Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest obserwacja aktywności inflamasomu w ludzkich komórkach dendrytycznych in vitro z wykorzystaniem prostych testów odczytu poziomu IL-1β. W pierwszej kolejności dodaje się R 8 48 do komórek, aby indukować wewnątrzkomórkową ekspresję pro-IL-1β. Następnie dodaje się nigerycynę w celu aktywacji tworzenia inflamasomu NLRP3.

Z kolei wywołuje to rozszczepienie pro IL-1β do dojrzałej postaci IL-1β przed jej sekrecją. Następnie należy zebrać próbki i zmierzyć wewnątrzkomórkową postać pro IL-1β oraz zewnątrzkomórkową dojrzałą postać IL-1β; wyniki uzyskano poprzez pomiar sekrecji IL-1β z komórek przygotowanych (primed) i aktywowanych za pomocą immunofluorescencji, western blot oraz ELISA. Detekcja wykazała, że przygotowanie ludzkich komórek dendrytycznych (DCs) prowadzi do wewnątrzkomórkowej produkcji pro IL-1β w komórkach przygotowanych R848 oraz do sekrecji IL-1β z komórek zarówno przygotowanych, jak i aktywowanych nigeryciną.

Ta metoda może dostarczyć wiedzy na temat roli inflamasomu NLRP3 w odpowiedzi ludzkich komórek dendrytycznych na ligandy syntetyczne. Może ona być również zastosowana w innych układach zaprojektowanych do testowania wyzwalaczy fizjologicznych, takich jak bakterie, wirusy i choroby autozapalne. Odmierz 200 µL świeżo izolowanych komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego w stanie spoczynku do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.

Zacznij od czterech standardowych warunków: niepobudzonej kontroli negatywnej, samego primingu, samej aktywacji oraz primingu z następującą po nim aktywacją. Następnie, zgodnie z planem eksperymentalnym, uwzględnij kontrole rozcieńczalnika dla R 8 48 i nisiny dla późniejszych analiz wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin; dla kontroli izotypowych w celu primingu inflamasomu uwzględnij próbki w dubletach. Dodaj R 8 48, tak aby w odpowiednich studzienkach uzyskano końcowe stężenie 10 μM.

Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5%CO2 na 18 godzin. Następnie, aby aktywować inflamasom NLRP3, dodaj nigerycynę do końcowej stężenia 20 µM. Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora na kolejne sześć godzin. Aby zebrać próbki, odwiruj płytkę hodowlaną przy 974 ×g przez trzy minuty, uważając, aby nie naruszyć osadów komórkowych.

Przenieś każdy nadsącz do oddzielnej kolby okrągłodنnej w celu pomiaru wydzielania cytokin za pomocą metody EISA. Następnie przemyj osady komórkowe trzykrotnie 200 µL 1x PBS, aby usunąć pozakomórkową IL-1β z próbek komórkowych przed dalszą analizą różnymi technikami. W celu detekcji pro-IL-1β metodą western blot poddaj komórki lizie bezpośrednio w 10 µL denaturującego buforu lizującego. Po przeniesieniu lizatów do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C w celu detekcji fluorescencyjnej IL-1β za pomocą cytometrii przepływowej.

Do próbek komórkowych dodać 100 µL pożywki 5% PHS oraz jeden µL przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko markerom fenotypowym lub kontroli izotypowej; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po trzykrotnym przemyciu w PBS, utrwalić komórki za pomocą 100 µL 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnie dodać 100 µL buforu do permeabilizacji na 30 minut, a następnie 62 ng przeciwciała anty-IL-1β FSE lub kontroli izotypowej; inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.

Przemyj komórki trzykrotnie 200 µL buforu przepuszczalnego i resuspenduj w jednym XPBS. Zawiń próbki w folię i przechowuj w temperaturze 4 °C. W przypadku wykrywania IL one beta za pomocą mikroskopii, zabarw komórki dappy, dodaj medium montażowe i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkę na szkiełko przedmiotowe.

Pozostaw preparat do utwardzenia na noc przed wykonaniem obrazowania mikroskopowego do detekcji fluorescencyjnej za pomocą cytometrii przepływowej. Pozyskuj dane dla jednej próbki na raz. Ustaw bramki dla rozpraszania przedniego i bocznego na żywe komórki. Następnie ustaw bramkę na komórki CD 11 C dodatnie i CD 14 ujemne.

Na koniec przeanalizuj populację MODC w oparciu o barwienie pro-IL-1β w uzyskanych danych mikroskopowych. Ustaw czas ekspozycji, korzystając z próbki traktowanej R 8 48 wykazującej dodatnie barwienie. Następnie określ odsetek MO-DC wykazujących ekspresję pro-IL-1β w celu detekcji metodą western blot.

Nanieś całkowitą objętość próbki na żel poliakrylamidowy. Prowadź elektroforezę przy napięciu 140 voltów, aż front barwnika przesunie się poza krawędź żelu. Przenieś białko z żelu poliakrylamidowego na membranę PVDF.

Zablokuj membranę, używając 5% BSA w TBST przez jedną godzinę. Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym, wytrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po trzech pięciominutowych przemyciach w TBST inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; po kolejnych trzech przemyciach w TBST wykonaj obrazowanie membrany. Podczas pomiaru wydzielonych cytokin metodą ELISA doprowadź próbki do stanu równowagi w temperaturze pokojowej.

Odwirować próbki, aby skondensować nadsadziny, a następnie postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu pomiaru IL one beta. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla pro IL one beta umożliwia analizę mikroskopową oraz odczyty FACS z komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego CD 11 C pozytywnych i CD 14 negatywnych. Obie techniki można kwantyfikować w stosunku do kontroli komórek niepobudzonych lub spoczywających, a także kontroli izotypowej. Procent komórek wybarwionych na pro IL one beta mnoży się przez medianę geometryczną tej populacji, aby uzyskać medianę intensywności fluorescencji.

MFI jest porównywalne z ilością pro-IL-1β obecną w komórkach wykazujących pozytywne barwienie. W tym celu do pomiaru poziomu pro-IL-1β w lizatach komórkowych zastosowano techniki immunoblottingu. Dane ilościowe przedstawiono w stosunku do wewnętrznej kontroli komórkowej, takiej jak beta-tubulina, zgodnie z oczekiwaniami.

Immunoblotting w celu oznaczenia pro IL-1β w komórkach traktowanych Nigericyną wykazuje spadek poziomu pro IL-1β. Wynik ten jest uzupełniony jednoczesnym wzrostem poziomu IL-1β w supernatantach, zmierzonym za pomocą testu ELISA po 48 h w warunkach inkubacji z Nigericyną. Równoległy pomiar innych cytokin zapalnych, takich jak TNF-α, IL-10 oraz IL-6, potwierdza, że Nigericyna specyficznie indukuje sekrecję IL-1β.

Poziom primingu jest zależny od czasu i dawki. Dalsze eksperymenty, takie jak pomiar stężenia białek pozakomórkowych, detekcja chemiluminescencyjna dojrzałej formy IL-1β lub blokowanie inflamasomu, pomogłyby ustalić, czy pozakomórkowa IL-1β jest dojrzałą formą po rozszczepieniu oraz czy sekrecja IL-1β jest zależna od aktywności inflamasomu NLRP3.