Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Ogólnym celem tej procedury jest zdefiniowanie mikroRNA, które receptory estrogenowe mogą regulować. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie komórek do maksymalnej odpowiedzi estrogenowej poprzez hodowlę do optymalnego zbiegania i wyczerpania aktywności estrogenowej. Drugim krokiem jest indukowanie aktywności transkrypcyjnej receptorów estrogenowych poprzez leczenie estradiolem przez wymaganą liczbę punktów czasowych.

Do porównań dołączone są odpowiednie kontrolki. Następnie RNA, w tym populacja mikro RNA, jest ekstrahowane i przekształcane w CD NA, o którym wiadomo, że jest regulowany estrogenem. Geny docelowe są następnie mierzone za pomocą QPCR, aby potwierdzić, że protokół leczenia był skuteczny.

Ostatnim krokiem jest określenie wzorca ekspresji mikroRNA w całym genomie przy użyciu technologii badań przesiewowych na dużą skalę. Ostatecznie przeprowadzana jest analiza konfirmacyjna za pomocą QPCR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi, takie jak to, czy i jak estrogen wpływa na ekspresję mikro RNA.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w raka piersi, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne nowotwory lub typy komórek, które wyrażają receptor estrogenowy alfa lub gorzki. Siedem komórek MC wykorzystanych w tym badaniu przygotowuje się na pięć dni przed leczeniem w sterylnym kapturze. Usunąć pożywkę z kolby T 75 za pomocą sterylnej pipety pastwiskowej podłączonej do próżni.

Delikatnie umyj przyczepione komórki dwukrotnie PBS i odłącz komórki trypsyną. Policz komórki za pomocą licznika komórek zgodnie z protokołem producenta. Oznacz sześć płytek o pojemności 100 mililitrów i dodaj 10 mililitrów podłoża do każdej płytki.

Płytkować około 2 milionów komórek na płytkę i rozprowadzać komórki, delikatnie obracając płytkę. Inkubuj komórki przez 24 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aż komórki zlewają się w około 80%. Dwa do czterech dni później wyjmij komórki z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwuj pod mikroskopem, aby upewnić się, że są w około 80% zlewne.

Płynność połączeń komórkowych jest ważnym czynnikiem, ponieważ wpływa na kontakt między komórkami i zachowania, takie jak sygnalizacja międzykomórkowa i proliferacja. Umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj odpowiednią pożywkę z 5% FBS, która została przefiltrowana w celu usunięcia związków estrogenowych. FBS lub D-C-C-F-B-S powlekane węglem Dexter inkubują komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 następnego dnia.

Przemyć komórki dwukrotnie PBS i dodać odpowiednią pożywkę 0,5% D-C-C-F-B-S, inkubować komórki przez dodatkowe 48 godzin w dniu leczenia. Przygotuj odczynniki do leczenia komórkowego w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Najpierw dodaj 30 mililitrów odpowiedniego 0,5% D-C-C-F-B-S, a następnie trzy mikrolitry 0,1 milimolowego E dwóch ligandowych komórek płuczących dwukrotnie PBS.

Pamiętaj, aby usunąć jak najwięcej PBS. Delikatnie wymieszaj zawartość każdej probówki i dodaj 10 mililitrów do komórek w każdej płytce. Na każdą płytkę powinien przypadać jeden ligand.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez wybrany okres czasu od zera do 72 godzin. W razie potrzeby wymień pożywkę po zakończeniu leczenia na żądany okres czasu. Wyjąć płytki z inkubatora i umieścić je pod wyciągiem.

Ponieważ w tej procedurze wykorzystuje się toksyczny roztwór fenolu tiocyjanianu guany dium, należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, dwukrotnie przemyć komórki PBS. Następnie dodaj jeden do dwóch mililitrów roztworu fenolu tiocyjanianu guad dium do komórek w każdej płytce. Upewnij się, że objętość komórek nie przekracza 10% objętości roztworu fenolu tiocyjanianu guad dium i że płytka jest pokryta roztworem.

Pozostaw komórki na minutę. Następnie użyj gumowego skrobaka, aby zeskrobać komórki i przenieść je do mikrowirówki. Komórki rurki mogą być przechowywane w tym roztworze w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez tygodnie.

Ekstrakcja RNA wysokiej jakości jest bardzo ważna dla powodzenia tej procedury. W związku z tym etapy postępowania muszą być wykonywane w ramach RNA. Warunki wolne Aby wyekstrahować całkowite RNA z każdego zabiegu, należy wirować mieszaninę komórek przez jedną minutę i szybko wirować.

Dodać 200 mikrolitrów chloroformu na jeden mililitr roztworu fenolu tiocyjanianu guad dium. Wirować przez 15 sekund i inkubować przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej, wirować przy 11 000 obr./min i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Przenieś górną fazę wodną do nowej mikroprobówki wirówkowej.

Dodać 1,5 objętości 100% etanolu i wymieszać pipetując. Przenieś roztwór do kolumny wirowej i oczyść RNA przez oczyszczanie mikro RNA w kolumnie wirowej, a następnie degradację 1D NA DN a zgodnie z protokołem producenta. Następnie RNA jest umieszczane w 60 mikrolitrach RNA wolnej podwielokrotności wody, od jednego do dwóch mikrolitrów RNA do oceny ilościowej i analizy jakości, a resztę RNA przechowuje się w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po potwierdzeniu, że leczenie komórek spowodowało regulację znanych celów reagujących na estrogeny, takich jak mRNA, profilowanie mikroRNA przeprowadza się przy użyciu zarówno mikroprzepływów mikromocy, mikromacierzy, jak i podwójnie znakowanych sond, macierzy o niskiej gęstości lub D-L-P-L-D-A w celu przeprowadzenia profilowania mikro RNA za pomocą D-L-P-L-D-A, wyjmij płytki D-L-P-L-D-A z lodówki i pozwól im siedzieć w temperaturze pokojowej podczas uruchamiania reakcji odwrotnej transkrypcji w celu wygenerowania CDNA z próbek RNA. Gdy płytki D-L-P-L-D-A osiągną temperaturę pokojową, 100 mikrolitrów CDNA wymieszać z sondami z podwójną etykietą. Mieszać wzorca PCR do każdego z ośmiu portów napełniania płytki.

Odwirować płytki tablicowe. Na krótko otwórz system Q-R-T-P-C-R i sprawdź, czy blok jest przeznaczony do płytki 384-dołkowej. Skonfiguruj przebieg.

Korzystając z oprogramowania SDS, wybierz względną kwantyfikację. Wybierz numer studni i typ tablicy, a następnie wprowadź opisy próbek, aby zdefiniować studnie. Uruchom macierz przy użyciu domyślnych warunków cyklicznych przepływów termicznych.

Po zakończeniu przebiegu zapisz wyniki, wyeksportuj je do programu Microsoft Excel i zapisz do dalszej analizy. Jedną z metod potwierdzania regulacji mikro RNA jest analiza D-Q-P-C-R cyjanku. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie starterów, których sekwencja dojrzałego mikro RNA, która jest równa starterowi do przodu, można uzyskać z zaledwie based.org.

Przekonwertuj wszystkie UES na ts Następnie przygotuj płytę CD NA, umieść jeden mikrogram całkowitego RNA i 1,5 mililitra probówkę wirówkową. Uwzględnij kontrolę ujemną z wodą zamiast całkowitego RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami dla ogona poli A i pierwszej nici CD nna.

Synteza mikro RNA z mikro RNA, pierwsza nić syntezy cDNA i protokołu Q-R-T-P-C-R. Rozcieńczyć powstałą płytę CD NA od 1 do 10 oczyszczoną wodą i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Otrzymać 1 96-dołkową płytkę reakcyjną.

Przygotować mieszankę wzorcową A-Q-P-C-R. Dla każdego mikro wzorca R-N-A-Q-P-C-R dobrze dodaj dwa picaMole każdego z określonych starterów do przodu i uniwersalny starter. Pięć mikrolitrów dwóch głównych mieszanek X-Q-P-C-R i oczyszczonej wody.

Podziel mieszaninę na każdy z nich. Cóż, na koniec dodaj 16 nanogramów poli a CD NA do każdej próbki i uwzględnij kontrole negatywne. Ostateczna objętość reakcji powinna wynosić 10 mikrolitrów na studzienkę Upewnij się, że dla każdej próbki dla każdej mikro RNA znajdują się potrójne studzienki dla kontrprób technicznych, jak również dla kontroli ujemnych.

Ponadto należy uwzględnić jeden lub kilka genów referencyjnych, zwykle U six s nrp, RNA i/lub mikro RNA, które nie są zmieniane w oprogramowaniu systemu Q-R-T-P-C-R. Przypisz reportera i cel Wprowadź objętość reakcji. Należy wybrać metodę porównawczego cyklu progowego i zdefiniować dołki próbki.

Uruchom blachy przy użyciu ustawień domyślnych dla przebiegu. Upewnij się, że analiza krzywej topnienia jest wykonywana dla wszystkich cykli cyjanu po zakończeniu cyklu. Zapisz wyniki i wyeksportuj wszystkie dane, w tym wartości CT, do programu Microsoft Excel.

Skuteczna ekstrakcja wysokiej jakości RNA z próbek jest ważnym czynnikiem sukcesu tego badania. Po ekstrakcji stężenia RNA mierzy się za pomocą spektrofotometru, jak pokazano w tym reprezentatywnym wyniku. Każdy pik zilustrowany w górnym panelu reprezentuje próbkę i udany proces ekstrakcji, w wyniku którego uzyskano czyste RNA.

W przeciwieństwie do tego, słabo wyekstrahowany RNA zilustrowany na dolnym panelu nie wykazuje wyraźnego piku absorpcji przy 260 nanometrach. W celu kontroli jakości RNA zmierzono integralność RNA, a wyniki porównano z drabinką RNA. 18 s i 28 S-R-R-N-A powinny mieć piki w dobrej jakości próbce RNA, jak pokazano tutaj.

Zdegradowana próbka RNA miałaby mniej wyraźne piki i zmniejszoną względną ilość 18 s i 28 S-R-R-N-A, jak pokazano tutaj. Analizę populacji mikro NA można przeprowadzić oddzielnie. Wyniki mikromacierzy mikro RNA z porównania między nośnikiem a dwiema próbkami poddanymi działaniu E są graficznie przedstawione przez tę mapę cieplną.

Tylko a, tylko B i tylko C są regulowane w górę w E dwóch próbkach poddanych działaniu substancji, jak wskazano na czerwono, podczas gdy tylko D, tylko e, tylko F i tylko G są regulowane w dół w próbce E dw, poddanej działaniu substancji E, jak wskazano na zielono. Selekcja mikro RNA zależy od ich znaczenia i ekspresji. Wartość P mniejsza niż 0,05 jest zwykle uważana za istotną i powinna być wybrana do dalszej walidacji za pomocą QPCR.

Podwójnie znakowane sondy o niskiej gęstości wykorzystują metodę opartą na A-Q-P-C-R do badań przesiewowych pod kątem regulowanych mikroRNA. W formacie 384 dołków przedstawiono wykresy amplifikacji dla mikro RNA z D-L-P-L-D-A wyniki przedstawiono tutaj. Na amplifikację ekspresji mikroRNA wskazuje wzrost wartości RN.

Walidacje można przeprowadzić przy użyciu dwóch metod wykrywania QPCR, aby zapobiec stronniczości metody i umożliwić dokładne potwierdzenie i zbadanie przepisów dotyczących mikro NA. Pierwsza metoda wykorzystuje detekcję barwnika cyjankowego do analizy krzywej topnienia mikro RNA jako kontroli amplifikacji. Specyficzność. Wzmocnienie zamierzonego fragmentu spowoduje uzyskanie wyraźnie zdefiniowanego, jednolitego piku, jak pokazano w lewym panelu.

Wiele pików można zaobserwować, jeśli starter jest niespecyficzny lub jeśli tworzą się określone ilości dimeru startera, jak pokazano na prawym panelu. W takim przypadku danych nie można użyć do analizy wyrażeń. Druga metoda, podwójnie znakowane sondy, analiza QPCR jest bardziej szczegółowa, ponieważ wykrywane są tylko amplifikacje docelowego mikro RNA na wykresach amplifikacji każdego celu.

Mikro RNA można zaobserwować, jak pokazano tutaj, dla obu testów QPCR. Porównanie z genem referencyjnym jest wymagane w celu określenia względnej ekspresji genów między dwiema próbkami. Przykładem odpowiedniego genu referencyjnego w tych liniach komórkowych raka piersi jest inhibitor dysocjacji A-R-H-G-D-I-A-A RO GDP.

Jak zaobserwowano na tym rysunku, poziom mRNA A-R-H-G-D-I-A nie zmienia się między nośnikiem a próbkami traktowanymi ligandem. Genem referencyjnym, który jest powszechnie akceptowany do analizy mikro RNA, jest U six snrp, RNA. Około 110 nukleotydów o długości niekodującego małego jądrowego RNA, który funkcjonuje w prem jądrowym.

Splicing, jak zaobserwowano na rysunku U, sześć poziomów ekspresji jest mniej więcej takich samych we wszystkich pokazanych próbkach, co pozwala na obliczenia zmiennych poziomów mikro RNA. Ten ostatni rysunek przedstawia graficzną reprezentację wyników mikro R-N-A-Q-P-C-R z nośnika i E dwóch leczonych komórek, porównując względne poziomy ekspresji określonego mikro RNA zaledwie 135 A w ciągu czasu. To mikro RNA zostało wykryte jako nieuregulowane do 24 godzin po leczeniu E 2, ale istotną regulację wykryto 72 godziny po leczeniu Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny receptora SDR N, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mikroRNA jest bezpośrednio regulowane przez receptor poprzez wiązanie się z regionami chromatyny regulatorowej CIS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować regulację mikroRNA za pośrednictwem estrogenu w solidny sposób. Bardzo ważne jest przeprowadzanie różnych kontroli i powielanie kroków opisanych w niniejszym protokole, aby upewnić się, że wykrywasz prawdziwe przepisy, a nie różnice biologiczne lub techniczne.