Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie trójwymiarowego systemu hodowli jako środka do odróżnienia łagodnego fenotypu piersi od złośliwego fenotypu piersi. Osiąga się to poprzez najpierw posiew komórek kontrolnych i eksperymentalnych w trzech egzemplarzach na warstwie matrigelu o zredukowanej redukcji czynnika wzrostu w szkiełku z ośmioma dołkami. Drugim krokiem jest podawanie świeżych, kompletnych zmian w pożywce za pomocą 2% GFR Matrigel co czwarty dzień, co pozwala koloniom podobnym do asyniny rosnąć przez 10 do 15 dni.

Następnie, obrazy kontrastu fazowego kolonii podobnych do aser hodowanych w 3D są rejestrowane w rozdzielczości pięciokrotnej. Ostatnim krokiem jest przetworzenie kultur podobnych do aser do analizy chemicznej immunocyto z odpowiednimi markerami molekularnymi, a następnie uzyskanie obrazów konfokalnych dwóch kolonii podobnych do barwienia immunologicznego w części środkowej. Ostatecznie kontrast fazowy i obrazy konfokalne komórek hodowanych w hodowli 3D są wykorzystywane do identyfikacji komórkowych zmian fenotypowych i molekularnych, a tym samym do różnicowania łagodnych komórek piersi od komórek złośliwych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak dwuwymiarowe hodowle, testy inwazji lub migracji, jest to, że może ona podsumować architekturę tkankową łagodnej piersi i jej utratę organizacji podczas złośliwej transformacji. W ten sposób technika ta może być skutecznie stosowana do różnicowania łagodnych komórek piersi od złośliwych komórek piersi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi, takie jak defekt szlaków sygnałowych w fenotypie komórki oraz w identyfikacji nowych szlaków onkogennych i/lub supresorowych nowotworów.

Aby rozpocząć eksperyment, należy przez noc rozmrozić zredukowany czynnik wzrostu lub matrycę GFR w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozgrzej całe podłoże HME w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść szkiełko z ośmioma komorami na lodzie do ostygnięcia. Dodaj 40 mikrolitrów GFR Matrigel do środka każdego dołka wstępnie schłodzonego szkiełka.

Rozprowadź żel tak równomiernie, jak to możliwe, za pomocą końcówki do pipety P 200, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego rozprowadzania, które może prowadzić do powstania łąkotki. Następnie zestal żel matri, inkubując szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, podczas gdy żel matri zestala oczy trypsyny, komórki HME, a następnie zbierz je w 15-mililitrowej probówce i obracaj komórki pod 150-krotnością grawitacji przez cztery minuty, policz komórki i rozcieńcz je do 12 500 komórek na mililitr. W kompletnych pożywkach dodać matrycę GFR do zawiesiny komórek o końcowym stężeniu 2% i dodać 400 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki wstępnie zakodowanej komory Szkiełko.

Następnie umieść szkiełko w inkubatorze buforowanym CO2. Wymieniaj nośnik na nowy, kompletny nośnik co cztery dni przez 15 dni. W przypadku badań nad inhibitorami należy dodać inhibitory małocząsteczkowe do kompletnej pożywki w czasie posiewu, a następnie nowe zmiany pożywki uzupełniane inhibitorami co trzy dni, aby rozpocząć wzrost komórek i potrójne dawki dla każdego zestawu terapeutycznego.

Wykonaj obrazy kontrastu fazowego struktur aser z każdej studzienki w rozdzielczości pięciokrotnej za pomocą mikroskopu kontrastu fazowego podłączonego do przesuwnika i komputera. Rób zdjęcia, przesuwając szkiełko z jednej klatki do drugiej, pokrywając całą studzienkę szkiełka komorowego. Policz całkowitą liczbę struktur aser, liczbę pojedynczych okrągłych płaskich aser i liczbę struktur wieloasowych lub przypadkowo rosnących struktur pozbawionych organizacji.

A dzięki emanującym procesom rozgałęziania oblicz procent pojedynczych okrągłych płaskich struktur aser w porównaniu ze strukturami złośliwymi i wykreśl informacje. Jako wykres kolumnowy. Oblicz istotność za pomocą dwustronnego testu T niesparowanego ucznia.

Przygotować odczynniki do barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie za pomocą pipety P 200 ostrożnie zasysać kondycjonowane podłoże. Następnie utrwal ASIN lub struktury za pomocą świeżo przygotowanego 2% para formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut po utrwaleniu, przesiąkaj komórki 0,5% trittonem X 100 przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie umyj kultury trzy razy 100 milimetrową glicyną przez 10 do 15 minut na każde mycie. Następnie zablokuj komórki w głównym buforze blokowym na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj kultury w 20 mikrogramach na mililitr koziego anty mysiego fragmentu fab two w pierwotnym buforze blokowym, zwanym również drugim roztworem blokującym przez 30 minut, aby zablokować gatunki IgG myszy reagujące aminami w matrycy.

Po zablokowaniu inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w drugim roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyj komórki trzykrotnie buforem immunofluorescencyjnym lub buforem I z delikatnym kołysaniem przez 10 do 15 minut na każde płukanie. Następnie inkubować komórki z fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w buforze F przez 45 minut.

Następnie umyj komórki trzy razy przez 10 minut każda, z buforem F i delikatnym kołysaniem. Zamontuj szkiełka z DPI zawierającym odczynnik zapobiegający blaknięciu, aby uwidocznić jądra. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnie uzyskaj obrazy konfokalne w środkowej części kolonii komórek rosnących na wierzchu matrycy i serię odcinków optycznych na całej długości struktury asnera poprzez układanie w stos obrazów konfokalnych DPI, barwionych HME kontrolowanych i C CN sześć komórek knockdown w piątym dniu pokazuje, że komórkom knockdown brakuje organizacji. W 15 dniu komórki kontrolne zostają zatrzymane we wzroście ze zróżnicowanym ASIN lub strukturami i dobrze zdefiniowanym światłem rozchodzącym się od komórek knockdown, które prezentują inwazyjny fenotyp rozgałęziony i rurkowy. Barwienie immunofluorescencyjne wykazuje utratę ekspresji lamininy v integryny alfa sześć i herryny ECA, co wskazuje odpowiednio na przerwanie błony podstawnej, utratę podstawowej polarności i kontaktu komórek komórkowych.

W komórkach nowotworowych komórki kontrolne wykazują nienaruszoną warstwę wokół asininowej podstawowej ekspresji wierzchołkowej integryny alfa six GM one 30 i eca. Tutaj, na połączeniu komórek komórkowych, złośliwy fenotyp komórek HME knockdown CCN został odwrócony za pomocą egzogennego traktowania oczyszczonym rekombinowanym ludzkim białkiem CCN sześć dwóch wysoce przerzutowych linii komórek piersi, około 1 49 i M-D-A-M-B 2 31. Byli leczeni inhibitorami kinazy P 38 map, SB 2 0 3 8 50 i SB 2 0 2 1 90, które zmniejszały złośliwe zachowanie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować komórki piersi w hodowli 3D i skutecznie wykorzystywać wzrost podobny do sino na matrigelu jako odczyt w celu odróżnienia łagodnych od złośliwych fenotypów komórek piersi.