Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6
15 kwietnia 2014
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie zwierzęcego modelu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia, który imituje kliniczne i patofizjologiczne cechy stwardnienia rozsianego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie antygenu i adiuwantu oraz toksyny krztuścowej. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie podskórnie antygenu i emulsji CFA, a toksyny krztuścowej dootrzewnowej.
Dwa dni później m są ponownie wstrzykiwane dootrzewnowo z toksyną krztuścową. Następnie zwierzęta są ważone, a ich wynik kliniczny jest oceniany codziennie. Ostatecznie objawy kliniczne eksperymentalnego zapalenia autoimmunologicznego i zapalenia mózgu i rdzenia można zwykle zaobserwować między dziewiątym a 14 dniem po szczepieniu.
Główną zaletą tej techniki istniejących protokołów, które obejmują na przykład czynniki toksyczne, takie jak ryzon lub różne warianty EIE, jest to, że wszystkie naśladują cechy stwardnienia rozsianego, które różnią się ogromnie podstawowymi cechami patologicznymi, takimi jak udział adaptacyjnego układu odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z trudnym obchodzeniem się ze szczepieniami. Jest to absolutnie konieczne, aby zmniejszyć stres u zwierząt i zapewnić optymalną odporność po jego rozwoju.
Model ten utorował drogę naukowcom z dziedziny neuroimmunologii do scharakteryzowania zwierząt z nokautem. Identyfikacja nowych celów molekularnych leków lub testowanie obiecujących kandydatów na leki: Aby przygotować roztwór peptydu, należy rozpocząć od rozcieńczenia liofilizowanego peptydu MOG od 35 do 55 w wodzie podwójnie destylowanej do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr. Na mysz potrzeba 100 mikrolitrów tego roztworu, a podczas przygotowywania traci się pewną objętość.
Więc przygotuj 1,5 do dwóch razy więcej roztworu niż potrzeba. Roztwór peptydu należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby całkowicie przygotować adiuwant lub CFA, umieścić 100 miligramów wysuszonych prątków na gruźlicę. H 37 RA do moździerza i zmielić tłuczkiem do uzyskania rzadkiego proszku.
Następnie dodaj 10 mililitrów niekompletnego adiuwanta do frons, aby uzyskać 10 miligramów na mililitr roztworu skarpety CFA. Zapas CFA może być przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebna w dniu szczepienia. Rozcieńczyć roztwór podstawowy CFA niekompletnym adiuwantem do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr, dokładnie wymieszać w celu ponownego zawieszenia materiału w postaci cząstek stałych i umieścić go na lodzie.
Po rozmrożeniu podwielokrotności roztworu peptydu MOG 35 do 55. Umieść go na lodzie. Użyj strzykawki o pojemności dwóch mililitrów i kaniuli o rozmiarze 27, aby pobrać jeden mililitr CFA.
Następnie za pomocą drugiej dwumililitrowej strzykawki i kaniuli o rozmiarze 20 pobrać jeden mililitr roztworu MOG 35 do 55. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i połączyć obie strzykawki z zaworem trójdrogowym. Przy prawie zamkniętym zaworze trójdrogowym przepchnąć emulsję z jednej strzykawki do drugiej i dokładnie mieszać przez co najmniej 10 minut.
Po zakończeniu roztwór powinien być biały, sztywny i lepki, bez separacji faz. Teraz pozostaw emulsję na co najmniej 30 minut lub do kilku dni przed szczepieniem Sprawdź, czy nadal jest zemulgowana. W dniu szczepienia należy pobrać roztwór do jednej z dwóch strzykawek i podłączyć kaniulę o rozmiarze 27.
Rozpuść 50 mikrogramów toksyny krztuścowej w 500 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. W przypadku roztworu podstawowego 100 mikrogramów na mililitr należy przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. W dniu szczepienia rozcieńczyć roztwór podstawowy krztuśca od 1 do 50.
Za pomocą PBS przygotować strzykawkę z 200 mikrolitrami rozcieńczonego roztworu krztuśca do wstrzykiwań, który zawiera 400 nanogramów toksyny krztuścowej i pobrać dodatkowe 100 mikrolitrów na martwą przestrzeń piasty igły. Po znieczuleniu myszy izofluorem oceń poziom znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi. Wstrzyknąć podskórnie 100 mikrolitrów emulsji antygenowej CFA w dwa różne miejsca na każdym tylnym boku.
Po wstrzyknięciu pod skórą powinna uformować się bulwiasta masa, która powinna utrzymywać się przez cały czas trwania eksperymentu. Następnie wstrzyknąć przygotowaną strzykawkę zawierającą 200 mikrolitrów toksyny krztuścowej dootrzewnowej. Upewnij się, że poszczególne myszy można łatwo zidentyfikować do codziennej oceny.
Na przykład przez kolorowe oznaczenia na podstawie ogona.
Przegląd
Ten artykuł omawia indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgowia i rdzenia (EAE) u myszy C57BL/6, modelu stwardnienia rozsianego. Procedura polega na immunizacji peptidem mieliny oligodendrocytów (MOG) 35-55, prowadzącą do klinicznych objawów paraliżu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroimmunologia
- Choroby autoimmunologiczne
- Zwierzęce modele choroby
Tło
- Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgowia i rdzenia (EAE) naśladuje stwardnienie rozsiane.
- Myszy C57BL/6 są powszechnie używane w tym modelu.
- Imunizacja wywołuje reakcję autoimmunologiczną, która atakuje ośrodkowy układ nerwowy.
- Zrozumienie EAE pomaga w identyfikacji potencjalnych docelowych terapii dla stwardnienia rozsianego.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego zwierzęcego modelu EAE.
- Ocenienie klinicznych i patofizjologicznych cech stwardnienia rozsianego.
- Ułatwienie badań nad mechanizmami neuroimmunologicznymi i testowaniem leków.
Stosowane metody
- Przygotowanie peptydu MOG 35-55 i pełnego adjuvantu Freunda (CFA).
- Podskórne wstrzyknięcie antygenu i emulsji CFA.
- Dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuśca.
- Codzienna obserwacja wyników klinicznych i wagi zwierząt.
Główne wyniki
- Kliniczne objawy EAE zazwyczaj obserwuje się między 9 a 14 dniem po immunizacji.
- Skuteczna indukcja flabby paraliżu u myszy.
- Model umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznych w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Ułatwia identyfikację nowych molekularnych docelowych leków.
Wnioski
- Model EAE jest cennym narzędziem do badania stwardnienia rozsianego.
- Właściwe postępowanie i redukcja stresu są kluczowe dla udanej immunizacji.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie procesów neuroimmunologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The MOG35-55-induced EAE model in C57BL/6 mice provides a robust and reproducible system for studying autoimmune neuroinflammation relevant to multiple sclerosis pathophysiology. This model enables mechanistic de-risking of therapeutic candidates by recapitulating adaptive immune-mediated demyelination and neurodegeneration. It supports target validation and preclinical screening by allowing evaluation of drug effects on clinical disease progression and immune responses in a genetically tractable background.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of autoimmune hypotheses involving MOG-specific T-cell responses and CNS inflammation.
- Operational Value: Provides a standardized model for validating targets in neuroinflammatory pathways using genetic or pharmacological modulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by modeling the effector phase of autoimmune encephalomyelitis with clinical readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable clinical scores and weight loss metrics for dose-response assessment of immunomodulatory compounds.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow for compound testing with defined immunization and monitoring timelines.
- Assay Readiness: Outputs enable standardized evaluation of therapeutic impact on disease onset, severity, and duration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic studies of immune cell infiltration, demyelination, and axonal damage relevant to MS pathology.
- Translational Continuity: Allows evaluation of target engagement and pathway modulation from discovery through preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on clinical score thresholds and histopathological correlates.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, providing immunological and clinical readouts that inform compound advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of autoimmune mechanisms and functional validation of targets in neuroinflammation.
- Screening: Delivers quantitative clinical and phenotypic outputs enabling compound comparison and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Generates longitudinal clinical scoring and weight data for statistical evaluation of treatment effects.
- Translational Research: Connects immunomodulatory mechanisms to disease-modifying potential in a disease-relevant system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for screening multiple candidates across neuroimmunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in autoimmune CNS disorders through reproducible disease induction.
- Operational Value: Ensures standardization across studies via defined antigen preparation, adjuvant emulsification, and toxin dosing protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets with high translational failure potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking target modulation to clinical outcomes in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, emulsion preparation, and clinical scoring to minimize variability.
- Dependent on precise CFA-MOG emulsion quality and pertussis toxin dosing for consistent disease induction.
- Necessitates standardized scoring protocols and blinding for cross-functional data interpretation.
- Requires adaptation considerations when translating findings across different genetic backgrounds or disease variants.
- Practical limitations include model variability influenced by microbiota, housing conditions, and technician proficiency.
