Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrycie modulacji receptorów sprzężonych z białkiem G przez kanały potasowe przy użyciu bezetykietowych biosensorów optycznych opartych na gradacji długości fali rezonansowej. W celu przeprowadzenia tego badania niepodzielne komórki HEK 2 93 oraz komórki HEK 2 93 stabilnie eksponujące szczurowy kanał potasowy aktywowany sodem slack B nanosi się na 384-dołkową płytkę biosensora optycznego i inkubuje przez noc. Następnie wykonuje się pomiar bazowy masy w pobliżu błony plazmatycznej i dodaje agonistów endogennych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). W ostatnim kroku mierzy się zmianę sygnału wynikającą z aktywacji GPCR i oblicza modulację tej odpowiedzi przez kanały potasowe.

Ostatecznie metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki i sygnalizacji komórkowej poprzez ilościowy pomiar mechanizmów sygnalizacyjnych między receptorami sprzężonymi z białkiem G a kanałami potasowymi. Głównymi zaletami zastosowania tej techniki w porównaniu do obecnie istniejących metod badania oddziaływań między kanałami a białkami, takich jak na przykład współimmunoprecypitacja (CO) i testy precypitacyjne, jest możliwość przeprowadzenia analizy na żywych komórkach. Nie wymaga ona stosowania egzogennych znaczników, które mogłyby zmienić strukturę oddziałującego białka.

I na koniec, w żywych komórkach można w rzeczywistości śledzić interakcje w czasie rzeczywistym. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat sygnalizacji między GPCR a kanałami potasowymi, może być również wykorzystana do badania odpowiedzi komórkowych wynikających z indukowanych ligandem zmian w adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek, toksyczności, proliferacji, migracji, a także wszelkich zmian w bliskości błony plazmatycznej względem optycznego biosensora.

Technika ta ma również potencjał do wykorzystania w odkrywaniu nowych podejść terapeutycznych w chorobach wywołanych nieprawidłowościami kanałów jonowych lub receptorów, takich jak wiele kanałopatii, ponieważ może być stosowana jako metoda wysokoprzepustowa do badania wpływu czynników farmakologicznych na białka kanałowe. Interakcje białek. Pierwszy raz pomyśleliśmy o zastosowaniu tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z konieczności opracowania testu umożliwiającego badanie interakcji białek kanałowych w żywych komórkach.

Powlekanie płytki optycznego biosensora 384-dołkowego rozpocznij od hydratacji płytki z dwutlenkiem tytanu za pomocą 20 µL sterylnej wody jakości do hodowli tkankowych na dołek przez 15 minut. Następnie użyj pipety 16-kanałowej, aby jednokrotnie przemyć płytkę 50 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na dołek.

Następnie do każdego dołka dodaje się 20 µl przygotowanego roztworu roboczego fibronektyny, a następnie inkubuje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu utworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Płytkę przepłukuje się raz, używając 50 µl PBS na dołek, a następnie do każdego z nich dodaje się 40 µl przygotowanego roztworu roboczego owalbuminy.

Następnie inkubujemy płytkę przez noc w temperaturze 4°C, aby zablokować płytkę po wiązaniu owalbuminy. Płytkę płuczemy trzy razy, używając 50 µL PBS na dołek. Płytki powleczone ECM można przechowywać w temperaturze 4°C do 48 godzin.

Usunąć pożywkę wzrostową zarówno z niezmodyfikowanych komórek HEK 2 93, jak i komórek HEK 2 93 stabilnie eksponujących slack B, które były hodowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodać trypsynę, aby odkleić komórki od płytki. Zebrać komórki w wirówce, wirowując z prędkością 1000 ×g przez jedną minutę.

Usunąć podłoże z trypsyną i resuspender komórki w podłożu wzrostowym. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określić stężenie komórek, a następnie, aby zminimalizować wpływ parowania podczas inkubacji, rozcieńczyć zawiesinę do uzyskania pożądanej liczby komórek na dołek. W przypadku tych eksperymentów zastosować 1000 komórek na dołek w objętości 50 µL podłoża wzrostowego.

Po pipetowaniu 50 µL rozcieńczonych komórek do każdego otworu, naniesiono je na biosensor, a następnie pozostawiono osiadłe komórki do inkubacji przez noc w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Aby przygotować pomiar w optycznym biosensorze z gradientem długości fali rezonansowej (RWG), po zakończeniu inkubacji usunięto z komórek pożywkę wzrostową.

Przemyj komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa, a następnie dodaj 25 µL roztworu do każdego dołka. Umieść płytkę z biosensorami w skanerze wiązań i pozostaw komórki na jedną do dwóch godzin w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. W międzyczasie przygotuj oddzielną płytkę związków, z której ligandy będą dodawane do płytki z biosensorami podczas analizy.

W przypadku tych testów do każdej studzienki na płytce biosensora dodano 25 µL roztworu zawierającego związek, tak aby całkowita objętość wyniosła 50 µL. Aby przeprowadzić analizę optycznym biosensorem RWG, należy wykonać pomiar bazowy za pomocą systemu skanującego dla studzienek od A1 do P12, które stanowią połowę płytki 384-dołkowej; przy użyciu oprogramowania bind scan należy zastosować maksymalną rozdzielczość 3,75 µm na piksel dla centralnych 1,5 mm każdej studzienki. Ten skan bazowy potrwa około 30 minut.

Następnie do każdego dołka od A 1 do P 12 należy dodać 25 µL roztworów związków. W kolejnym kroku wykonuje się pomiar bazowy dla dołków od A 13 do P 24. Po ustaleniu linii bazowej dla tych dołków, do każdego z dołków od A 13 do P 24 dodaje się 25 µL roztworów związków.

W ostatnim kroku wykonaj pomiar po dodaniu związku dla studzienek od A1 do P12, a następnie powtórz tę czynność dla studzienek od A13 do P24. Aby przeanalizować dane z testu, otwórz dane z testu wiązania dla pomiaru bazowego w oknie programu i kliknij przycisk edytora siatki, aby umożliwić wybór komórek. Oprogramowanie obliczy określone przez użytkownika istotne wskaźniki; otwórz wtyczki, w tym funkcję wyszukiwania komórek (cell finder), oraz ustaw parametry linii bazowej lub funkcji w module cell finder, tak aby komórki były odróżnialne od tła biosensora.

Wyeksportuj plik mapy komórek, który zawiera dane z lokalizatora komórek dla pomiaru bazowego. Powtórz te kroki dla danych po dodaniu związku. Następnie otwórz pomiar bazowy lub wtyczkę i zaimportuj mapę komórek z pomiaru bazowego.

Oprogramowanie obliczy przesunięcie wartości długości fali szczytowej (PWV) pomiędzy danymi tła a danymi po dodaniu związku. W celu uzyskania średniego przesunięcia PWV dla komórek należy wybrać opcję delta cell mean. Dane można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

Komórki HEK 293 stabilnie transfektowane białkiem Slack b oraz kontrolne, nietransfektowane komórki HEK 293 wysiano w zagęszczeniu 1000 komórek na dołek na 384-dołkowych płytkach biosensora RWG powlekanych ECM; mapy gradientu gęstości masy generowano przed oraz 30 minut po dodaniu związku za pomocą funkcji bind scan.

Obszary oprogramowania zaznaczone na czerwono reprezentują piksele zidentyfikowane jako należące do komórek, a żółte linie oddzielają poszczególne komórki od szarego tła płytki. Oprogramowanie bind view zostało wykorzystane do określenia przesunięcia PWV po dodaniu agonisty GPCR poprzez odjęcie PWV po dodaniu związku od bazowego PWV. Jest to przedstawione za pomocą gradientu kolorów, w którym kolor czerwony oznacza dodatnie przesunięcie wartości długości fali szczytowej, a kolor niebieski oznacza brak zmian.

Endogenny receptor muskarynowy M1 w odpowiedzi na karbachol został zastosowany zarówno w nieprzetransformowanych kontrolnych komórkach HEK 2 93, jak i w komórkach HEK 2 93 stabilnie ekspresjonujących slack B, co doprowadziło do dodatniego wzrostu wartości długości fali szczytowej w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Komórki przetransformowane slack B wykazały większy wzrost wartości długości fali szczytowej. S-F-L-L-R NH dwa, sól trifluorooctanowa oraz końcowy peptyd aktywujący receptor trombiny, pentapeptyd wykazujący aktywność agonistyczną wobec endogennego receptora aktywowanego proteazą 1 (GPCR), również wykazały odmienne odpowiedzi w komórkach nieprzetransformowanych i przetransformowanych slack B.

Wyniki te wykazują, że obecność kanału Slack B znacząco zwiększa przesunięcie PWV występujące podczas aktywacji endogennego G PCR w komórkach K, oraz demonstrują możliwość wykorzystania tego testu do badania oddziaływań białek kanałowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak opracować i przeprowadzić analizę za pomocą optycznego biosensora bez znakowania. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni, pod warunkiem starannego przygotowania komórek i odczynników podczas wykonywania tej procedury.

Należy pamiętać, że parametry analizy, takie jak liczba wysiewanych komórek, czas inkubacji ligandów i tym podobne, muszą zostać zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak statystyka w języku R i sztuczna inteligencja (AI), aby spróbować ustalić, które konkretne białka są wymagane do zaobserwowanej zmiany sygnału. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi kulturami komórkowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza.