Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest obserwacja aktywności inflamasomu w ludzkich komórkach dendrytycznych in vitro przy użyciu prostych testów odczytu beta IL one. Najpierw dodaj R 8 48 do komórek, aby indukować wewnątrzkomórkową ekspresję pro IL one beta. Następnie dodaj nige, aby aktywować tworzenie trzech inflamasomów NLRP.

To z kolei powoduje rozszczepienie pro IL one beta do dojrzałego IL one beta przed wydzielaniem. Następnie zbierz próbki i zmierz wewnątrzkomórkowe wyniki pro IL one beta i zewnątrzkomórkowe dojrzałe IL one beta uzyskane przez pomiar wydzielania IL one beta z zaszczepionych i aktywowanych komórek za pomocą immunofluorescencji, western blot i eli. Wykrycie wykazało, że pobudzenie ludzkiego DCS powoduje wewnątrzkomórkową produkcję pro IL one beta w 48 zaszczepionych komórkach R 8 i wydzielanie IL one beta z komórek zarówno zaszczepionych, jak i aktywowanych za pomocą nigeryjskiego juris.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat roli trójskładnikowego inflamasomu NLRP w odpowiedzi ludzkich komórek dendrytycznych na syntetyczne ligandy. Może być również stosowany w innych systemach zaprojektowanych do testowania wyzwalaczy fizjologicznych, takich jak bakterie, wirusy i choroby autozapalne. Podwielokrotność 200 mikrolitrów świeżo izolowanych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów w stanie spoczynku w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej.

Zacznij od czterech standardowych warunków: niestymulowana kontrola negatywna, tylko torowanie, tylko aktywacja i torowanie, po którym następuje aktywacja. Następnie, zgodnie z projektem eksperymentalnym, uwzględnij kontrole rozcieńczalnika dla R 8 48 i nissynę do dalszych wewnątrzkomórkowych testów barwienia cytokin, w tym duplikaty dla kontroli izotypu, aby przygotować inflamasom. DODAĆ R 8 48, dodać końcowe stężenie 10 mikromolowe do odpowiednich studzienek.

Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na 18 godzin. Następnie, aby aktywować inflamasom NLRP trzy, dodaj nige o końcowym stężeniu 20 mikromolów. Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze na dodatkowe sześć godzin w celu zebrania próbek, odwirować płytkę hodowlaną w temperaturze 974 razy G przez trzy minuty, nie naruszając osadów komórkowych.

Przenieść każdy supernatant na oddzielną płytkę o okrągłym dnie w celu zmierzenia wydzielania cytokin za pomocą EISA. Teraz umyj granulki komórkowe trzykrotnie 200 mikrolitrami jednego XPBS, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe IL one beta z próbek komórkowych do dalszej analizy za pomocą różnych technik wykrywania western blot pro IL one beta lyce komórek bezpośrednio w 10 mikrolitrach denaturującego buforu do lizy. Po przeniesieniu lizatów do 1,5-mililitrowych probówek einor, podgrzewaj próbki przez 10 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza w celu wykrycia fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej IL one beta.

Dodaj 100 mikrolitrów pożywki 5% PHS do próbek komórkowych i jeden mikrolitr fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał do markerów fenotypu lub kontroli izotypu, inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po trzech płukaniach PBS utrwal komórki 100 mikrolitrami 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przepuszczalnego buforu przez 30 minut, a następnie 62 nanogramy przeciwciała anty IL one beta FSE lub próbki kontrolne izotypu inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umyj ogniwa trzykrotnie 200 mikrolitrami przepuszczalnego buforu i ponownie zawieś w jednym XPBS. Zawiń próbki w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli wykryjesz IL one beta za pomocą mikroskopii, zabarwić komórki za pomocą dappy, dodaj górę i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku.

Pozwól górze utwardzić się przez noc przed wykonaniem obrazów mikroskopowych w celu wykrycia fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Pobieraj dane pojedynczo próbka. Ustaw bramki rozproszone do przodu i z boku na żywych komórkach Następna bramka na CD 11 C dodatnie CD 14 ujemne komórki.

Na koniec przeanalizuj populację MODC na podstawie barwienia pro IL one beta w akwizycji danych mikroskopowych. Ustawić czas ekspozycji dla próbki poddanej działaniu R 8 48 o barwieniu dodatnim. Następnie określ procent pro IL one beta wyrażającego MO dcs łatwość wykrywania western blot.

Załaduj całkowitą objętość próbki na żel poliakrylamidowy. Pracuj pod napięciem 140 woltów, aż przód matrycy zacznie spływać z żelu. Przenieś białko z żelu poliakrylamidowego na A-P-V-D-F immo na membranie FL.

Zablokuj membranę za pomocą 5% BSA w TBST na jedną godzinę. Inkubować z przeciwciałem pierwotnym, wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po trzech pięciominutowych płukaniach TBST, inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę po trzech kolejnych płukaniach TBST, obrazie błony podczas pomiaru wydzielanych cytokin przez ELI SA zrównoważyć próbki w temperaturze pokojowej.

Odkręć próbki, aby skonsolidować kondensację supernatantu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi pomiaru barwienia cytokiny wewnątrzkomórkowej IL one beta dla pro IL one beta pozwala na mikroskopię i odczyty faktów z CD 11 C dodatnich CD 14 ujemnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów. Obie techniki można określić ilościowo w odniesieniu do kontroli komórek innych niż pierwsza lub spoczynkowa, a także kontroli izotypu. Procent komórek barwiących beta pro IL one jest mnożony przez medianę geometryczną tej populacji, aby uzyskać medianę intensywności fluorescencji.

MFI jest porównywalny z ilością pro IL one beta obecną w komórkach o dodatnim barwieniu. Tu. Techniki immuno blottingu są stosowane do pomiaru pro IL one beta z lizatów komórkowych. Dane ilościowe są wyrażone w odniesieniu do wewnętrznej kontroli komórkowej, takiej jak tubulina beta, zgodnie z oczekiwaniami.

Blotting immunologiczny dla pro IL one beta w komórkach leczonych NI Nigerian ujawnia spadek pro IL one beta. Uzupełnieniem jest równoczesny wzrost IL one beta w supernatantach, mierzony za pomocą E ELI a tylko R 8 48, a następnie warunki NI Nigerian. Jednoczesny pomiar innych cytokin zapalnych, takich jak T, NF, alfa, IL 10 i IL 6, zapewnia, że Niger jest specyficzny w powodowaniu wydzielania IL one beta.

Poziom zalewania zależy od czasu i dawki. Dalsze eksperymenty, takie jak pomiar stężenia białka zewnątrzkomórkowego ex, wykrywanie chemiluminescencji od dojrzałego pokolenia I one beta lub blokowanie inflamasomu pomogłyby określić, czy ex zewnątrzkomórkowe IO one beta jest dojrzałą rozszczepioną formą i czy wydzielina IO one beta to nlrp. Trzy zależne od aktywności inflamasomów.