie pipetuj wzdłuż płytki do hodowli tkankowej, aby zebrać komórki i umieść w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wiruj komórki przy 800 x g przez 2 min.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpe, P. T., Young, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test-tube+teeth.%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">Test-tube teeth.</a> Sci Am. 293, 34-41 (2005).</li>
<li>D'Souza, R. N., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanisms+that+lead+to+supernumerary+teeth+in+mice+and+men%3A+Current+concepts+and+novel+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches.</a> Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).</li>
<li>Jernvall, J., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+shape+formation+and+tooth+renewal%3A+evolving+with+the+same+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals.</a> Development. 139, 3487-3497 (2012).</li>
<li>Yen, A. H., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+Tissue+Regeneration+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Dental Tissue Regeneration A Mini-Review.</a> Gerontology. 57, 85-94 (2011).</li>
<li>Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecules+to+mastication%3A+the+development+and+evolution+of+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development.</a> WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).</li>
<li>Wang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+gene+regulatory+network+controls+stem+cell+proliferation+in+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth.</a> PLoS Biol. 5, (2007).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Dev Cell. 23, 317-328 (2012).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137, 3753-3761 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> Anat Rec. 183, 523-561 (1975).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cell+turnover+in+the+enamel+organ+of+the+rat+incisor.+Evidence+for+ameloblast+death+immediately+after+enamel+matrix+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion.</a> Anat Rec. 187, 63-98 (1977).</li>
<li>Parsa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+FGFR2b+controls+the+regenerative+capacity+of+adult+mouse+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors.</a> Development. 137, 3743-3752 (2010).</li>
<li>Chang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+multilineage+differentiation+of+mouse+dental+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).</li>
<li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+represses+Ink4a%2FArf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).</li>
<li>Hwang, W. S., Tonna, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+Analysis+of+Labeling+Indices+and+Migration+Rates+of+Cellular+Component+of+Mouse+Incisors+Using+Tritiated+Thymidine+%28H3tdr%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr).</a> J Dent Res. 44, 42-53 (1965).</li>
<li>Li, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+regulates+the+behavior+and+fate+of+epithelial+stem+cells+and+their+progeny+in+the+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor.</a> Dev Biol. 366, 357-366 (2012).</li>
<li>Smith, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+chemical+events+during+enamel+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and chemical events during enamel maturation.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).</li>
<li>Lapthanasupkul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ring1a%2Fb+polycomb+proteins+regulate+the+mesenchymal+stem+cell+niche+in+continuously+growing+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors.</a> Dev Biol. 367, 140-153 (2012).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+mouse+incisor+with+two-dimensional+and+three-dimensional+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).</li>
<li>Kawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+dental+epithelial+cell+line+%28HAT-7%29+and+the+cell+differentiation+dependent+on+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway.</a> Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).</li>
<li>Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+a+viable+suspension+of+postembryonic+human+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells.</a> J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+epidermal+cells+from+embryonic+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin.</a> Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).</li>
<li>Fusenig, N. E., Worst, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+epidermal+cell+cultures.+I.+Isolation+and+cultivation+of+epidermal+cells+from+adult+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin.</a> J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6, 331-343 (1975).</li>
<li>Barrandon, Y., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+clonal+types+of+keratinocyte+with+different+capacities+for+multiplication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).</li>
<li>Blanpain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal%2C+multipotency%2C+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118, 635-648 (2004).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).</li>
<li>Nowak, J. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of epithelial stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+the+multiplication+of+cultured+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes.</a> Nature. 265, 421-424 (1977).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Lesuisse, C., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+mouse+cortical+neurons+as+a+model+for+neuronal+development%2C+aging%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death.</a> J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).</li>
<li>Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+is+required+for+the+survival+of+epithelial+stem+cells+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor.</a> Differentiation. 80, 241-248 (2010).</li>
<li>Fujimori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+dental+mesenchyme+regulates+incisor+development+by+regulating+Bmp4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4.</a> Dev Biol. 348, 97-106 (2010).</li>
<li>Klein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF+signaling+loop+sustains+the+generation+of+differentiated+progeny+from+stem+cells+in+mouse+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors.</a> Development. 135, 377-385 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Komórki nabłonkowe zostały po raz pierwszy z powodzeniem wyhodowane ponad 40 lat temu21-24, a ostatnio udana izolacja nabłonkowych komórek macierzystych25-27 poszerzyła naszą wiedzę na temat biologii nabłonka. Przedstawiamy protokół izolacji DES siekacza dorosłej myszy, stosunkowo słabo zbadanej populacji komórek macierzystych, która może dostarczyć ważnych informacji na temat biologii stomatologicznej i tworzenia szkliwa. Protokół ten początkowo opierał się na wcześniejszych doniesieniach o izolacj...

Jedną z unikalnych cech kręgowców jest ewolucja zębów. Ząb stał się ważnym systemem modelowym dla wielu obszarów badań, ponieważ szlaki molekularne i specjalizacje morfologiczne związane z tym narządem były badane z kilku perspektyw, w tym przez biologów rozwojowych i ewolucyjnych5. Ostatnio medycyna regeneracyjna zaczęła zdobywać cenne informacje na temat zęba jako modelu. W szczególności odkrycie komórek macierzystych nabłonka zębów było ważnym postępem6-13.
Wszystkie gryzonie posiadają stale rosnące siekacze, których wzrost jest napędzany przez komórki macierzyste, co czyni te zęby dostępnym systemem modelowym do badania regulacji dorosłych komórek macierzystych. Eksperymenty znakowania w latach 1970-tych10,11, a następnie eksperymenty śledzenia linii genetycznej8,9,12,14 wykazały, że DES znajdują się w bliższym obszarze siekacza. Potomstwo komórek macierzystych w przedziale nabłonkowym po stronie wargowej wychodzi z przypuszczalnej niszy, znanej jako wargowa pętla szyjna (CL) i przyczynia się do populacji komórek zwanych komórkami wzmacniającymi tranzyt (T-A) (ryc. 1). W szczególności DES znajdują się w zewnętrznym nabłonku szkliwa (OEE) i siateczce gwiaździstej (SR)8,9,14, a wewnętrzny nabłonek szkliwa (IEE) powoduje powstanie komórek T-A, które przechodzą przez ograniczoną liczbę cykli komórkowych, a następnie poruszają się dystalnie wzdłuż długości siekacza (ryc. 1). Różnicujące się ameloblasty w siekaczu myszy nadal poruszają się dystalnie wzdłuż siekacza z niezwykłą szybkością około 350 μm w ciągu jednego dnia15,16. Podczas ruchu komórki różnicują się w dojrzałe ameloblasty i komórki warstwy pośredniej (SI). Po zdeponowaniu całej grubości macierzy szkliwa wiele ameloblastów ulega apoptozie, a pozostałe komórki kurczą się i regulują dojrzewanie szkliwa17. Linia innych typów komórek w CL wargowym, takich jak SR, jest mniej jasna, a dane dotyczące komórek macierzystych w mezenchymie18 i w CL językowym dopiero zaczynają się pojawiać.
Korzystając z modelu siekacza myszy, wiele grup pracowało nad wyjaśnieniem szlaków genetycznych i procesów biologicznych komórek związanych z naturalną odnową narządów na bazie komórek macierzystych. Jednak CL wargowy zawiera stosunkowo niewielką liczbę komórek, szacowaną na około 5000 na siekacz myszy, co sprawia, że praca z komórkami pierwotnymi jest trudna. W związku z tym podjęto wysiłki w celu hodowli i namnażania tych komórek in vitro6,16,19,20, aby otworzyć nowe drzwi do podejść eksperymentalnych, które nie są osiągalne in vivo. Najnowsze badania wykazały, że komórki te mogą zarówno samoodnawiać się, jak i różnicować w komórki wykazujące ekspresję amelogeniny podczas hodowli13. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy metodę wiarygodnej i spójnej hodowli komórek z CL wargowego myszy.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze, rozmiar 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>FST firmy Dumont, Kleszcze Dumoxel</td></tr><tr><td>proste, cienkie, 3.5</td><td>Roboz</td><td>RS5070</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td> <td># 71960</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela nr 3</td> Ostrze z piór <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nr 15</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>#72044-15</td><td>Chirurgiczne Filtrowana</td></tr><tr><td>kolagenaza ze stali nierdzewnej typu 1</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>#4214</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>#329424</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>#SCR006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D</td><td>233-FB-025 B27</td><td></td></tr><tr><td>Suplement</td><td>Gibco</td><td>10889-038</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów, które leżą u podstaw regeneracji i odnowy zębów, stało się tematem bardzo interesującym1-4, a siekacz myszy stanowi model dla tych procesów. Ten niezwykły narząd rośnie nieprzerwanie przez całe życie zwierzęcia i wytwarza wszystkie niezbędne typy komórek z aktywnych pul dorosłych komórek macierzystych znajdujących się w obszarach pętli szyjnej (CL) wargowej (w kierunku wargi) i językowej (w kierunku języka). Tylko komórki macierzyste zęba z CL wargowego powodują powstawanie ameloblastów, które wytwarzają szkliwo, zewnętrzną powłokę zębów, na powierzchni wargowej. To asymetryczne tworzenie szkliwa umożliwia ścieranie na końcu siekacza, a komórki progenitorowe i komórki macierzyste w siekaczu bliższym zapewniają ciągłe uzupełnianie tkanek zęba. Zdolność do izolowania i hodowli tych komórek progenitorowych lub macierzystych in vitro pozwala na ich ekspansję i otwiera drzwi do licznych eksperymentów nieosiągalnych in vivo, takich jak wysokoprzepustowe testowanie potencjalnych czynników regulacyjnych komórek macierzystych. Tutaj opisujemy i demonstrujemy wiarygodną i spójną metodę hodowli komórek z CL wargowego siekacza myszy.

Połowa żuchwy myszy składa się z jednego stale rosnącego siekacza i trzech zakorzenionych trzonowców (Rysunek 1A). Wszystkie zęby składają się z dentyny i szkliwa, dwóch zmineralizowanych komponentów korony zęba (Rysunki 1A oraz 1A'). W siekaczu znajdują się dwie nisze komórek macierzystych nazywane wargową listwą Ceresleia (CL) i językową listwą CL, a szkliwo tworzy się wyłącznie po stronie wargowej (Rysunek 1A'). Za tworzenie szkliwa siekacza odpowiada...

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie komórek do hodowli z pętli szyjnej strony wargowej siekacza mysiego w sposób niezawodny i powtarzalny. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie dolnej półżuchwy z dorosłej myszy i usunięcie kości pokrywającej obszar pętli szyjnej. Drugim krokiem jest wyizolowanie obszaru pętli szyjnej i oddzielenie mezenchymy od nabłonka.Następnie przeprowadza się mikrodysekcję pętli szyjnej. Ostatnim krokiem jest dysocjacja, a następnie hodowla wyizolowanych komórek nabłonkowych. Niniejszy film służy zaprezentowaniu prawidłowej procedury skutecznej izolacji komórek z wargowej pętli szyjnej.Procedurę zaprezentujemy ja oraz postdoktorzy Kirsten, SEL i Jimmy Hu, a także Lee, wizytujący pracownik naukowy w laboratorium Kleina. Po uśmierceniu zwierzęcia należy usunąć skórę od dolnej wargi do linii szyi. Następnie za pomocą skalpela należy wykonać nacięcie między dwoma dolnymi siekaczami, które są luźno połączone.Po wywarciu nacisku żuchwa zostanie rozdzielona na dwie połowy. Następnie należy wprowadzić skalpel pomiędzy wyrostek stawowy żuchwy a staw skroniowo-żuchwowy i przeciąć wzdłuż mięśni żuchwy, aby później oddzielić żuchwę. Usuń wszystkie mię

isolation-culture-dental-epithelial-stem-cells-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowlania komórek macierzystych z tkanki nabłonkowej zębów siecznych u dorosłych myszy

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Mieszek włosowy zawiera populację nabłonków i komórki mezenchymalne. Populację nabłonka wybrano z niejednorodnej populacji komórek pęcherzyków zębowych poprzez zapewnienie odrębnej pożywki hodowlanej. Komórki nabłonkowe przetrwały i utworzyły kolonie w podłożu wolnym od surowicy.

Izolacja komórek nabłonkowych z ludzkiego pęcherzyka zębowego

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza myszy. Technika mikrochirurgiczna umożliwia uzyskanie czystych kolonii komórkowych do badań nad regeneracją tkanek zębowych.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów