Name: Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę aktywacji i pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3 w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą IL-1β. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Olivierowi Manchesowi, Ph.D., Davorowi Frleta, Ph.D. i Meagan O'Brien, M.D. za ich wsparcie i opinie. Badania te były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych i zakończone finansowaniem z grantów NIH Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individual Predoctoral Fellowships (F31) w celu promowania różnorodności w badaniach związanych ze zdrowiem (AI089030) i RO1 (AI081848).

Oświadczenie etyczne: Próbki badawcze są pobierane i przechowywane do badań za zgodą darczyńców. Wszystkie próbki powinny być zakodowane lub zanonimizowane przed użyciem. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi naszej Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.
1. Różnicowanie ludzkich monocytów krwi obwodowej na komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów.
Uwaga: Ludzkie kożuchy służą jako źródło ludzkich komórek krwi obwodowej (PBMC) i zostały pozyskane z New York Blood Center (New York, NY). Krwiodawcami są zdrowi ochotnicy. 5-dniowa procedura rozpoczyna się od posiewu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na kolbach do hodowli tkankowych35,36. Godne uwagi różnice w stosunku do opublikowanych protokołów są następujące:
<ol>
	<li>Użyj 225 cm2 niepirogennych polistyrenowych kolb do hodowli tkankowych z nasadką filtrującą, aby przykleić łącznie 2x108 PBMC na kolbę zamiast 10 cm płytek do hodowli tkankowych z polistyrenu (58 cm2) (krok 1).</li>
	<li>Przygotować pożywkę z 5% zbiorczą surowicą ludzką (PHS; 30 ml) w 500 ml RPMI-1640 + L-glutamina, 5 ml 1 M buforu HEPES i 1,4 ml 50 mg/ml gentamycyny (5% pożywki PHS), a następnie przefiltrować przez filtr 20 μM. Dodać łącznie 50 ml pożywki o sprężystości 5% PHS na kolbę do hodowli tkankowych o pojemności 225cm2.</li>
	<li>Umyj przylegające komórki trzykrotnie 25 ml świeżego RPMI-1640. Wstrząsaj energicznie przez 5 sekund podczas każdego mycia i odsysaj nieprzylegające komórki (krok 4).</li>
	<li>Dodać 190 μl 400 j.m./μl IL-4 i 380 μl 100 j.m./μl GM-CSF na kolbę (etap 3) w dniu 0, 2 i 4. Dzień 0 definiuje się jako dzień, w którym PBMC są początkowo powlekane w kroku 1 (kroku 8).</li>
	<li>Zebrać 5 moDC w stężeniu 1x106 komórek/ml (krok 15).</li>
	<li>Używaj moDC natychmiast w stanie spoczynku. Kroki 17-22 nigdy nie są wykonywane. Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, próbki należy przetworzyć tak szybko, jak to możliwe po pobraniu.</li>
	<li>Podwielokrotne moDC w stężeniu 2x105 komórek/basenik (200 μl/dołek z 1x106 komórek/ml) w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem (western blot, ELISA, FAC) lub na szkiełku komorowym poddanym działaniu poli-L-lizyny (mikroskopia) w celu eksperymentów. Uwaga: Istnieją co najmniej 4 warunki: Całkowicie niestymulowany (kontrola negatywna), tylko zalewanie, tylko aktywacja i torowanie, po którym następuje aktywacja. W razie potrzeby warunki można rozszerzyć o kontrolę rozcieńczalnika dla R848 i nigerycyny. Jeżeli dalszym testem jest ICS, duplikaty są niezbędne do kontroli izotypu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inflamasomu - Sygnał 1
<ol>
	<li>Rozpuść liofilizowany R848 w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć materiał roboczy w RT za pomocą RPMI-1640.</li>
	<li>Dodać R848 o końcowym stężeniu 10 μM do odpowiednich studzienek na 18 godzin. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Aktywacja inflamasomu NLRP3 - Sygnał 2
<ol>
	<li>Rozpuść liofilizowaną nigerycynę w etanolu zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć materiał roboczy w RT za pomocą RPMI-1640 przed dodaniem do odpowiednich warunków.</li>
	<li>Dodać nigerycynę w końcowym stężeniu 20 μM i wrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin. Między zalewaniem a aktywacją nie zachodzą żadne etapy mycia. Uwaga: Wydzielanie IL-1β zwiększa obecność jonoforów wapnia, brefeldyny A, monenzyny, dinitrofenolu lub chlorofenylohydrazonucyjanku karbonylu 37,38. Dlatego dodawanie tych inhibitorów wydzielniczych nie jest zalecane podczas analizy pobudzania lub aktywności inflamasomów, ponieważ zmieni to wydzielanie IL-1β.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek IL-1ß
<ol>
	<li>Odwirować płytkę z komórkami i supernatantami w temperaturze 974 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Nie naruszając osadu komórkowego, odessać supernatant i przenieść na oddzielną płytkę z okrągłym dnem w celu zmierzenia wydzielania cytokin z supernatantów. Uwaga: Supernatanty mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Przemyć granulki komórkowe trzykrotnie 200 μl 1x PBS przy 974 x g przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe IL-1β z próbek komórkowych. Uwaga: Podczas mycia osadów komórkowych z płytki 96-dołkowej, należy usunąć płukanie przez szybkie odwrócenie płytki do pojemnika zbiorczego, aby nie naruszyć próbki.</li>
</ol>
5. Pomiar IL-1ß z próbek komórkowych i supernatantów
<ol>
	<li>Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS): Protokół ICS jest opisany poniżej39,40. Uwaga: nie zawieszaj komórek, jeśli dalszym testem jest mikroskopia. Wszystkie płukania i aspiracje powinny być wykonywane bez naruszania warstwy komórkowej/osadu (w zależności od dalszego testu).
	<ol>
		<li>Dodaj 100 μl 5% pożywki PHS do odpowiednich studzienek. Dodaj odpowiednią objętość (około 1 μl / 2x105 komórek lub 1 μl / basenik) fluorescencyjnie znakowanych α-CD11c i α-CD14 (markery fenotypu; klon odpowiednio B-ly6 i MφP9) lub kontrolę izotypu do komórek przez 10 minut w RT w ciemności.</li>
		<li>Umyć trzy razy 1x PBS przy 974 x g przez 3 min.</li>
		<li>Napraw komórki, dodając 100 μl 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Punkt pauzy: Umyć 100 μl 1x PBS przy 974 x g przez 3 minuty i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N w 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu permeabilizacji do komórek na 30 min. Uwaga: bufor permeabilizacji składa się z 1x PBS z 0,3% Triton X-100 i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do permeabilizacji. Nie należy przeszkadzać przylegającym komórkom, gdy dalszy test to mikroskopia.</li>
		<li>Dodać odpowiednią objętość (około 62 ng przeciwciała/2x105 komórek, około lub 2,5 μl/basenik) α-IL-1β-FITC (klon 8516) lub kontrolę izotypu przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie 200 μl buforu permeabilacyjnego o stężeniu 974 x g przez 3 minuty w ciemności.</li>
		<li>Opcjonalnie: Zabejcuj za pomocą DAPI, dodaj środek mocujący i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Poczekaj, aż utrwalenie O / N przed wykonaniem obrazów mikroskopowych.</li>
		<li>Pozyskaj dane za pomocą FAC lub mikroskopii. Uwaga: Porównaj izotyp dla każdego stanu z odpowiednim barwieniem podczas analizy za pomocą FAC lub mikroskopii.
		<ol>
			<li>FAC: Pobieraj jedną próbkę na raz. Ustaw bramkę FSC / SSC na żywych komórkach, a następnie bramkowanie na komórkach CD11c + CD14- przed analizą barwienia populacji moDC pro-IL-1β.</li>
			<li>Mikroskopia: Ustaw czas naświetlania, używając próbki do barwienia dodatniego - poddanej działaniu R848. Użyj DAPI+pro-IL-1β+ i DAPI+pro-IL-1β-, aby określić procent ekspresji pro-IL-1β+ moDCs.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-Page: Immunoblotting jest wykonywany w celu wykrycia pro-IL-1β. Uwaga: Opisana poniżej technika łączy standardową technikę immunoblottingu, gradientowy żel poliakrylamidowy 4-20% oraz detekcję fluorescencyjną lub chemiluminescencyjną41,42 .
	<ol>
		<li>Lizować komórki bezpośrednio w 10 μl denaturującego buforu do lizy (5 μl β-merkaptoetanolu/950 μl buforu próbki Laemmli, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1 buforem do lizy komórek). Przenieś lizat do 1,5 ml probówek Eppendorfa.</li>
		<li>Podgrzewać lizat na suchej płycie przez 10 minut w temperaturze 100 °C.</li>
		<li>Wirować lizat przy 20 800 x g na miniwirówce przez 1 minutę, aby zagęścić objętość cieczy. Punkt wstrzymania: próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Załaduj całą objętość na żel poliakrylamidowy. Przepuść 140 V przez pudełko z żelem przez około 1 godzinę lub do momentu, gdy przód barwnika będzie spływał od dna żelu.</li>
		<li>Przenieść białko z żelu poliakryloamidowego na membranę PVDF Immobilon-FL przez 90 minut przy napięciu 100 V. Zablokować membranę 5% BSA w Tris Buffered Saline/ 0,1% Tween-20 (TBS-T) przez 1 godzinę. Uwaga: PVDF Immobilon-FL Najlepiej nadaje się do stosowania z detekcją fluorescencyjną. Membrana o innym składzie jest zalecana w przypadku innych technik detekcji w celu zwiększenia stosunku sygnału do tła.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w 10 ml 5% BSA/TBS-T. Przeprowadzić inkubację przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 °C O/N podczas wstrząsania i przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę podczas wstrząsania.</li>
		<li>Przemyć błonę 3 razy TBS-T przez 5 minut, wstrząsając między inkubacjami przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz ponownie między inkubacjami wtórnymi a obrazowaniem. Uwaga: Pasma można wykrywać za pomocą detekcji fluorescencyjnej lub chemiluminescencyjnej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykrywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ELISA: Próbki, które są zamrażane do przechowywania, muszą zrównoważyć się z RT przed analizą. Odwirować próbki w wirówce, aby skonsolidować kondensację supernatantu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi pomiaru IL-1β. Uwaga: W tym protokole IL-1β jest specjalnie mierzona; jednak jednoczesny pomiar TNFα, IL-6 i cytokiny immunomodulującej IL-10 zapewnia odpowiednie warunki.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Cytokiny zapalne są integralną częścią kierowania wrodzoną i adaptacyjną odpowiedzią immunologiczną w celu zwalczania infekcji wirusowej. Wykazano, że wydzielanie IL-1β zwiększa się podczas infekcji grypą 3,43,44 . Dokładne mechanizmy, za pomocą których te cytokiny są przetwarzane w odpowiedzi na rozpoznanie wirusa w ludzkich komórkach dendrytycznych, nie są w pełni poznane. Zestawy do izolacji szpiku DC są drogie i czasochłonne. Zestawy izolacyjne i sortowanie FAC m...

Aktywacja wrodzonego układu odpornościowego jest wymagana do kierowania adaptacyjnymi reakcjami immunologicznymi podczas infekcji, choroby i szczepienia7. Komórki dendrytyczne są najsilniejszymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego prezentującymi antygen; są wyspecjalizowane w wychwytywaniu antygenów, migracji do węzłów chłonnych i aktywacji naiwnych limfocytów T CD4 + i cytolitycznych CD8 + 8-10. Aby umożliwić szybkie wykrywanie patogenów, wrodzony układ odpornościowy wykorzystuje liczne receptory rozpoznawania wzorców kodowane przez linię zarodkową (PRR), które rozpoznają konserwatywne motywy pochodzące z patogenów lub pochodzące od gospodarza markery stresu i uszkodzenia komórek. Receptory tollopodobne (TLR) to receptory rozpoznawania wzorców związanych z błoną, które rozpoznają pewne zewnątrzkomórkowe wzorce molekularne związane z fagocytowanymi patogenami (PAMP) i wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP). Z kolei receptory podobne do nod (NLR) są cytozolowe i reagują na różnorodny zakres PAMP i DAMP. Receptory przypominające Nod stanowią drugą linię obrony przed patogenami, które unikają powierzchni komórki i endocytarnych PRR. Interakcja czynników pochodzących od patogenu lub "niebezpieczeństwo" związane z ligandami TLR i NLR prowadzi do stanu dojrzewania DC, co skutkuje zwiększoną interakcją DC z innymi komórkami odpornościowymi i promowaniem aktywacji limfocytów T i komórek NK11.
Interleukina-1β jest kluczowym elementem obrony gospodarza przed infekcją. Po rozpoznaniu mikroorganizmu wydzielana jest wysoce prozapalna cytokina IL-1β, która działa jako atraktant chemioterapii i aktywator wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych. In vivo (in vivo) IL-1β jest w dużej mierze odpowiedzialna za odpowiedź ostrej fazy, w tym gorączkę i syntezę cytokin zapalnych12.
Większość NLR-ów zawiera C-końcową domenę powtórzeniową bogatą w leucynę, która jest uważana za funkcjonalną w wykrywaniu ligandów, centralną domenę wiążącą nukleotydy (NACHT), która jest ważna dla oligomeryzacji NLRP3, oraz końcową domenę efektorową N (PYD w NLRP3), która pośredniczy w transdukcji sygnału do dalszych celów poprzez interakcje białek. Białko NLRP3 definiuje najintensywniej badany kompleks inflamasomowy. Białko to należy do rodziny NLR i ma zdolność tworzenia wielocząsteczkowego kompleksu białkowego składającego się z NLRP3, białka adaptorowego PYCARD (znanego również jako ASC) i ICE. Po aktywacji inflamasomu PYCARD wiąże się z domenami końcowymi NLRP3 N i rekrutuje ICE poprzez domeny aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD). Enzym konwertujący interleukinę-1 jest początkowo generowany jako zymogen zawierający motyw CARD na swoim N-końcu. Tworzenie inflamasomu powoduje zbliżenie dwóch cząsteczek ICE do siebie na tyle, aby wywołać ich autokatalityczną aktywację. Kompleks inflamasomów jest niezbędny do aktywacji ICE, umożliwiając mu w ten sposób przekształcenie cytoplazmatycznego pro-IL-1β w dojrzałą cytokinę.
Pomyślne wydzielanie IL-1β w DCs wymaga wykrycia dwóch różnych i niezależnych sygnałów niebezpieczeństwa. Po pierwsze, wykrywanie TLR PAMP, DAMP lub sygnalizacji cytokin (TNFα lub IL-1β) powoduje regulację w górę cytoplazmatycznego białka pro-IL-1β. Drugi, często inny, sygnał jest wymagany do tworzenia kompleksu inflamasomu przed dojrzewaniem ICE. Kilka sygnałów stymulujących inflamasomy obejmuje toksyny tworzące pory błony bakteryjnej (takie jak nigerycyna), kryształy zaburzające lizosomalne (takie jak kryształy moczanu sodu, MSU) i zewnątrzkomórkowe ATP. Wcześniejszy mechanizm prowadzący do aktywacji inflamasomu NLRP3 przez te różne aktywatory jest niejasny. Badania nad sygnalizacją przed powstawaniem inflamasomu sugerują, że zdarzenia wewnątrzkomórkowe, takie jak indukcja hipokaliemii lub reaktywne formy tlenu (ROS), pośrednio aktywują inflamasom13-28.
Wśród różnych aktywatorów wirusowych inflamasomu NLRP3 jest grypa, która dostarcza zarówno pierwotnego, jak i wtórnego sygnału wymaganego do wydzielania IL-1β 3,29-33 . Korzystając z mysich modeli nokautu NLRP3, stwierdzono, że wydzielanie IL-1β w DC jest zależne od NLRP332. Ponadto myszy z nokautem NLRP3 przyciągały mniej leukocytów do miejsca infekcji i doświadczały wyższej śmiertelności 2,5. Dwa ostatnie artykuły sugerują mechanizm aktywacji inflamasomu NLRP3 podczas infekcji wirusem grypy; po pierwsze, pobudzanie poprzez rozpoznawanie wirusowego RNA przez TLR7 lub TLR8 (w zależności od ekspresji TLR odpowiadającej komórki) lub poprzez wykrywanie bakterii komensalnych przez inne TLR w celu indukcji cytoplazmatycznej ekspresji pro-IL-1β, a następnie drugi sygnał, aktywacja tworzenia inflamasomu NLRP3 przez białko kanału jonowego wirusa M2 w sieci trans Golgiego33, Lokal mieszkalny 34. W ostatnim etapie wyzwalanie inflamasomu NLRP3 odbywa się poprzez zakłócenie wewnątrzkomórkowego środowiska jonowego prowadzące do produkcji ROS, która jest po prostu wyczuwana przez NLPR3 jako sygnał do utworzenia inflamasomu. Jednak dokładny mechanizm aktywacji inflamasomu przed aktywnością ICE podczas infekcji grypą nadal pozostaje niejasny.
Ta praca opisuje technikę cenną do badania inflamasomu NLRP3 w ludzkich moDCs, która może być wykorzystana jako podstawa do dalszych badań szlaku leżącego u podstaw wydzielania IL-1β na bazie DC w odpowiedzi na ligację TLR8 z R848, po której następuje aktywacja inflamasomu przez dobrze znany aktywator NLRP3, nigerycynę. Odmiany tej metody można stosować z innymi typami komórek, w tym między innymi: monocytami, makrofagami, innymi podzbiorami DC i komórkami nabłonkowymi.

<table><tbody><tr><td>IŁ-4</td><td>R& D</td> GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 Nabywamy <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ten produkt za pośrednictwem naszej lokalnej apteki na receptę</td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-glutaminą</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>PBMC zostały wyizolowane z krwi zdrowych dawców</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z okrągłym dnem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R& D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&&beta;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>R& D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-FL</td> Gradient <td></td> IPFL00010 <td></td><td>miliporowy</td></tr><tr><td>4-12% żel polikrylamidowy</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% roztwór sterylny/filtrowany</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>16% rozwiązanie</td></tr><tr><td>Zestaw macierzy kulek cytokin zapalnych</td><td>dla ludzi BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>Magazyn na miejscu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 cm2, Nasadka filtra, objętość robocza 70 ml, 30/Cs</a></td><td>Thermo 159933</td><td></td><td></td>Naukowy</tr><tr><td>20 &mu; M Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Koza & alfa-mysz IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-królik IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Spectra wielokolorowa drabinka białkowa o szerokim zasięgu</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS 10x</td><td>Bio Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine 10x</td><td>Bio Rad</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>8-komorowe szkło polistyrenowe do hodowli tkanek w naczyniu</td> BD <td>Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu nlrp3 za pomocą il-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Procesy zapalne wynikające z wydzielania cytokin z rodziny interleukiny (IL)-1 przez komórki odpornościowe prowadzą do miejscowego lub ogólnoustrojowego stanu zapalnego, przebudowy i naprawy tkanek oraz kontroli wirusologicznej 1,2 . Interleukina-1β jest niezbędnym elementem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i przyczynia się do eliminacji atakujących patogenów, jednocześnie zapobiegając powstawaniu uporczywych infekcji1-5.
Inflamasomy są kluczową platformą sygnalizacyjną dla aktywacji enzymu konwertującego interleukinę 1 (ICE lub kaspazy-1). Inflamasom NLRP3 wymaga co najmniej dwóch sygnałów w DC, aby spowodować wydzielanie IL-1β6. Ekspresja białka Pro-IL-1β jest ograniczona w komórkach w stanie spoczynku; dlatego do transkrypcji IL-1β i ekspresji białka wymagany jest sygnał primingowy. Drugi sygnał wykrywany przez NLRP3 powoduje powstanie wielobiałkowego inflamasomu NLRP3. Zdolność komórek dendrytycznych do reagowania na sygnały wymagane do wydzielania IL-1β można przetestować przy użyciu syntetycznej puryny R848, która jest wykrywana przez TLR8 w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC) do komórek pierwotnych, a następnie aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą toksyny bakteryjnej i jonoforu potasu, nigerycyny.
Pochodzące z monocytów DC są łatwo wytwarzane w hodowli i dostarczają znacznie więcej komórek niż oczyszczone ludzkie mieloidalne DC. Przedstawiona tutaj metoda różni się od innych testów inflamasomów tym, że wykorzystuje in vitro DCs pochodzące od ludzi, a nie od myszy, co pozwala na badanie inflamasomu w chorobach i infekcjach u ludzi.

Techniki te służą do pomiaru aktywacji TLR8 za pomocą R848. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla pro-IL-1β umożliwia odczyty mikroskopowe i FACS z moDC CD14-CD11c+. Obie techniki mogą być kwantyfikowane w stosunku do kontroli komórkowej nieaktywowanej (spoczynkowej) oraz kontroli izotypowej (Rysunki 1 i 2). Procent komórek wybarwionych na pro-IL-1β+ mnoży się przez medianę geometryczną tej populacji, aby uzyskać średnią intensywność fl...

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest obserwacja aktywności inflamasomu w ludzkich komórkach dendrytycznych in vitro z wykorzystaniem prostych testów odczytu poziomu IL-1β. W pierwszej kolejności dodaje się R 8 48 do komórek, aby indukować wewnątrzkomórkową ekspresję pro-IL-1β. Następnie dodaje się nigerycynę w celu aktywacji tworzenia inflamasomu NLRP3.Z kolei wywołuje to rozszczepienie pro IL-1β do dojrzałej postaci IL-1β przed jej sekrecją. Następnie należy zebrać próbki i zmierzyć wewnątrzkomórkową postać pro IL-1β oraz zewnątrzkomórkową dojrzałą postać IL-1β; wyniki uzyskano poprzez pomiar sekrecji IL-1β z komórek przygotowanych (primed) i aktywowanych za pomocą immunofluorescencji, western blot oraz ELISA. Detekcja wykazała, że przygotowanie ludzkich komórek dendrytycznych (DCs) prowadzi do wewnątrzkomórkowej produkcji pro IL-1β w komórkach przygotowanych R848 oraz do sekrecji IL-1β z komórek zarówno przygotowanych, jak i aktywowanych nigeryciną.Ta metoda może dostarczyć wiedzy na temat roli inflamasomu NLRP3 w odpowiedzi ludzkich komórek dendrytycznych na ligandy syntetyczne. Może ona być również zastosowana w innych układach zaprojektowanych do testowania wyzwalaczy fizjologicznych, takich jak bakterie, wirusy i choroby autozapalne. Odmierz 200 µL świeżo izolowanych komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego w stanie spoczynku do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.Zacznij od czterech standardowych warunków: niepobudzonej kontroli negatywnej, samego primingu, samej aktywacji oraz primingu z następującą po nim aktywacją. Następnie, zgodnie z planem eksperymentalnym, uwzględnij kontrole rozcieńczalnika dla R 8 48 i nisiny dla późniejszych analiz wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin; dla kontroli izotypowych w celu primingu inflamasomu uwzględnij próbki w dubletach. Dodaj R 8 48, tak aby w odpowiednich studzienkach uzyskano końcowe stężenie 10 μM.Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5%CO2 na 18 godzin. Następnie, aby aktywować inflamasom NLRP3, dodaj nigerycynę do końcowej stężenia 20 µM. Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora na kolejne sześć godzin. Aby zebrać próbki, odwiruj płytkę hodowlaną przy 974 ×g przez trzy minuty, uważając, aby nie naruszyć osadów komórkowych.Przenieś każdy nadsącz do oddzielnej kolby okrągłodنnej w celu pomiaru wydzielania cytokin za pomocą metody EISA. Następnie przemyj osady komórkowe trzykrotnie 200 µL 1x PBS, aby usunąć pozakomórkową IL-1β z próbek komórkowych przed dalszą analizą różnymi technikami. W celu detekcji pro-IL-1β metodą western blot poddaj komórki lizie bezpośrednio w 10 µL denaturującego buforu lizującego. Po przeniesieniu lizatów do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C w celu detekcji fluorescencyjnej IL-1β za pomocą cytometrii przepływowej.Do próbek komórkowych dodać 100 µL pożywki 5% PHS oraz jeden µL przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko markerom fenotypowym lub kontroli izotypowej; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po trzykrotnym przemyciu w PBS, utrwalić komórki za pomocą 100 µL 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnie dodać 100 µL buforu do permeabilizacji na 30 minut, a następnie 62 ng przeciwciała anty-IL-1β FSE lub kontroli izotypowej; inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Przemyj komórki trzykrotnie 200 µL buforu przepuszczalnego i resuspenduj w jednym XPBS. Zawiń próbki w folię i przechowuj w temperaturze 4 °C. W przypadku wykrywania IL one beta za pomocą mikroskopii, zabarw komórki dappy, dodaj medium montażowe i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkę na szkiełko przedmiotowe.Pozostaw preparat do utwardzenia na noc przed wykonaniem obrazowania mikroskopowego do detekcji fluorescencyjnej za pomocą cytometrii przepływowej. Pozyskuj dane dla jednej próbki na raz. Ustaw bramki dla rozpraszania przedniego i bocznego na żywe komórki. Następnie ustaw bramkę na komórki CD 11 C dodatnie i CD 14 ujemne.Na koniec przeanalizuj populację MODC w oparciu o barwienie pro-IL-1β w uzyskanych danych mikroskopowych. Ustaw czas ekspozycji, korzystając z próbki traktowanej R 8 48 wykazującej dodatnie barwienie. Następnie określ odsetek MO-DC wykazujących ekspresję pro-IL-1β w celu detekcji metodą western blot.Nanieś całkowitą objętość próbki na żel poliakrylamidowy. Prowadź elektroforezę przy napięciu 140 voltów, aż front barwnika przesunie się poza krawędź żelu. Przenieś białko z żelu poliakrylamidowego na membranę PVDF.Zablokuj membranę, używając 5% BSA w TBST przez jedną godzinę. Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym, wytrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po trzech pięciominutowych przemyciach w TBST inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; po kolejnych trzech przemyciach w TBST wykonaj obrazowanie membrany. Podczas pomiaru wydzielonych cytokin metodą ELISA doprowadź próbki do stanu równowagi w temperaturze pokojowej.Odwirować próbki, aby skondensować nadsadziny, a następnie postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu pomiaru IL one beta. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla pro IL one beta umożliwia analizę mikroskopową oraz odczyty FACS z komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego CD 11 C pozytywnych i CD 14 negatywnych. Obie techniki można kwantyfikować w stosunku do kontroli komórek niepobudzonych lub spoczywających, a także kontroli izotypowej. Procent komórek wybarwionych na pro IL one beta mnoży się przez medianę geometryczną tej populacji, aby uzyskać medianę intensywności fluorescencji.MFI jest porównywalne z ilością pro-IL-1β obecną w komórkach wykazujących pozytywne barwienie. W tym celu do pomiaru poziomu pro-IL-1β w lizatach komórkowych zastosowano techniki immunoblottingu. Dane ilościowe przedstawiono w stosunku do wewnętrznej kontroli komórkowej, takiej jak beta-tubulina, zgodnie z oczekiwaniami.Immunoblotting w celu oznaczenia pro IL-1β w komórkach traktowanych Nigericyną wykazuje spadek poziomu pro IL-1β. Wynik ten jest uzupełniony jednoczesnym wzrostem poziomu IL-1β w supernatantach, zmierzonym za pomocą testu ELISA po 48 h w warunkach inkubacji z Nigericyną. Równoległy pomiar innych cytokin zapalnych, takich jak TNF-α, IL-10 oraz IL-6, potwierdza, że Nigericyna specyficznie indukuje sekrecję IL-1β.Poziom primingu jest zależny od czasu i dawki. Dalsze eksperymenty, takie jak pomiar stężenia białek pozakomórkowych, detekcja chemiluminescencyjna dojrzałej formy IL-1β lub blokowanie inflamasomu, pomogłyby ustalić, czy pozakomórkowa IL-1β jest dojrzałą formą po rozszczepieniu oraz czy sekrecja IL-1β jest zależna od aktywności inflamasomu NLRP3.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aktywacja i pomiar aktywności inflammasomy NLRP3 za pomocą IL-1β w pochodzących od ludzkich monocytów komórkach dendrytycznych

Opisujemy prosty test immunoenzymatyczny służący do pomiaru produkcji cytokin prozapalnych, takich jak IL-1 beta, u pacjentów prezentujących fenotypy autozapalne. Poprzez aktywację komórek w hodowlach krwi pełnej za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami, a konkretnie lipopolisacharydu, wydzielanie cytokin można w wygodny sposób ocenić w nadsączach krwi pełnej.

Dokładny i prosty pomiar cytokiny prozapalnej IL-1&beta; z wykorzystaniem testu stymulacji krwi pełnej

Opisujemy zastosowanie technologii ImageStream (www.amnis.com), która łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w celu ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Nasze badania stanowią wzorzec dla analiz translacyjnych służących do ilościowego określania specyficznych dla linii komórkowych odpowiedzi w małych próbkach pobranych z kohort...

Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Ten film demonstruje metodę wykrywania aktywacji inflamasomu NLRP3 w makrofagach za pomocą fluorescencyjnych sond reporterowych. Komórki są traktowane jonoforami potasu i glicyną w celu indukcji składania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1. Fluorescencyjne sondy reporterowe wizualizują aktywowaną kaspazę-1, a komórki są barwione barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji jąder.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje technikę badania tworzenia inflamasomu w pierwotnej makrofagach za pomocą immunofluorescencji receptorów podobnych do NOD, rodziny receptorów pirynowych, zawierających domenę 3 (NLRP3). Makrofagi są najpierw przygotowywane za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS) w celu zwiększenia ekspresji białka NLRP3. Wystawienie makrofagów na działanie nigerycyny - jonoforu potasu - prowadzi do aktywacji NLRP3 i powstania inflamasomów, które są wizualizowane za pomocą...

Technika in vitro do badania tworzenia kompleksów inflamasomów w makrofagach

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Poznaj metodę aktywacji i pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3 w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą IL-1β. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Przeglądaj więcej filmów