Name: Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 24 s
Description: Poznaj metodę profilowania mikroRNA regulowanych estrogenem w komórkach raka piersi. Technika obejmuje hodowlę komórek, ekstrakcję RNA i analizę mikromacierzową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni dr Xiaolian Gao z Uniwersytetu w Houston za udzielenie porad platformie mikromacierzy miRNA LC Sciences, dr Karin Edvardsson z Instytutu Karolinska w Szwecji oraz dr Eylem Aydogdu z Uniwersytetu w Houston za podzielenie się swoją wiedzą na temat miRNA. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer R01CA172437. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Prace te były również wspierane przez granty z Texas Emerging Technology Fund, na mocy umowy nr 300-9-1958.

<ol><li>Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol-activated+estrogen+receptor+alpha+does+not+regulate+mature+microRNAs+in+T47D+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).</li>
<li>Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol-regulated+microRNAs+control+estradiol+response+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).</li>
<li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+and+estrogen+action%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">miRNAs and estrogen action.</a> Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).</li>
<li>Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen-dependent+regulation+of+miRNA+biogenesis%3A+many+ways+to+skin+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat.</a> Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li>
<li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146(2009).</li>
<li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li>
<li>Ross, D. T., Perou, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+gene+expression+signatures+from+breast+tumors+and+breast+tissue+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Markers%22%5BJournal%5D)">A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines.</a> Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).</li>
<li>Neve, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+breast+cancer+cell+lines+for+the+study+of+functionally+distinct+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.</a> Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+separating+signal+from+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: separating signal from noise.</a> Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+using+microParaflo+microfluidic+array+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology.</a> Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).</li>
<li>Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+the+estrogenic+cell+growth+stimulation+of+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+study+of+the+repressive+effects+of+estrogen+receptor+beta+on+estrogen+receptor+alpha+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells.</a> Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).</li>
<li>Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+snRNA+function+in+nuclear+pre-mRNA+splicing%3A+a+phosphorothioate+interference+analysis+of+the+U6+phosphate+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone.</a> RNA. 1 (1), 46-54 (1995).</li>
<li>Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+the+culture+medium+strongly+affects+the+susceptibility+of+human+MCF-7+cells+to+roscovitine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine.</a> Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50 (4), 244-249 (2010).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+to+monitor+the+expression+of+microRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.</a> Nucleic Acids Res. 32 (4), e43(2004).</li>
<li>Setiawan, A. N., Lokman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+reference+gene+selection+programs+to+study+the+silvering+transformation+in+a+freshwater+eel+Anguilla+australis%3A+a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale.</a> BMC Mol. Biol. 11, 75(2010).</li>
<li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinform. 7, 85(2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Określenie mechanizmu hormonalnej regulacji miRNA w komórkach raka piersi może stanowić platformę do zrozumienia tej choroby i może zapewnić potencjalne leczenie raka piersi. Hodowla tych komórek w celu zapewnienia optymalnych warunków do działania hormonów jest bardzo ważna. W tym miejscu opisano protokół, który zapewnia, że hormon będący przedmiotem zainteresowania (estrogen) został wykluczony przed leczeniem i że optymalna dawka E2 została zastosowana przez odpowiedni czas podczas leczenia. Inne efekty hormonalne i czynniki wzrostu zostały utrzymane na minimalnym poziomie poprzez stopniowe obniżanie poziomu w surowicy i stosowanie DCC-FBS, czyli FBS, który został pozbawiony większości hormonów, cytokin i czynników wzrostu. Pożywki wolne od czerwieni fenolowej stosowano dalej w celu zminimalizowania innych efektów niehormonalnych, biorąc pod uwagę, że doniesiono, że czerwień fenolowa ma aktywność estrogenową i wpływa na pewne funkcje w liniach komórkowych20,21. Duże znaczenie ma czas ekspozycji komórek na hormon. W przypadku regulacji genów związanej z estrogenami wykazano wcześniej, że 24-godzinna ekspozycja powoduje znaczącą odpowiedź bezpośrednich genów docelowych w komórkach raka piersi1,18. Ponieważ miRNA są transkrybowane przez polimerazę RNA II, podobnie jak mRNA, można sobie wyobrazić, że jest to odpowiedni punkt czasowy do wykrycia bezpośredniej regulacji również miRNA. Nie wiadomo jeszcze, czy i jak te miRNA wpływają na ekspresję tych znanych celów ER w komórkach raka piersi.
Profilowanie ekspresji miRNA może być trudne ze względu na stosunkowo mały rozmiar miRNA, fakt, że dojrzałą sekwencję miRNA można znaleźć również w pri-miRNA i pre-miRNA, a także ze względu na niejednorodność ich zawartości GC22. Aby przezwyciężyć tę trudność, zastosowano kilka technik profilowania i środków chemicznych. Wśród nich znajdują się różne podejścia do analizy mikromacierzy i qPCR (ryc. 2). Chociaż mikromacierze są powszechnie akceptowane do analizy całego genomu, mogą dawać fałszywie ujemne wyniki i istnieją różnice między dostępnymi platformami, począwszy od chemii, a skończywszy na technologii drukowania23. Również proces normalizacji stanowi wyzwanie podczas analizy stosunkowo niewielu genów miRNA, które są liczone w tysiącach w porównaniu z dziesiątkami tysięcy transkryptów mRNA. Z drugiej strony qPCR jest bardziej czuły i lepiej się stosuje, gdy bierze się pod uwagę mniejszą liczbę genów. Jednak w przypadku wykonywania na dużych płytkach 384-dołkowych, z tylko jedną techniczną repliką na płytkę, wiele płytek musi być analizowanych dla każdej próbki, co sprawia, że analiza jest kosztowna. Ponadto w naszych rękach uzyskano znacznie więcej wyników fałszywie ujemnych przy użyciu analizy DLP-LDA w porównaniu z mikromacierzą. Biorąc pod uwagę, że dojrzała sekwencja miRNA jest obecna w sekwencjach pri-miRNA i pre-miRNA, interesujące jest różnicowanie tych transkryptów przy użyciu technik PCR24. Sondy DLP są również dostępne dla pre-miRNA, a specyficzne startery mogą być również zaprojektowane tak, aby wykluczyć różne dojrzałe lub prekursorowe warianty za pomocą technologii qPCR z barwnikiem cyjaninowym.
qPCR jest złotym standardem walidacji ekspresji różnicowej na podstawie wyników profilowania. Skuteczność qPCR zależy jednak od kilku parametrów, w tym ekstrakcji RNA, integralności RNA (jakości), syntezy cDNA, projektu startera, metody wykrywania (chemii) i genu referencyjnego do normalizacji danych1,22,25. Możliwości projektowania starterów do analizy miRNA są bardzo ograniczone, ponieważ krótka długość sekwencji miRNA nie daje miejsca na wiele alternatywnych projektów starterów, a w tej krótkiej sekwencji może być przechowywany tylko jeden starter. Stąd potrzeba alternatywnych manipulacji, jak pokazano na rysunku 2. Powtórzenia techniczne są ważne dla walidacji solidności metody amplifikacji i zastosowanego procesu. Kontrpróby biologiczne są niezbędne do przedstawienia ogólnej zmienności biologicznej, w tym zmiennej odpowiedzi na traktowanie ligandem, oraz do wykazania, że efekty obserwowane w komórce są powtarzalne. Z naszego doświadczenia wynika, że mogą wystąpić różnice w ekspresji miRNA między hodowlami komórkowymi. Zwykle różnice te są mniejsze niż 1,3-krotność, a średnia wartości i odpowiadające im SD identyfikują zmienność naturalną i technologiczną. Ta zmienność może wynikać z różnych czynników, w tym gęstości komórek i faktu, że funkcje komórek mogą się zmieniać z przejścia na pasaż. Aby zidentyfikować statystycznie istotne wyrażenia wynikające z traktowania ligandem, powszechnie akceptowanym znaczeniem jest sytuacja, gdy wartość p jest mniejsza niż 0,05. W tym przypadku wykorzystano test t studenta na powtórzeniach biologicznych i technicznych z wykorzystaniem parametrów rozkładu dwustronnego i nierównej wariancji dla dwóch prób. Istnieją inne parametry testu t, a wybór zależy od konfiguracji eksperymentalnej26.
Opracowano szczegółowy protokół oceny regulacji hormonalnych dojrzałego miRNA w komórkach raka piersi. Ważne technologie i chemia w profilowaniu i walidacji tych ekspresji miRNA zostały jasno wyjaśnione. Technologia wybrana do badań nad miRNA w komórkach raka piersi ostatecznie zależy od tego, co dokładnie jest badane.

Estrogen to hormon, który jest ważny podczas rozwoju gruczołu sutkowego. Estrogen odgrywa również ważną rolę w rozwoju, utrzymaniu, ryzyku i leczeniu raka piersi1. Estrogen pełni swoją funkcję poprzez wiązanie się z ER, które są czynnikami transkrypcyjnymi i regulują określone geny docelowe. Spośród dwóch wariantów receptorów, ERα jest niezbędny do zależnej od estrogenów proliferacji komórek raka piersi. Większość nowotworów piersi jest ERα-dodatnich i zależy od estrogenu do wzrostu. To sprawiło, że sygnalizacja estrogenowa i ERα stały się celem leczenia raka piersi z dodatnim receptorem hormonalnym. Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw ERα jest ważne dla poprawy wyników leczenia, przezwyciężenia oporności na leczenie i zrozumienia, jak rozwija się rak piersi.
miRNA odgrywają kluczową rolę w funkcjach komórek ze względu na ich duży wpływ na posttranskrypcyjną regulację genów. miRNA to 19-24 nukleotydy krótkie, jednoniciowe, niekodujące RNA, które są najpierw transkrybowane przez polimerazę II RNA do pierwotnych transkryptów miRNA (pri-miRNA). Są one przetwarzane w jądrze przez Drosha na prekursorowe miRNA o krótkiej spince do włosów (pre-miRNA), a następnie przetwarzane przez Dicer i rozdzielane na pojedyncze nici, tworząc dojrzałe miRNA w cytoplazmie. Jednoniciowe dojrzałe miRNA są przenoszone do białek Argonaute, tworząc kompleks RISC. Następnie miRNA mogą hybrydyzować z regionami 3'-nieulegającymi translacji (3'-UTR) docelowego mRNA, prowadząc do regulacji potranskrypcyjnej poprzez blokowanie translacji lub degradację docelowego mRNA2.
Ze względu na ważną rolę, jaką zarówno estrogen, jak i miRNA odgrywają w progresji guza, identyfikacja miRNA związanych z normalną lub zaburzoną sygnalizacją estrogenową jest ważna dla lepszego zrozumienia rozwoju i poprawy leczenia raka piersi. Chociaż istnieje dobre zrozumienie tego, w jaki sposób ERα reguluje geny kodujące białka, rozszerzenie i szczegóły regulacji niekodującego RNA pozostają do dokładnego zbadania. Wstępne badania mające na celu wyjaśnienie regulacji miRNA przez ERα w liniach komórkowych raka piersi przyniosły sprzeczne wyniki, nawet jeśli ta sama linia komórkowa została przeanalizowana3-6. Może to wynikać z różnych metod leczenia, różnic biologicznych, stosowania różnych technik oraz faktu, że mały rozmiar miRNA sprawia, że są one trudne do analizy. W tym miejscu opisano protokół, który kontroluje warianty i artefakty metody.
Aby zidentyfikować, które miRNA są regulowane przez estrogen, pierwszym krokiem jest profilowanie dobrze zdefiniowanego modelu aktywności ERα raka piersi. Kilka linii komórkowych zostało wygenerowanych z ludzkich ERα-dodatnich guzów raka piersi, które są zależne od estrogenu, podobnie jak większość klinicznych nowotworów piersi. Właściwości molekularne dwóch z tych linii komórkowych, T47D i MCF7, w tym ekspresja ERα i jego dalszego celu, receptora hormonu progesteronu (PR), brak ekspresji receptora błonowego HER2, wraz z ekspresją genów różnicowania reagującego na estrogen i luminalno-nabłonkowego, sprawiają, że nadają się one jako modele dla podtypu luminalnego guzów piersi7-10. 17β-estradiol (E2) jest dominującą formą estrogenu, a stężenia i punkty czasowe dla optymalnej aktywacji transkrypcyjnej ERα zostały scharakteryzowane w wielu badaniach. W tym protokole stosuje się leczenie 10 nM E2 przez 24 godziny oraz T47D i MCF7 jako modele aktywności ERα w komórkach raka piersi1. Ponadto zależne od czasu regulacje miRNA mogą być szczegółowo analizowane w przedziale czasowym np. 1-72 godzin.
Po drugie, analiza miRNA ma osobne wyzwania, częściowo ze względu na ich krótkie rozmiary. miRNA nie są dobrze zachowywane w całkowitym preparowaniu RNA, gdy przeprowadza się regularne wytrącanie RNA tiocyjanianianu guanidyny, fenolu/chloroformu/izopropanolu, lub gdy stosuje się standardowe oczyszczanie kolumn. Należy podjąć specjalne środki ostrożności w celu utrzymania lub wzbogacenia o mniejszą frakcję RNA. Zwiększając objętość izopropanolu, obniżając temperaturę przed odwirowaniem (-80 °C) i pomijając mycie w 70% etanolu, można zwiększyć zatrzymywanie miRNA podczas wytrącania. Można też użyć specjalnych kolumn i do wysokiej jakości i solidnego przygotowania całkowitego RNA zawierającego miRNA. Również dla samej analizy ich krótkie rozmiary stwarzają wyzwania. W przypadku badań przesiewowych miRNA całego genomu do wyboru są trzy popularne techniki profilowania miRNA: mikromacierze, qPCR i sekwencjonowanie nowej generacji. Każda technika może być wykonywana przy użyciu wielu różnych platform i wymagane jest różne przygotowanie próbek, z których każda wiąże się z innym ryzykiem wprowadzenia artefaktów. W mikromacierzy miRNA szkiełko jest nakrapiane lub syntetyzowane z tysiącami oligonukleotydów. Te oligonukleotydy są używane jako sondy, a każda z sond jest zaprojektowana do hybrydyzacji z określoną sekwencją miRNA. Przygotowanie próbki do mikromacierzy, jak przeprowadzono w tym badaniu, najpierw wzbogaca na miRNA, a następnie wprowadza znakowanie Cy5 i Cy3 do miRNA. Mikromacierz daje możliwość obserwacji względnych poziomów ekspresji dużej liczby genów jednocześnie, jest szybka i nadaje się do badań przesiewowych dużej liczby próbek, ale może analizować tylko sekwencje obecne na mikromacierzy i np. nie wykryje zmian w nieznanych lub zmutowanych miRNA. Analiza mikromacierzy wykonywana w tym protokole wymaga również stosunkowo dużych ilości, około 5 μg, całkowitego RNA na próbkę do analizy. Profilowanie miRNA qPCR o niskiej gęstości wymaga mniejszej ilości materiału (700 ng / próbkę i replikat) i pozwala na wykrywanie i kwantyfikację miRNA. Poziomy transkrypcji można określić, a ilość może być ilością bezwzględną lub względną. Analiza qPCR najpierw wymaga konwersji miRNA do cDNA, w tym przypadku przy użyciu zapętlonego startera dla każdego specyficznego miRNA, zapewniając analizę tylko dojrzałego miRNA. Generuje to dłuższą matrycę, która może być amplifikowana przy użyciu specyficznego dla miRNA startera do przodu i uniwersalnego startera wstecznego uzupełniającego sekwencję zapętloną, a także może zawierać włączenie podwójnie znakowanej sondy w celu uzyskania specyficzności. qPCR może być stosowany w formacie o niskiej gęstości, w którym setki miRNA mogą być wykrywane równolegle przy użyciu jednej lub kilku 384-dołkowych płytek z indywidualnymi parami starterów w każdym dołku11. Z drugiej strony sekwencjonowanie nowej generacji jest jedyną z tych technik, która pozwala na odkrycie nowych, zmutowanych lub edytowanych miRNA, ponieważ wszystkie RNA w próbce można zsekwencjonować11. Technika ta wymaga jednak wielu etapów w celu wzbogacenia małych RNA i wytworzenia małej biblioteki RNA przy użyciu kilku etapów ligacji i oczyszczania łączników, a następnie zwiększonego ryzyka modulacji ich względnych poziomów ekspresji między próbkami. Wymaga to również znacznych analiz bioinformatycznych. Biorąc pod uwagę różne techniki profilowania miRNA, najbardziej odpowiednia technika zależy od zastosowań. Mikromacierze są najbardziej odpowiednie, gdy materiał jest stosunkowo obfity, a zainteresowanie polega na zdefiniowaniu zróżnicowanej ekspresji już znanych miRNA. Macierze qPCR o niskiej gęstości są najbardziej odpowiednie, gdy dostępna jest ograniczona ilość próbki i wymagana jest wysoka czułość miRNA o niskiej ekspresji. Sekwencjonowanie jest najbardziej odpowiednie, gdy wymagana jest analiza nieznanych miRNA, zmutowanych lub różnych izoform miRNA.
W badaniu regulowanych estrogenem miRNA w raku piersi, używane są dwie modelowe linie komórek, T47D i MCF7, gdzie duże ilości RNA są łatwo dostępne. Każda linia komórkowa była analizowana w replikowanych kulturach komórkowych przy użyciu różnych pasaży, każda w technicznych powtórzeniach leczenia. Pozwala to na niezawodne wykrywanie powtarzalnych, regulowanych przez ERα miRNA. Względne poziomy ekspresji miRNA porównano przy użyciu zarówno mikromacierzy miRNA, jak i podwójnie znakowanych sond - matryc o niskiej gęstości (DLP-LDA) i zweryfikowano wyniki za pomocą specyficznego qPCR przy użyciu zarówno barwnika cyjaninowego, jak i chemii DLP. Regulacje miRNA zostały następnie poddane dalszej analizie w szeregach czasowych w celu określenia ich dokładnej regulacji w czasie, co może pomóc w odróżnieniu losowych lub okołodobowych zmian od regulacji wywołanych estrogenem i wskazać pierwotne skutki od efektów wtórnych. Porównania bioinformatyczne z badaniami wiązania chromatyny przez ERα mogą dodatkowo pomóc w różnicowaniu efektów pierwotnych i wtórnych. Test doprowadził do wiarygodnej oceny regulacji miRNA, w której można było ustalić, że po 24 godzinach leczenia E2 transkrypty kodujące białka były łatwo regulowane, ale dojrzałe miRNA niebyły dotknięte 1. Możliwe jest jednak, że miRNA są regulowane w późniejszych punktach czasowych, jak wykazano w analizie szeregów czasowych wybranych miRNA1. Szczegóły wymagają dalszych badań, a przedstawiony tutaj protokół zapewnia solidny sposób badania hormonalnej regulacji dojrzałych miRNA w liniach komórkowych raka piersi.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol bez czerwieni DMEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>EMD Millipore</td><td>Specjalistyczne wyposażenie</td><td></td></tr><tr><td>DCC-FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>tabletka PBS</td><td>Medicago, Dokładne chemikalia</td><td>Dokładny (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td><td></td></tr><tr><td>17&beta;- estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4409</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-600ML</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórek T47D lub MCF7</td><td>Amerykańska kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>T47D (ATCC HTB-133) i MCF7 (ATCC HTB-22)Kolba</td><td></td></tr> <tr><td>T-75&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BD353136 (nasadka wentylowana)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>VWR International LLC</td><td>53300. Do 5mL (53300-421)</td><td></td></tr><tr><td>Komora do liczenia komórek Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td> Life <td>Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 100 mm&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tiocyjanianu guanidyny-fenolu (TRizol)</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek gumowych&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>82050-470</td><td></td></tr><tr><td>Metoda tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy bez rnazy I&nbsp; (degradacja DNA)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz (woda wolna od nukleaz)</td><td>Thermoscientific</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop 1000&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Zestaw do testów Nano</td><td>Agilent</td><td>5067-1512</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent</td><td>G2938C i dla oprogramowania (G2946)</td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie startery (z wyjątkiem starterów TaqMan)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>specyficzne dla każdego rzędu dla każdego genu/miRNA</td><td></td></tr><tr><td>Bufor pierwszej nici, DTT, dNTPs, indeks górny III (zestaw do syntezy cDNA w indeksie górnym III)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka 96-dołkowa płytka reakcyjna&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie optyczne powłoki samoprzylepne Life</td><td>Technologies</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>2x SYBR green PCR master mix (barwnik cyjaninowy)</td><td>Life Technologies</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym i oprogramowanie</td><td>Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Technologia mikroprzepływowych biochipów Paraflo&nbsp;</td><td>LCSciences</td><td>MRA-1001 i AS-2001 (do analizy wyników)</td><td></td></tr><tr><td>DLP-LDA (TLDA) Test pul megapleksowych (startery Rt/zestaw puli ludzkiej)</td><td>Life Technologies</td><td>4400928</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie znakowane sondy (TaqMan) Zestaw miRNA RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler GeneAmp PCR System 9700</td><td>Life Technologies</td><td>4310899</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie znakowane sondy (TaqMan) 2x Uniwersalny system PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Technologie życia</td><td>4329001</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do zarządzania SDS i RQ</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>4444202</tr><tr><td>NCode miRNA Synteza pierwszej nici cDNA i zestaw qRT-PCR</td> Life <td>Technologies</td><td>MIRC-50</td><td></td></tr><tr><td>10x DPL (TaqMan) RT startery</td><td>Life Technologie</td><td>specyficzne dla każdego miRNA</td><td></td></tr><tr><td>20x DPL (TaqMan) starter do testów w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>specyficzne dla każdego miRNA</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie regulowanych estrogenem mikrorna w komórkach raka piersi

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen odgrywa istotną rolę w rozwoju gruczołu sutkowego i progresji raka piersi. Pośredniczy w jego funkcjonowaniu poprzez wiązanie się i aktywację receptorów estrogenowych (ER), ERα i ERβ. ERα jest często regulowany w górę w raku piersi i napędza proliferację komórek raka piersi. ER działają jako czynniki transkrypcyjne i regulują ekspresję genów. Podczas gdy regulacja genów kodujących białka przez ERα jest dobrze ugruntowana, jej regulacja niekodującego mikroRNA (miRNA) jest mniej zbadana. miRNA odgrywają główną rolę w potranskrypcyjnej regulacji genów, hamując ich translację lub degradując ich mRNA. miRNA mogą funkcjonować jako onkogeny lub supresory nowotworów, a także są obiecującymi biomarkerami. Wśród dostępnych testów miRNA, mikromacierze i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) są szeroko stosowane do wykrywania i ilościowego określania poziomów miRNA. Aby zidentyfikować miRNA regulowane przez sygnalizację estrogenową w raku piersi, porównano ich ekspresję w ERα-dodatnich liniach komórkowych raka piersi przed i po aktywacji estrogenu przy użyciu zarówno mikroukładów mikroprzepływowych μParaflo, jak i podwójnie znakowanych sond o niskiej gęstości. Wyniki zweryfikowano przy użyciu specyficznych testów qPCR, przy zastosowaniu zarówno chemii opartej na barwniku cyjaninowym, jak i na podwójnie znakowanych sondach. Ponadto wykorzystano test punktu czasowego w celu zidentyfikowania regulacji w czasie. Zaletą podejścia do oznaczania miRNA zastosowanego w tym badaniu jest to, że umożliwia ono szybkie badanie przesiewowe dojrzałych regulacji miRNA w wielu próbkach, nawet przy ograniczonych ilościach próbek. Układ, w tym specyficzne warunki hodowli komórkowej i leczenia estrogenami, biologiczne i techniczne kontrpróby oraz badania przesiewowe na dużą skalę, po których następują dogłębne potwierdzenia przy użyciu oddzielnych technik, zapewnia solidne wykrywanie regulacji miRNA i eliminuje wyniki fałszywie dodatnie i inne artefakty. Jednak zmutowane lub nieznane miRNA lub regulacje na poziomie transkryptu pierwszorzędowego i prekursorowego nie zostaną wykryte. Przedstawiona tutaj metoda stanowi dokładne badanie regulacji miRNA za pośrednictwem estrogenów.

Przegląd podejścia przedstawiono na Rysunku 1, a porównanie różnych przygotowań próbek i modyfikacji kwasów nukleinowych wymaganych dla każdej techniki zilustrowano na Rysunku 2.
Stan i środowisko komórek przed potraktowaniem hormonem są istotne dla określenia rzeczywistych efektów działania tego hormonu16. Niektóre pożywki i surowice zawierają czynniki wzrostu, które mogą wpływać na wyniki, dlatego komórki poddaje się głodzeniu surowicowemu, aby zapewnić zminimalizowanie wszelkich efektów hormonalnych. Dzięki temu, podczas traktowania E2, istnieje większa pewność, że obserwowane efekty są związane z E2. Ważnym czynnikiem jest konfluencja komórek, która wpływa na kontakt międzykomórkowy oraz procesy takie jak sygnalizacja międzykomórkowa i proliferacja. Pozwolono komórkom osiągnąć 80% konfluencji (Ryc. 3A) oraz zapewniono ich dobre przyleganie, aby umożliwić wzrost i uniknąć utraty komórek podczas późniejszego przemywania i wymiany pożywki.
Warunki podczas ekstrakcji i przechowywania RNA są istotne dla jakości RNA i późniejszej analizy. Wiadomo również, że liczba komórek, metoda ekstrakcji oraz zawartość GC w miRNA mogą wpływać na wydajność i jakość zarówno mRNA, jak i miRNA17. W związku z tym konieczne jest przeprowadzanie ekstrakcji RNA w warunkach wolnych od RNaz oraz sprawdzenie jakości RNA przed przystąpieniem do eksperymentów. Po ekstrakcji kwantyfikacja RNA dostarcza informacji o stężeniu całkowitego RNA (zawierającego zarówno mRNA, jak i miRNA), co umożliwia ocenę wydajności. Zapewnia ona również graficzną reprezentację wyników, jak pokazano na Rysunku 3B, co pozwala na obserwację czystości próbki (zazwyczaj wskazywanej przez jeden pik, górny panel). Niska wydajność RNA nie wywołałaby specyficznego pochłaniania przy 260 nm (Rysunek 3B, dolny panel). Aby określić, czy RNA jest wysokiej jakości, zmierzono integralność RNA. Wartość wskaźnika integralności RNA (RIN) w zakresie 9–10 gwarantuje, że RNA nie jest zdegradowane i ma optymalną jakość. Należy również przeanalizować graficzną reprezentację RNA; rRNA 18S i 28S powinny wykazywać piki, tak jak pokazano na Rysunku 4 (środkowy panel). Porównanie z drabiną (Rysunek 4, górny panel) pozwala zidentyfikować wielkość pików. Zdegradowane RNA charakteryzowałoby się mniej wyraźnymi pikami i zmniejszoną względną ilością rRNA 18S i 28S (Rysunek 4, dolny panel). Udział małych RNA można dodatkowo potwierdzić przy użyciu zestawu Agilent Small RNA Kit. Zaleca się walidację odpowiedzi na estrogen po traktowaniu, w określonych warunkach eksperymentalnych, przed przystąpieniem do przesiewu miRNA. qPCR można przeprowadzić dla znanego genu docelowego ER, takiego jak pS2 lub SPINK4 18, używając matrycy cDNA. Geny te są zazwyczaj uregulowane w górę w czasie od 1 do 24 h po traktowaniu E2. Po ocenie jakości RNA oraz odpowiedzi na estrogen można przeprowadzić dalsze eksperymenty.
Mikromacierze są nadal szeroko stosowaną techniką w wielkoskalowym przesiewowaniu ekspresji miRNA w komórkach. Na przykład, użyta niegdyś mikromacierz miRNA zawierała 894 dojrzałe miRNA oraz 50 sond kontrolnych, z których każda występowała w czterech kopiach1. Hybrydyzacje przeprowadzano w duplikacie z zastosowaniem procedury zamiany barwników (dye swap). Wyniki mikromacierzy miRNA są zazwyczaj przedstawiane graficznie w formie map ciepła. Rysunek 5A przedstawia mapę ciepła reprezentującą dane z porównania mikromacierzy miRNA pomiędzy próbkami kontrolnymi (vehicle) a próbkami traktowanymi E2. Kolor czerwony wskazuje, że miRNA wykazuje nadekspresję w próbce traktowanej E2 (wyższa ekspresja), natomiast kolor zielony wskazuje na obniżoną ekspresję miRNA (niższa ekspresja). Wybór miRNA zazwyczaj zależy od istotności ich ekspresji, przy czym za istotną uznaje się zazwyczaj wartość p mniejszą niż 0,05. miRNA wskazane jako różnicowo wyrażone powinny zostać następnie zwalidowane za pomocą qPCR, aby odróżnić je od wyników fałszywie dodatnich.
Z kolei macierz DLP-LDA wykorzystuje metodę opartą na qPCR do przesiewania regulowanych miRNA w formacie 384 dołków. Zazwyczaj dostarczane są dwie płytki 384-dołkowe (karty), pule A i B. Pula A zazwyczaj zawiera lepiej scharakteryzowane i silniej ekspresowane miRNA niż pula B. Względny poziom każdego miRNA jest określany za pomocą qPCR, gdzie w jednym dołku analizowane jest jedno miRNA (Rysunek 5B). Wyższa wartość Ct wskazuje na niższą ekspresję miRNA. Podobnie jak w przypadku mikromacierzy miRNA, wyniki uzyskane z DLP-LDA wymagają dalszej walidacji w celu zapewnienia dokładności.
Walidacje można przeprowadzić za pomocą qPCR. Opisano tutaj dwie metody detekcji qPCR, aby zapobiec błędowi systematycznemu metody oraz umożliwić dokładne potwierdzenie i badanie regulacji miRNA. Chemia detekcji oparta na barwnikach cyjaninowych działa inaczej niż DLP, na którym opiera się profilowanie DLP-LDA, i jest odpowiednia do celów potwierdzających. Może być mniej specyficzna, ponieważ wykrywa całe amplifikowane dwuniciowe DNA, ale jednorodność próbki można ocenić, wykonując analizę krzywej topnienia. Rysunek 6A (panel lewy) przedstawia analizę krzywej topnienia miRNA, na której widoczny jest wyraźnie zdefiniowany jednorodny pik. W przypadku niespecyficznego primera lub powstania znacznych ilości dimerów primerów zaobserwowano by wiele pików (Rysunek 6A, panel prawy). Z kolei testy miRNA DLP są bardziej specyficzne, ponieważ wykrywana jest tylko amplifikacja docelowego miRNA. Wykresy amplifikacji każdego docelowego miRNA można zaobserwować, jak pokazano na Rysunku 6B. Możliwość kontroli występowania wielu produktów amplifikacji za pomocą analizy krzywej topnienia nie jest jednak dostępna w tej chemii, a qPCR z barwnikiem cyjaninowym jest tańszy. Testy qPCR z barwnikiem cyjaninowym i DLP mogą czasami dawać nieco różne wyniki. W obu przypadkach qPCR wymagane jest porównanie z genem referencyjnym w celu określenia względnej ekspresji genów między dwiema próbkami. Gen referencyjny, nazywany również genem housekeepingowym, powinien być genem, którego ekspresja nie zmienia się i która odbywa się na poziomach podobnych do genu badanego. Przykładem odpowiedniego genu referencyjnego w tych liniach komórkowych raka piersi jest ARHGDIA, inhibitor dysocjacji GDP białek Rho, który uczestniczy w reakcjach wymiany GDP/GTP białek Rho. Jak widać na Rysunku 6C (góra), poziom mRNA ARHGDIA nie zmienia się między próbkami kontrolnymi a próbkami traktowanymi ligandem. Można również użyć 18S rRNA, choć jego wysoka ekspresja wymaga oddzielnego rozcieńczenia zapasu cDNA w stosunku 1:500, przez co jest on mniej odpowiedni. W przypadku analizy miRNA wciąż trwa dyskusja nad dobrze zdefiniowanym genem referencyjnym. Do tej pory U6 snRNA jest genem referencyjnym szeroko akceptowanym w analizie miRNA. U6 snRNA to niekodujące małe jądrowe RNA o długości ok. 110 nukleotydów, które bierze udział w splicingu pre-mRNA w jądrze komórkowym19. Jak widać na Rysunku 6C (dół), poziomy ekspresji U6 są niemal takie same we wszystkich pokazanych próbkach, co pozwala na obliczenie zmiennych poziomów miRNA. Graficzną reprezentację wyniku qPCR miRNA dla porównania między komórkami kontrolnymi a traktowanymi E2, które zostały znormalizowane do referencyjnego U6, można zaobserwować na Rysunku 6D. Ilustruje to miRNA, które zostało wykryte jako nieregulowane po 24 h traktowania E2, ale posiada miejsca wiązania chromatyny ER blisko swojej lokalizacji genomicznej, a analiza szeregów czasowych wykazała istotną regulację 72 h po traktowaniu.
<img alt="Schemat hodowli komórkowej; ekstrakcja RNA i przesiewanie miRNA za pomocą mikromacierzy i qPCR; ekspresja genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd podejścia zastosowanego do wykrywania hormonalnej regulacji miRNA w komórkach raka piersi. Proces rozpoczyna się od hodowli i traktowania komórek, po czym następuje wielkoskalowe profilowanie miRNA w celu zidentyfikowania potencjalnie różnicowo wyrażanych miRNA, a kończy się walidacją wyników z macierzy za pomocą qRT-PCR.
<img alt="Metody analizy RNA: konfiguracja mikromacierzy, DLP i proces barwienia cyjaninami; transkrypcja, synteza cDNA." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Porównanie różnych metod przygotowania próbek i manipulacji kwasami nukleinowymi dla każdej techniki detekcji miRNA. (A) Mikromacierze miRNA z wykorzystaniem technologii µParaflo obejmują wzbogacanie, dodawanie ogonów poli-A oraz znakowanie poprzez ligację. (B) Metoda przygotowania próbek i detekcji w technologii DLP obejmuje zastosowanie zapętalonego primera do syntezy cDNA, który wydłuża się po etapie denaturacji, zapewniając dłuższy fragment zawierający sekwencję primera odwrotnego oraz sondy. (C) Metoda przygotowania próbek i detekcji w technologii barwienia cyjaninami obejmuje dodawanie ogonów poli-A oraz syntezę cDNA z użyciem primerów oligo-dT zawierających uniwersalną sekwencję 5'.
<img alt="Morfologia komórek na obrazie mikroskopowym, wykresy widm absorpcji UV-Vis przedstawiają stężenia białek" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Hodowla komórek i ekstrakcja RNA. (A) Hodowane komórki ilustrujące 80% konfluencji wymaganej przed traktowaniem ligandem. (B) Graficzne przedstawienie stężenia i czystości RNA po ekstrakcji. Każdy pik reprezentuje próbkę; pomyślny proces ekstrakcji daje czyste RNA (panel górny). RNA o niskiej jakości ekstrakcji nie wykazuje wyraźnego piku absorpcji przy 260 nm (panel dolny).
<img alt="Wykres elektroforezy przedstawiający analizę RNA z markerem wielkości, szczytami dla RNA nienaruszonego i zdegradowanego w czasie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Kontrola jakości RNA. Wyniki analizy integralności RNA przedstawione na wykresach dla markera (góra), RNA dobrej jakości (środek) oraz próbki RNA zdegradowanego (dół).
<img alt="Mapa ciepła i wykres qPCR, analiza ekspresji miRNA, wyniki eksperymentalne, badanie ekspresji genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ilustracja wyników profilowania miRNA. (A) Mapa ciepła prezentująca wyniki mikromacierzy miRNA dla różnicowo eksponowanych miRNA. miR-A, B, C wykazują nadekspresję w próbce traktowanej E2, co zaznaczono kolorem czerwonym, natomiast miR-D, E, F, G wykazują niedoekspresję w próbce traktowanej E2, co zaznaczono kolorem zielonym. (B) Wykresy amplifikacji dla każdego miRNA z wyników DLP-LDA. Wykryte miRNA ulegają amplifikacji, co wskazuje wzrost wartości Rn.
<img alt="Wykresy temperatury amplifikacji DNA względem cyklu; wykresy słupkowe ekspresji; wyniki analizy qPCR." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Analiza qPCR regulacji miRNA. (A) Analiza krzywych topnienia dla miRNA analizowanego przy użyciu detekcji barwnikiem cyjaninowym, wykazująca homogeniczność wszystkich badanych próbek (po lewej) oraz amplifikację wielu fragmentów (po prawej). (B) Wykresy amplifikacji dla każdej próbki dla danego miRNA. Mogą one pochodzić z metod detekcji barwnikiem cyjaninowym lub DLP. (C) Przedstawienie na wykresie słupkowym odpowiednich genów referencyjnych dla analizy mRNA ARHGDIA (góra) oraz dla analizy miRNA snRNA U6 (dół), wykazujące brak istotnej różnicy w ekspresji między próbkami. (D) Wyniki qPCR dla miRNA ilustrujące porównanie względnych poziomów ekspresji miR-135a w czasie. Rycina 6D została przedrukowana z pracy Katchy et al.1 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Wartości stanowią zazwyczaj średnią z oddzielnych eksperymentów (duplikaty biologiczne) ±SD. Do wykazania istotności statystycznej zastosowano test t Studenta: * p&lt;0.05.

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zdefiniowanie mikroRNA, których ekspresja może być regulowana przez receptory estrogenowe. Osiąga się to poprzez przygotowanie komórek do maksymalnej odpowiedzi na estrogeny, co obejmuje hodowlę do optymalnej konfluencji oraz usunięcie aktywności estrogenowej. Drugim krokiem jest indukcja aktywności transkrypcyjnej receptorów estrogenowych poprzez traktowanie estradiollem w określonych punktach czasowych.W celu porównania zastosowano odpowiednie kontrole. Następnie wyekstrahowano RNA, w tym populację mikro RNA, i przekształcono je w cDNA znane z regulacji przez estrogeny. Poziomy genów docelowych zmierzono za pomocą qPCR, aby potwierdzić skuteczność protokołu traktowania.Ostatnim krokiem jest określenie wzorca ekspresji mikroRNA w całym genomie przy użyciu technologii szerokiego przesiewu. W końcowej fazie przeprowadza się analizę potwierdzającą metodą QPCR. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi, takie jak to, czy i w jaki sposób estrogen wpływa na ekspresję mikroRNA.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat raka piersi, można ją również zastosować do innych układów, takich jak inne nowotwory lub typy komórek wykazujące ekspresję receptora estrogenowego alfa lub beta. Komórki MC7 użyte w tym badaniu są przygotowywane pięć dni przed opracowaniem w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Usuń medium z kolby T75 za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni.Przyczepione komórki delikatnie przemyj dwukrotnie PBS, a następnie odłącz je za pomocą trypsyny. Policz komórki za pomocą licznika komórek zgodnie z protokołem producenta. Oznakuj sześć płytek o pojemności 100 ml i do każdej z nich dodaj 10 ml pożywki.Przesiej około 2 milionów komórek na płytkę i rozmieść je, delikatnie potrząsając płytką. Inkubuj komórki od 24 do 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż osiągną konfluencję na poziomie około 80%. Dwa do czterech dni później wyjmij komórki z inkubatora 37 °C i obejrzyj pod mikroskopem, aby upewnić się, że są one w konfluencji około 80%.Stopień konfluencji komórek jest istotnym czynnikiem, ponieważ wpływa on na kontakt międzykomórkowy oraz takie procesy jak sygnalizacja międzykomórkowa i proliferacja. Przemyj komórki dwukrotnie solą PBS, a następnie dodaj odpowiednią pożywkę z 5% FBS, która została przefiltrowana w celu usunięcia związków estrogennych. Inkubuj komórki w FBS traktowanym węglem aktywnym (Dexter coated charcoal treated FBS lub D-C-C-F-B-S) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2; procedurę kontynuuj następnego dnia.Przemyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj odpowiednie medium z 0,5% D-C-C-F-B-S; inkubuj komórki przez kolejne 48 godzin w dniu traktowania. Przygotuj odczynniki do traktowania komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Najpierw dodaj 30 ml odpowiedniego medium z 0,5% D-C-C-F-B-S, a następnie trzy µL roztworu stokowego liganda E two o stężeniu 0,1 mM; przemyj komórki dwukrotnie PBS.Należy usunąć jak największą ilość PBS. Delikatnie wymieszać zawartość każdej probówki i dodać 10 mililitrów do komórek na każdej płytce. Na każdą płytkę powinien przypadać jeden ligand.Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez wybrany okres czasu od 0 do 72 godzin. W razie potrzeby wymienić pożywkę po zakończeniu traktowania przez pożądany czas. Wyjąć płytki z inkubatora i przenieść je do dygestorium.Ponieważ w tej procedurze stosowany jest toksyczny roztwór tiocyjanianu guanydyny i fenolu, należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej; komórki należy przemyć dwukrotnie buforem PBS. Następnie do komórek w każdej płytce należy dodać od jednego do dwóch mililitrów roztworu tiocyjanianu guanydyny i fenolu. Należy upewnić się, że objętość komórek nie przekracza 10% objętości roztworu tiocyjanianu guanydyny i fenolu oraz że płytka jest w całości pokryta roztworem.Pozostawić komórki na jedną minutę. Następnie, za pomocą gumowej skrobaczki, zebrać komórki i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi. Komórki w tej probówce można przechowywać w tym roztworze w temperaturze -80°C przez kilka tygodni.Wyodrębnienie wysokiej jakości RNA jest kluczowe dla powodzenia tej procedury. Dlatego też kolejne kroki muszą być wykonywane w warunkach wolnych od RNazy. Aby wyizolować całkowite RNA z każdej grupy badawczej, należy mieszać zawiesinę komórkową w wirówce typu vortex przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować.Do każdego 1 ml roztworu guanidynianu tiocyjanianu i fenolu dodać 200 µL chloroformu. Mieszać w wortexie przez 15 s, a następnie inkubować od dwóch do trzech minut w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 11 000 RPM w temperaturze 4 °C przez 15 min. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirowania.Dodaj 1,5 objętości 100% etanolu i wymieszaj pipetując. Przenieś roztwór do kolumny wiriówek i oczyść RNA za pomocą kolumny do oczyszczania mikro-RNA, a następnie przeprowadź degradację DNa 1D NA zgodnie z protokołem producenta. Następnie RNA rozpuść w 60 µL wolnej od RNazy wody, pobierz od 1 do 2 µL RNA do kwantyfikacji i analizy jakości, a pozostałą część RNA przechowuj w temperaturze -80 °C.Po potwierdzeniu, że potraktowanie komórek doprowadziło do regulacji znanych celów responsywnych na estrogeny, takich jak mRNA, przeprowadza się profilowanie mikroRNA przy użyciu mikroprzepływowego systemu micropower flow, mikromacierzy i sond z podwójnym znakowaniem, macierzy o niskiej gęstości lub D-L-P-L-D-A w celu wykonania profilowania mikroRNA za pomocą D-L-P-L-D-A. Wyjmij płytki D-L-P-L-D-A z lodówki i pozostaw je w temperaturze pokojowej podczas przeprowadzania reakcji odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA z próbek RNA. Gdy płytki D-L-P-L-D-A osiągną temperaturę pokojową, nanieś 100 µL cDNA zmieszanego z sondami z podwójnym znakowaniem i mieszaniną PCR master mix do każdego z ośmiu portów napełniających płytki.Odwiruj płytki macierzowe. Na krótko otwórz system Q-R-T-P-C-R i upewnij się, że blok jest przeznaczony dla płytki 384-dołkowej. Skonfiguruj uruchomienie.Używając oprogramowania SDS, wybierz ilościowanie względne. Wybierz numer dołka oraz typ macierzy i wprowadź opisy próbek, aby zdefiniować dołki. Przeprowadź analizę macierzy, stosując domyślne warunki cyklicznego termostatowania.Po zakończeniu procesu należy zapisać wyniki, wyeksportować je do programu Microsoft Excel i zachować do dalszej analizy. Jedną z metod potwierdzania regulacji mikroRNA jest analiza qPCR. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie starterów; sekwencja dojrzałego mikroRNA, która odpowiada starterowi bezpośredniemu, może zostać pobrana z witryny mirbase.org.Przenieś wszystkie próbki UES do kolejnego etapu, przygotuj zestaw do syntezy cDNA, odmierz 1 µg całkowitego RNA i przygotuj probówkę do wirowania o pojemności 1,5 ml. Uwzględnij kontrolę negatywną, stosując wodę zamiast całkowitego RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi dołączania ogona poly A oraz syntezy pierwszej nici cDNA.Synteza mikro-RNA z syntezy pierwszej nici cDNA mikro-RNA oraz protokół qRT-PCR. Rozcieńczyć otrzymane cDNA w stosunku 1:10 wodą oczyszczoną i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 96-dołkową płytkę reakcyjną.Przygotuj mieszaninę master mix do A-Q-P-C-R. Do każdej studzienki mikro R-N-A-Q-P-C-R dodaj po dwie picaMole specyficznego primera forward oraz primera uniwersalnego. Dodaj pięć mikrolitrów 2X-Q-P-C-R master mix oraz wodę oczyszczoną.Rozdziel mieszaninę do poszczególnych studni. Na koniec dodaj 16 ng poly A CD NA do każdej próbki oraz uwzględnij kontrole negatywne. Końcowa objętość reakcji powinna wynosić 10 µL na studnię. Upewnij się, że dla każdej próbki i każdego mikro RNA przygotowano trzy powtórzenia techniczne, podobnie jak w przypadku kontroli negatywnych.Dodatkowo należy uwzględnić jeden lub kilka genów referencyjnych, zazwyczaj U6 snRNA i/lub mikroRNA, których poziom nie ulega zmianie w oprogramowaniu systemu qRT-PCR. Przypisz reporter i cel. Wprowadź objętość reakcji. Wybierz metodę porównawczego cyklu progowego i zdefiniuj studzienki z próbkami.Uruchom płytki, korzystając z domyślnych ustawień cyklu. Upewnij się, że po zakończeniu każdego cyklu z użyciem barwnika cyan przeprowadzona zostanie analiza krzywej topnienia. Zapisz wyniki i wyeksportuj wszystkie dane, w tym wartości CT, do programu Microsoft Excel.Efektywna ekstrakcja wysokiej jakości RNA z próbek jest kluczowym czynnikiem warunkującym powodzenie niniejszego badania. Po ekstrakcji stężenia RNA są mierzone za pomocą spektrofotometru, co przedstawiono na tym reprezentatywnym wyniku. Każdy szczyt widoczny na górnym panelu reprezentuje próbkę oraz udany proces ekstrakcji, w wyniku którego uzyskano czyste RNA.W przeciwieństwie do tego, słabo wyekstrahowany RNA przedstawiony na dolnym panelu nie wykazuje wyraźnego piku absorpcji przy 260 nanometrach. W ramach kontroli jakości RNA zmierzono jego integralność, a wyniki porównano z drabiną RNA. W próbce RNA dobrej jakości powinny występować piki 18 s i 28 S-R-R-N-A, tak jak pokazano tutaj.Zdegradowana próbka RNA wykazywałaby mniej wyraźne piki oraz zmniejszoną względną ilość 18 S i 28 S-R-R-N-A, co przedstawiono tutaj. Analizę populacji mikro RNA można przeprowadzić oddzielnie. Wyniki mikroarray mikro RNA z porównania między próbkami traktowanymi nośnikiem a E dwa są przedstawione graficznie na tej mapie ciepła.Mere a, mere B i mere C uległy nadekspresji w dwóch próbkach traktowanych E, co zaznaczono kolorem czerwonym, natomiast mere D, mere e, mere F i mere G uległy obniżeniu ekspresji w dwóch próbkach traktowanych E, co zaznaczono kolorem zielonym. Wybór mikroRNA zależy od ich istotności oraz poziomu ekspresji. Wartość P mniejsza niż 0,05 jest zazwyczaj uznawana za istotną i powinna zostać wybrana do dalszej walidacji za pomocą QPCR.Macierze o niskiej gęstości z sondami z podwójnym znakowaniem wykorzystują metodę opartą na A-Q-P-C-R do przesiewowego wykrywania regulowanych mikroRNA. Przedstawiono tutaj wykresy amplifikacji dla mikroRNA z wyników D-L-P-L-D-A w formacie 384 dołków. Amplifikacja ekspresyjnych mikroRNA jest wskazana przez rosnące wartości RN.Walidację można przeprowadzić, stosując dwie metody detekcji qPCR, aby zapobiec błędowi systematycznemu metody oraz umożliwić dokładne potwierdzenie i badanie regulacji mikro-NA. Pierwsza metoda wykorzystuje detekcję barwnikiem cyjaninowym do analizy krzywej topnienia mikro-RNA w celu kontroli specyficzności amplifikacji. Amplifikacja zamierzonego fragmentu spowoduje powstanie wyraźnie zdefiniowanego, jednorodnego piku, jak pokazano na lewym panelu.W przypadku niespecyficzności startera lub powstania określonej ilości dimerów starterów, co zilustrowano na prawym panelu, zaobserwowane zostaną liczne piki. Jeśli tak się stanie, dane nie mogą zostać wykorzystane do analizy ekspresji. Druga metoda, analiza QPCR z zastosowaniem sond z podwójnym znakowaniem, jest bardziej specyficzna, ponieważ wykrywana jest jedynie amplifikacja docelowego mikroRNA, co obrazują wykresy amplifikacji dla każdego celu.Mikro-RNA można zaobserwować, jak pokazano tutaj dla obu analiz qPCR. W celu wyznaczenia względnej ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami wymagane jest porównanie z genem referencyjnym. Przykładem odpowiedniego genu referencyjnego w tych liniach komórkowych raka piersi jest A-R-H-G-D-I-A-A RO inhibitor dysocjacji GDP.Jak widać na tej rycinie, poziom mRNA A-R-H-G-D-I-A nie uległ zmianie pomiędzy próbkami z nośnikiem a próbkami traktowanymi ligandem. Genem referencyjnym, powszechnie akceptowanym w analizie mikroRNA, jest U6 snRNA. Jest to niekodujące małe jądrowe RNA o długości około 110 nukleotydów, które pełni funkcję w jądrowym prze...Splicing, zaobserwowany na tym rysunku, wskazuje, że poziomy ekspresji U6 są niemal identyczne we wszystkich pokazanych próbkach, co umożliwia obliczenie zmiennych poziomów mikroRNA. Ostatni rysunek przedstawia graficzną reprezentację wyników mikroRNA-qPCR z komórek traktowanych nośnikiem oraz E2, porównując względne poziomy ekspresji specyficznego mikroRNA miR-135a w czasie. Wykryto, że to mikroRNA nie podlegało regulacji do 24 godzin po traktowaniu E2, jednak znaczącą regulację odnotowano 72 godziny po zastosowaniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mikroRNA jest bezpośrednio regulowane przez receptor poprzez wiązanie się z cis-regulacyjnymi regionami chromatyny, można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny dla receptora SDR N. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób wiarygodny analizować regulację mikroRNA zależną od estrogenów. Bardzo ważne jest przeprowadzenie poszczególnych kontroli oraz powtórzenie kroków zgodnie z opisem w niniejszym protokole, aby upewnić się, że wykryte regulacje są rzeczywiste, a nie stanowią wariacji biologicznych lub technicznych.

profiling-of-estrogen-regulated-micrornas-in-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza charakterystyki mikroRNA regulowanych przez estrogeny w komórkach raka piersi

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Integracja danych z eksperymentów sekwencjonowania całego genomu i eksperymentów metabolomicznych jest wyzwaniem.  W niniejszej pracy po raz pierwszy przedstawiono generację, analizę i integrację danych dotyczących transkryptomu, cistromu i metabolomu z komórek raka piersi leczonych estradiolem.

Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Poznaj metodę profilowania mikroRNA regulowanych estrogenem w komórkach raka piersi. Technika obejmuje hodowlę komórek, ekstrakcję RNA i analizę mikromacierzową.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Przeglądaj więcej filmów