Name: Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę bezznacznikowych biosensorów optycznych do badania modulacji kanałów potasowych przez receptory GPCR w żywych komórkach HEK 293. Technika umożliwia ilościowe pomiary sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Yangyang Yan z laboratorium dr Freda Sigwortha na Uniwersytecie Yale za hojne przekazanie komórek HEK293 stabilnie wyrażający szczurze białko Slack-B. Dodatkowo autorzy są wdzięczni dr Sigworthowi za model homologii mikroskopii krioelektronowej Slacka pokazany we wstępie do filmu. Badania te były wspierane przez NIH Grants DH067517 i NS073943 dla L.K.K.

1. Hodowla komórkowa (na podstawie Fleminga i Kaczmarka18)
<ol>
	<li>Hodować komórki w odpowiednich pożywkach przez więcej niż 2, ale mniej niż 10 pasaży przed użyciem w tym teście. Nietransfekowane komórki HEK-293 i komórki HEK-293 ze stabilną ekspresją szczurzego białka Slack-B są hodowane w jednej połowie pożywki Modified Eagle firmy Dulbecco i połowie pożywki L-15 Leibovitz, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. 500 μg/ml Geneticin (G418) dodaje się do komórek HEK-293 stabilnie eksprymujących Slack-B w celu wybrania ekspresji kanału Slack. Pasaż komórek przy 70-90% konfluencji przez dysocjację z naczyń 0,25% roztworem trypsyny-EDTA.</li>
</ol>
2. Powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) płytki biosensora optycznego TiO2 384-well z fibronektyną i albuminą jaja kurzego
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny fibronektyny ECM i roztworu blokującego albuminę jaja kurzego
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór roboczy fibronektyny w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) o końcowym stężeniu 5 μg/ml fibronektyny w 20,0 ml PBS. Ze stężenia podstawowego 1,0 mg/ml dodać 100 μl do 20,0 ml PBS w celu 200-krotnego rozcieńczenia. Roztwór roboczy fibronektyny można podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C po przygotowaniu.</li>
		<li>Przygotować 5% roztwór podstawowy inaktywowanej termicznie albuminy jaja kurzego w sterylnej wodzie. Rozcieńczyć albuminę jaja kurzego w sterylnej wodzie do hodowli tkankowej do uzyskania 5% roztworu i dezaktywować termicznie przez 30 minut w temperaturze 60 °C. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i sterylnie przefiltrować roztwór. Podać 5% roztwór albuminy jaja kurzego i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 2% roztwór roboczy albuminy jaja kurzego, rozcieńczając 5% roztwór podstawowy do PBS. Na przykład dodać 12,0 ml 5% roztworu podstawowego albuminy jaja kurzego do 18,0 ml PBS, aby uzyskać końcową objętość 30,0 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>384-dołkowa powłoka płytki biosensora optycznego
	<ol>
		<li>Uwodnić płytkę TiO2 20,0 μl/studzienkę sterylnej wody do hodowli tkankowych przez 15 minut. Poniższe czynności należy wykonać za pomocą pipetora 16-kanałowego.</li>
		<li>Umyj płytę 1x z 50,0 μl PBS na studzienkę.</li>
		<li>Dodaj 20,0 μl roztworu roboczego fibronektyny do każdej studzienki i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby utworzyć ECM.</li>
		<li>Umyj płytę 1x z 50,0 μl PBS na studzienkę.</li>
		<li>Dodać 40,0 μl roztworu roboczego albuminy jaja kurzego do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w celu zablokowania płytki.</li>
		<li>Umyj płytę 3x z 50,0 μl PBS na dołek. Płytki z powłoką ECM można przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Umieszczanie komórek na 384-dołkowej płytce optycznego biosensora
<ol>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową z komórek i dodaj trypsynę, aby usunąć komórki z płytki. Zebrać komórki i odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę. Usuń pożywkę trypsynową i ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określ stężenie komórek.</li>
	<li>Aby zminimalizować skutki parowania podczas inkubacji, zostanie użyte 50,0 μl pożywki wzrostowej na studzienkę. Komórki należy rozcieńczyć, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek w studzience w objętości 50,0 μl pożywki wzrostowej. W tych eksperymentach 1000 komórek/studzienkę zostało posianych na bioczujniku.</li>
	<li>Pozostawić wysiane komórki do inkubacji przez noc w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C pod powietrzem/5% CO2 .</li>
</ol>
4. Przygotowanie biosensora i płytek złożonych do testu biosensora optycznego RWG
<ol>
	<li>Wyjmij płytkę z inkubatora i usuń pożywkę wzrostową z komórek. Umyj komórki 1x zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). Dodać 25,0 μl HBSS do każdego dołka.</li>
	<li>Umieść płytkę biosensora na skanerze BIND i pozwól komórkom zrównoważyć się do temperatury pokojowej przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Przygotować oddzielną płytkę złożoną, z której podczas testu zostaną dodane do płytki biosensora interesujące nas ligandy. W przypadku tych testów do każdej studzienki na płytce biosensora dodano 25,0 μl roztworu zawierającego związek, co daje łączną objętość 50,0 μl. W związku z tym związki w roztworze przygotowano w 2-krotnym stężeniu końcowym.</li>
</ol>
5. Wykonaj test biosensora optycznego RWG
<ol>
	<li>Wykonaj pomiar linii podstawowej za pomocą systemu skanera dla studzienek A1-P12 (połowa płytki SBS 384-dołkowej) przy użyciu maksymalnej rozdzielczości 3,75 μm/piksel dla centralnych 1,5 mm każdego dołka za pomocą oprogramowania BIND Scan. Ten skan bazowy zajmie około 30 minut.</li>
	<li>Dodać 25,0 μl roztworów złożonych do każdej studzienki dla studzienek A1-P12.</li>
	<li>Wykonaj pomiar podstawowy studzienek A13-P24.</li>
	<li>Dodać 25,0 μl roztworów związków do każdej studzienki dla studzienek A13-P24.</li>
	<li>Wykonaj pomiar po dodaniu związku dla studzienek A1-P12 i powtórz dla studzienek A13-P24.</li>
</ol>
6. Analiza danych testowych za pomocą widoku BIND
<ol>
	<li>Otwórz dane testowe BIND dla pomiaru linii bazowej w systemie Windows i kliknij przycisk "Edytor siatki", aby włączyć wybór komórek. Oprogramowanie obliczy metryki zainteresowań zdefiniowane przez użytkownika.</li>
	<li>Otwórz "Wtyczki", które zawierają funkcję "Cell Finder" i "Baseliner". Ustaw parametry w "Cell Finder", aby komórki były rozpoznawalne z tła biosensora.</li>
	<li>Eksportuj plik mapy komórki, który zawiera dane "Wyszukiwarki komórek" dla pomiaru linii bazowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1-6.2 dla danych po dodaniu związku.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę "Baseliner" i zaimportuj mapę komórek z pomiaru linii bazowej. Oprogramowanie obliczy przesunięcie PWV między danymi tła a danymi złożonymi.</li>
	<li>Wybierz "Δ Średnia komórki", aby uzyskać wynik średniego przesunięcia PWV dla komórek. Dane można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+Channels+of+Excitable+Membranes%22">Ion Channels of Excitable Membranes</a>. , Sinauer Associates. (1992).</li>
<li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+biomolecular+interactions%3A+applications+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li>
<li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+assays+on+the+BIND+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li>
<li>Hessel, A. aO., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Theory+of+Wood%27s+Anomalies+on+Optical+Gratings%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li>
<li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+biosensor%3A+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li>
<li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+K%2B+channels%2C+Na%2B+is+the+new+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li>
<li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K%2B+channels+by+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li>
<li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slack+and+Slick+K%28Na%29+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li>
<li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li>
<li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li>
<li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li>
</ol>

Steven M. Shamah jest pracownikiem X-BODY Biosciences.

Czynnik pierwszy Z (Z') jest powszechną metodą statystyczną służącą do ilościowego określania jakości wysokoprzepustowego testu przesiewowego20, a ponieważ badanie przesiewowe agonistów GPCR w tym teście miało miejsce w teście 384-dołkowym zgodnym z SBS, stanowi doskonałą miarę solidności i ważności tego testu21. Wartość Z' równa 1 wskazuje teoretycznie idealny test z nieskończoną liczbą punktów danych z nieistniejącymi odchyleniami standardowymi. Wartość Z' wynosząca od 0,5 do 1 jest uważana za dos...

Badanie żywych komórek w ich fizjologicznie istotnym kontekście jest kluczowe dla zrozumienia biologicznych funkcji celów komórkowych. Jednak testy badające interakcję między kanałami a regulatorowymi białkami cytoplazmatycznymi, takie jak testy koimmunoprecypitacji, na ogół dostarczają niewiele informacji na temat przebiegu interakcji w żywych komórkach w czasie. Większość obecnych testów komórkowych mierzy określone zdarzenie komórkowe, takie jak translokacja fluorescencyjnie znakowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Testy te wymagają modyfikacji interesujących białek, które mogą potencjalnie zmienić zachowanie białka i zmniejszyć fizjologiczne znaczenie celu. Nieinwazyjne testy komórkowe, które nie wymagają manipulacji systemem, zapewniają ciągły pomiar aktywności komórkowej i umożliwiają badanie komórek w ich najbardziej fizjologicznie istotnym stanie4.
Optyczne biosensory są zaprojektowane tak, aby wytwarzać mierzalną zmianę w charakterystyce światła, które jest sprzężone z powierzchnią czujnika. Biosensory optyczne, które wykorzystują fale ulotne, w tym techniki rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) i siatek rezonansowych długości fal (RWG), są wykorzystywane przede wszystkim do wykrywania powinowactwa i kinetyki cząsteczek wiążących się z ich receptorami biologicznymi unieruchomionymi na powierzchni czujnika. Niedawno opracowano dostępne na rynku biosensory RWG, które umożliwiają wykrywanie względnej zmiany masy w dolnej części komórek przylegających do powierzchni czujnika w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (do 3,75 μm/piksel)5. Te bioczujniki mogą wykrywać zmiany masy w pobliżu błony plazmatycznej żywych komórek, które wynikają ze stymulacji, takie jak adhezja i rozprzestrzenianie się komórek, toksyczność, proliferacja i szlaki sygnałowe wywoływane przez różne receptory na powierzchni komórki, w tym receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)6. Biosensory RWG wykrywają względną zmianę współczynnika załamania światła w funkcji względnej zmiany masy w promieniu 150 nm od biosensora7. Gdy komórki są siane do bioczujnika, ta zmiana współczynnika załamania odzwierciedla zmianę masy w pobliżu błony plazmatycznej komórki wynikającą ze zmiany przylegania komórek do bioczujnika. W protokole tym omówione zostanie wykrywanie interakcji kanał-białko za pomocą biosensorów RWG.
Systemy akwizycji danych RWG składają się z kilku komponentów. Ponieważ do tych eksperymentów użyto skanera X-BODY Biosciences BIND Scanner, będziemy odnosić się do komponentów tego konkretnego systemu, który składa się z czytnika płytek, powiązanych bioczujników, oprogramowania do akwizycji BIND Scan i oprogramowania analitycznego BIND View8. Biosensory kryształów fotonicznych, zwane dalej biosensorami optycznymi, składają się z okresowego układu dielektryka i materiału w 2 lub 3 wymiarach, co zapobiega propagacji światła przy określonych długościach fal i kierunkach. Fotoniczne struktury krystaliczne opierają się na zjawisku zwanym anomalią Wooda. Anomalie te, odkryte po raz pierwszy przez Wooda w 1902 roku, są efektami obserwowanymi w widmie światła odbitego przez optyczne siatki dyfrakcyjne, gdzie gwałtowne zmiany intensywności poszczególnych rzędów dyfrakcyjnych występują w pewnych wąskich pasmach częstotliwości. W 1962 roku Hessel i Oliner przedstawili nową teorię anomalii Wooda, w której siatka o skończonym okresie generuje stały rezonans o długościfali 9. W opisywanych tutaj biosensorach optycznych anomalie Wooda są wykorzystywane do wytworzenia biosensora RWG, który po stymulacji białym światłem odbija tylko bardzo wąskie pasmo długości fal (zwykle w zakresie 850-855 nm).
Indywidualne biosensory składają się z tworzywa sztucznego o niskim współczynniku załamania światła o okresowej strukturze powierzchni, które jest pokryte cienką warstwą wysokorefrakcjjnego materiału dielektrycznego dwutlenku tytanu (TiO2). Gdy bioczujnik jest oświetlony źródłem światła o szerokiej długości fali, siatka optyczna kryształów fotonicznych odbija wąski zakres długości fal światła, który jest mierzony przez spektrofotometr w skanerze BIND. Szczytowa intensywność odbitych długości fal (szczytowa wartość długości fali lub PWV) jest następnie obliczana na podstawie sygnału. PWV światła przesuwa się po zmianie współczynnika załamania w wyniku wzrostu lub spadku masy w pobliżu (~150 nm) powierzchni biosensora. Biosensory optyczne są włączone do standardowej 384-dołkowej mikropłytki Towarzystwa Nauk Biomolekularnych (SBS) do testów stosowanych w tych eksperymentach.
Biosensory RWV są używane do wykrywania zmian po dodaniu sygnałów egzogennych w żywych komórkach10. Komórki są hodowane bezpośrednio na powierzchni biosensora RWG, a zmiana lokalnego wskaźnika refrakcji jest monitorowana po leczeniu określonymi bodźcami. Można określić kierunek zmiany masy na biosensorze, ponieważ wzrost lokalnego współczynnika załamania wynika ze wzrostu masy w pobliżu biosensora i jest mierzony jako wzrost PWV. I odwrotnie, spadek masy powoduje spadek PWV. Zmiana wykrytego PWV może wynikać z wielu zdarzeń komórkowych, w tym zmian w adhezji komórek, rekrutacji/uwalnianiu białek, endocytozie i recyklingu, egzocytozie, apoptozie i przegrupowaniu cytoszkieletu. Na przykład test może wykrywać zmiany w interakcjach kanał-białko między kanałami potasowymi a innymi składnikami cytoplazmatycznymi lub cytoszkieletowymi. Zdarzenie musi jednak wystąpić w strefie detekcji ~150 nm w pobliżu biosensora, a w przypadku przyłączonej komórki w pobliżu błony plazmatycznej. Akwizycja odpowiedzi komórkowych odbywa się za pomocą oprogramowania BIND Scan i generowana jest reprezentacja obrazu każdego z 384 dołków w płytce SBS. System ten ma rozdzielczość do 3,75 μm/piksel, co pozwala na wykrywanie zdarzeń w pojedynczych komórkach i może być stosowany zarówno z liniami komórkowymi (takimi jak komórki HEK293 lub CHO), jak i z bardziej fizjologicznie istotnymi komórkami pierwotnymi. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania BIND View pozwala na wykrycie odpowiedzi komórkowych zarówno u pojedynczych, jak i w populacjach komórek. Ponieważ biosensory są wbudowane w standardowe mikropłytki SBS 384-dołkowe, system można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS).
Biosensory optyczne z siatką rezonansową o długości fali były wcześniej używane do wykrywania zmian masy w pobliżu błony plazmatycznej komórek po aktywacji GPCR11. Nasze laboratorium sklonowało dwa kanały potasowe aktywowane sodem (KNa), Slack-B i Slick12. Wykazano, że na aktywność zarówno kanałów Slack-B, jak i Slick bardzo silny wpływ ma bezpośrednia aktywacja kinazy białkowej C (PKC)13. Aktywacja receptorów sprzężonych z białkiem Gαq, takich jak receptor muskarynowy M1 i metabotropowy receptor glutaminianu mGluR1, silnie reguluje aktywność kanału poprzez aktywację PKC. Te kanały KNa przyczyniają się do adaptacji neuronów podczas długotrwałej stymulacji i regulują dokładność czasu potencjałów czynnościowych14. Wiadomo, że luźne kanały oddziałują z różnymi cytoplazmatycznymi cząsteczkami sygnałowymi, w tym FMRP, białkiem upośledzenia umysłowegoFragile X 15,16. Mutacje w Slack powodują wielokrotne migrujące częściowe napady padaczkowe w okresie niemowlęcym (MMPSI), wczesną postać padaczki, która powoduje poważne opóźnienie rozwoju17.

<table><tbody><tr><td>DMEM, technologie życia o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 Siarczan</td> Amerykański <td>AB05057</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr fazowy Hausser Bright-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek karbamoylcholiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>SFLLR-NH2 sól trifluorooctanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8701</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette (5-50 &mikro; l)</td> System skanerów <td>Thermo Scientific</td><td>4662090</td><td></td></tr><tr><td>BIND</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe płytki powlekane TiO2</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>TiO-96-CM</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem g

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Kanały jonowe kontrolują właściwości elektryczne neuronów i innych typów komórek pobudzających, selektywnie pozwalając jonom przepływać przez błonę plazmatyczną1. Aby regulować pobudliwość neuronów, biofizyczne właściwości kanałów jonowych są modyfikowane przez białka i cząsteczki sygnałowe, które często wiążą się z samymi kanałami, tworząc heteromeryczny kompleks kanałów2,3. Tradycyjne testy badające interakcję między kanałami a białkami regulatorowymi wymagają egzogennych znaczników, które mogą potencjalnie zmienić zachowanie białka i zmniejszyć fizjologiczne znaczenie celu, dostarczając jednocześnie niewiele informacji na temat przebiegu interakcji w żywych komórkach. Biosensory optyczne, takie jak system skanera X-BODY Biosciences BIND, wykorzystują nowatorską technologię bezznacznikową, optyczne biosensory z siatką rezonansową (RWG), do wykrywania zmian w rezonansowym świetle odbitym w pobliżu bioczujnika. Test ten umożliwia wykrycie względnej zmiany masy w dolnej części żywych komórek przylegających do powierzchni biosensora, wynikającej ze zmian w adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek wywołanych ligandami, toksyczności, proliferacji i zmian w interakcjach białko-białko w pobliżu błony plazmatycznej. Biosensory optyczne RWG zostały wykorzystane do wykrywania zmian masy w pobliżu błony plazmatycznej komórek po aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), receptorowych kinaz tyrozynowych i innych receptorów na powierzchni komórki. Za pomocą tego testu można również badać zmiany indukowane ligandem w interakcjach kanał-białko. W tym artykule opiszemy procedurę eksperymentalną stosowaną do wykrywania modulacji kanałów potasowych aktywowanych sodem (KNa) Slack-B przez GPCR.

Komórki HEK-293 stabilnie transfekowane Slack-B oraz kontrolne komórki HEK-293 nietransfekowane wysiano w zagęszczeniu 1 000 komórek/dołek na płytkach biosensora RWG z 384 dołkami, powleczonych ECM. Obrazy z centralnego obszaru o powierzchni 1,5 mm2 biosensora rejestrowano w rozdzielczości 3,75 µm/pixel (Rysunek 1). Mapy gradientu gęstości masy wygenerowano przed oraz 30 min po dodaniu związku za pomocą oprogramowania BIND Scan. Oprogramowanie BIND View wykorzystano do określenia przesunięcia ...

Techniki biosensorów optycznych mogą wykrywać zmiany w masie w pobliżu błony plazmatycznej w żywych komórkach i pozwalają śledzić reakcje komórkowe zarówno w pojedynczych komórkach, jak i populacjach komórek. Protokół ten będzie opisywał wykrywanie modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G w nienaruszonych komórkach przy użyciu tego podejścia.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrycie modulacji receptorów sprzężonych z białkiem G przez kanały potasowe przy użyciu bezetykietowych biosensorów optycznych opartych na gradacji długości fali rezonansowej. W celu przeprowadzenia tego badania niepodzielne komórki HEK 2 93 oraz komórki HEK 2 93 stabilnie eksponujące szczurowy kanał potasowy aktywowany sodem slack B nanosi się na 384-dołkową płytkę biosensora optycznego i inkubuje przez noc. Następnie wykonuje się pomiar bazowy masy w pobliżu błony plazmatycznej i dodaje agonistów endogennych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). W ostatnim kroku mierzy się zmianę sygnału wynikającą z aktywacji GPCR i oblicza modulację tej odpowiedzi przez kanały potasowe.Ostatecznie metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki i sygnalizacji komórkowej poprzez ilościowy pomiar mechanizmów sygnalizacyjnych między receptorami sprzężonymi z białkiem G a kanałami potasowymi. Głównymi zaletami zastosowania tej techniki w porównaniu do obecnie istniejących metod badania oddziaływań między kanałami a białkami, takich jak na przykład współimmunoprecypitacja (CO) i testy precypitacyjne, jest możliwość przeprowadzenia analizy na żywych komórkach. Nie wymaga ona stosowania egzogennych znaczników, które mogłyby zmienić strukturę oddziałującego białka.I na koniec, w żywych komórkach można w rzeczywistości śledzić interakcje w czasie rzeczywistym. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat sygnalizacji między GPCR a kanałami potasowymi, może być również wykorzystana do badania odpowiedzi komórkowych wynikających z indukowanych ligandem zmian w adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek, toksyczności, proliferacji, migracji, a także wszelkich zmian w bliskości błony plazmatycznej względem optycznego biosensora.Technika ta ma również potencjał do wykorzystania w odkrywaniu nowych podejść terapeutycznych w chorobach wywołanych nieprawidłowościami kanałów jonowych lub receptorów, takich jak wiele kanałopatii, ponieważ może być stosowana jako metoda wysokoprzepustowa do badania wpływu czynników farmakologicznych na białka kanałowe. Interakcje białek. Pierwszy raz pomyśleliśmy o zastosowaniu tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z konieczności opracowania testu umożliwiającego badanie interakcji białek kanałowych w żywych komórkach.Powlekanie płytki optycznego biosensora 384-dołkowego rozpocznij od hydratacji płytki z dwutlenkiem tytanu za pomocą 20 µL sterylnej wody jakości do hodowli tkankowych na dołek przez 15 minut. Następnie użyj pipety 16-kanałowej, aby jednokrotnie przemyć płytkę 50 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na dołek.Następnie do każdego dołka dodaje się 20 µl przygotowanego roztworu roboczego fibronektyny, a następnie inkubuje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu utworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Płytkę przepłukuje się raz, używając 50 µl PBS na dołek, a następnie do każdego z nich dodaje się 40 µl przygotowanego roztworu roboczego owalbuminy.Następnie inkubujemy płytkę przez noc w temperaturze 4°C, aby zablokować płytkę po wiązaniu owalbuminy. Płytkę płuczemy trzy razy, używając 50 µL PBS na dołek. Płytki powleczone ECM można przechowywać w temperaturze 4°C do 48 godzin.Usunąć pożywkę wzrostową zarówno z niezmodyfikowanych komórek HEK 2 93, jak i komórek HEK 2 93 stabilnie eksponujących slack B, które były hodowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodać trypsynę, aby odkleić komórki od płytki. Zebrać komórki w wirówce, wirowując z prędkością 1000 ×g przez jedną minutę.Usunąć podłoże z trypsyną i resuspender komórki w podłożu wzrostowym. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określić stężenie komórek, a następnie, aby zminimalizować wpływ parowania podczas inkubacji, rozcieńczyć zawiesinę do uzyskania pożądanej liczby komórek na dołek. W przypadku tych eksperymentów zastosować 1000 komórek na dołek w objętości 50 µL podłoża wzrostowego.Po pipetowaniu 50 µL rozcieńczonych komórek do każdego otworu, naniesiono je na biosensor, a następnie pozostawiono osiadłe komórki do inkubacji przez noc w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Aby przygotować pomiar w optycznym biosensorze z gradientem długości fali rezonansowej (RWG), po zakończeniu inkubacji usunięto z komórek pożywkę wzrostową.Przemyj komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa, a następnie dodaj 25 µL roztworu do każdego dołka. Umieść płytkę z biosensorami w skanerze wiązań i pozostaw komórki na jedną do dwóch godzin w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. W międzyczasie przygotuj oddzielną płytkę związków, z której ligandy będą dodawane do płytki z biosensorami podczas analizy.W przypadku tych testów do każdej studzienki na płytce biosensora dodano 25 µL roztworu zawierającego związek, tak aby całkowita objętość wyniosła 50 µL. Aby przeprowadzić analizę optycznym biosensorem RWG, należy wykonać pomiar bazowy za pomocą systemu skanującego dla studzienek od A1 do P12, które stanowią połowę płytki 384-dołkowej; przy użyciu oprogramowania bind scan należy zastosować maksymalną rozdzielczość 3,75 µm na piksel dla centralnych 1,5 mm każdej studzienki. Ten skan bazowy potrwa około 30 minut.Następnie do każdego dołka od A 1 do P 12 należy dodać 25 µL roztworów związków. W kolejnym kroku wykonuje się pomiar bazowy dla dołków od A 13 do P 24. Po ustaleniu linii bazowej dla tych dołków, do każdego z dołków od A 13 do P 24 dodaje się 25 µL roztworów związków.W ostatnim kroku wykonaj pomiar po dodaniu związku dla studzienek od A1 do P12, a następnie powtórz tę czynność dla studzienek od A13 do P24. Aby przeanalizować dane z testu, otwórz dane z testu wiązania dla pomiaru bazowego w oknie programu i kliknij przycisk edytora siatki, aby umożliwić wybór komórek. Oprogramowanie obliczy określone przez użytkownika istotne wskaźniki; otwórz wtyczki, w tym funkcję wyszukiwania komórek (cell finder), oraz ustaw parametry linii bazowej lub funkcji w module cell finder, tak aby komórki były odróżnialne od tła biosensora.Wyeksportuj plik mapy komórek, który zawiera dane z lokalizatora komórek dla pomiaru bazowego. Powtórz te kroki dla danych po dodaniu związku. Następnie otwórz pomiar bazowy lub wtyczkę i zaimportuj mapę komórek z pomiaru bazowego.Oprogramowanie obliczy przesunięcie wartości długości fali szczytowej (PWV) pomiędzy danymi tła a danymi po dodaniu związku. W celu uzyskania średniego przesunięcia PWV dla komórek należy wybrać opcję delta cell mean. Dane można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy.Komórki HEK 293 stabilnie transfektowane białkiem Slack b oraz kontrolne, nietransfektowane komórki HEK 293 wysiano w zagęszczeniu 1000 komórek na dołek na 384-dołkowych płytkach biosensora RWG powlekanych ECM; mapy gradientu gęstości masy generowano przed oraz 30 minut po dodaniu związku za pomocą funkcji bind scan.Obszary oprogramowania zaznaczone na czerwono reprezentują piksele zidentyfikowane jako należące do komórek, a żółte linie oddzielają poszczególne komórki od szarego tła płytki. Oprogramowanie bind view zostało wykorzystane do określenia przesunięcia PWV po dodaniu agonisty GPCR poprzez odjęcie PWV po dodaniu związku od bazowego PWV. Jest to przedstawione za pomocą gradientu kolorów, w którym kolor czerwony oznacza dodatnie przesunięcie wartości długości fali szczytowej, a kolor niebieski oznacza brak zmian.Endogenny receptor muskarynowy M1 w odpowiedzi na karbachol został zastosowany zarówno w nieprzetransformowanych kontrolnych komórkach HEK 2 93, jak i w komórkach HEK 2 93 stabilnie ekspresjonujących slack B, co doprowadziło do dodatniego wzrostu wartości długości fali szczytowej w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Komórki przetransformowane slack B wykazały większy wzrost wartości długości fali szczytowej. S-F-L-L-R NH dwa, sól trifluorooctanowa oraz końcowy peptyd aktywujący receptor trombiny, pentapeptyd wykazujący aktywność agonistyczną wobec endogennego receptora aktywowanego proteazą 1 (GPCR), również wykazały odmienne odpowiedzi w komórkach nieprzetransformowanych i przetransformowanych slack B.Wyniki te wykazują, że obecność kanału Slack B znacząco zwiększa przesunięcie PWV występujące podczas aktywacji endogennego G PCR w komórkach K, oraz demonstrują możliwość wykorzystania tego testu do badania oddziaływań białek kanałowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak opracować i przeprowadzić analizę za pomocą optycznego biosensora bez znakowania. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni, pod warunkiem starannego przygotowania komórek i odczynników podczas wykonywania tej procedury.Należy pamiętać, że parametry analizy, takie jak liczba wysiewanych komórek, czas inkubacji ligandów i tym podobne, muszą zostać zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak statystyka w języku R i sztuczna inteligencja (AI), aby spróbować ustalić, które konkretne białka są wymagane do zaobserwowanej zmiany sygnału. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi kulturami komórkowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zastosowanie czujników biologicznych bez oznaczeń znaków do wykrywania modulacyjnego działania kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkami G

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Źródło: Josiah, S. S., et al. Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting.  J. Vis. Exp. (2022). Film przedstawia etapy wykrywania i ilościowego oznaczania fosforylowanego białka kotransportera chlorku potasu 2 (KCC2) w lizacie komórkowym. Proces ten obejmuje immunoprecypitację w celu wyizolowania fosforylowanego KCC2 i chemiluminescencję w celu ilościowego określenia wyizolowanego białka.

Wykrywanie fosforylowanego neuronalnego kotransportera chlorku potasu 2 za pomocą Western Blotting

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.

Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj metodę bezznacznikowych biosensorów optycznych do badania modulacji kanałów potasowych przez receptory GPCR w żywych komórkach HEK 293. Technika umożliwia ilościowe pomiary sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Przeglądaj więcej filmów