Name: Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek piersi do rozróżniania fenotypów łagodnych i złośliwych. Ta metoda z wykorzystaniem Matrigelu pozwala analizować zmiany fenotypowe i molekularne w badaniach nad rakiem piersi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01 CA107469, R01 CA125577 i U01CA154224 dla C.G. Kleer, University of Michigan's Cancer Center Support.

1. Przygotowanie materiałów i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Rozmrażanie o zredukowanym współczynniku wzrostu (GFR) Matrigel w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Rozgrzej kompletną pożywkę dla wymaganej linii komórkowej w temperaturze 37 °C. Pożywka określona przez MCF10A- ATCC; HME- Pożywka F-12 firmy Ham's uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml insuliny, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 100 ng/ml toksyny; SUM149- Pożywka F-12 firmy Ham's uzupełniona o 5% FBS, 2 μg/ml hydrokortyzonu i 5 μg/ml insuliny; oraz MDA-MB-231-10% FBS-DMEM</li>
	<li>Wstępnie schłodzić szkiełko z 8-dołkową komorą na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj kaptur do hodowli tkankowych i materiały.</li>
</ol>
2. Hodowla trójwymiarowa w 8-dołkowym szkiełku komorowym 
<ol>
	<li>Pokryj każdą studzienkę szkiełka 8-dołkowego 40 μl GFR Matrigel. Dodaj Matrigel na środku szkiełka, a następnie rozprowadź za pomocą końcówki do pipety P200. Staraj się rozprowadzać tak równomiernie, jak to możliwe, unikając pęcherzyków i nadmiernego rozprowadzania, które mogą prowadzić do powstania łąkotki.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 . Podczas krzepnięcia Matrigel trypsynizuj komórki, zbieraj i wiruj w tempie 150 x g w wirówce do hodowli tkankowych przez 4 minuty.</li>
	<li>Policz komórki i rozcieńcz do 12 500 komórek/ml w kompletnej pożywce odpowiedniej linii komórkowej. Dodać GFR Matrigel do 2% i dodać 400 μl do każdego dołka wstępnie powlekanego szkiełka komorowego Matrigel.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w inkubatorzeCO2. Podawaj świeże, kompletne zmiany podłoża co 4dni do 15 dni.</li>
	<li>Leczenie inhibitorami farmakologicznymi: W przypadku badań nad inhibitorami należy dodać inhibitory małocząsteczkowe do kompletnej pożywki w czasie posiewu, a następnie nowe zmiany pożywki uzupełniane inhibitorami co trzy dni podczas hodowli komórek na GFR Matrigel.</li>
	<li>Leczenie oczyszczonym białkiem: 
	<ol>
		<li>Umieść komórki na płytkach, wykonując czynności 2.1-2.3. Pozwól kulturom rosnąć przez 4 dni, a następnie głodz surowicy przez 16 godzin.</li>
		<li>W 5 dniu należy potraktować komórki odpowiednim stężeniem oczyszczonego białka w 0,1% pożywce uzupełnionej FBS do komórek wygłodzonych w surowicy. Po 2 dniach należy podać świeżą pożywkę z oczyszczonym białkiem.</li>
		<li>W 10 dniu wymień kondycjonowane media na kompletne media HME. Pozwól kulturom rosnąć przez kolejne 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne struktur groniastych wyhodowanych na Matrigelu: 
	<ol>
		<li>Przygotuj 2% paraformaldehydu, 0,5% Triton X-100 i 100 mM glicyny w 1x PBS, pH 7,4. Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (bufor IF), który składa się z 1x PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,2% trytonu X-100, 0,05% Tween-20.</li>
		<li>Użyj końcówki do pipety P200, aby ostrożnie zassać kondycjonowane media.</li>
		<li>Utrwalić struktury ziarniaste za pomocą 2% świeżo przygotowanego paraformaldehydu w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj kultury trzy razy 100 mM glicyny, 10-15 minut na każde pranie.</li>
		<li>Zablokuj komórki 10% surowicą kozią w buforze IF, zwanym blokiem pierwotnym, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować kultury z 20 μg/ml koziego fragmentu F(ab')2 przeciwko mysi w pierwotnym buforze blokowym przez 30 minut. Ten krok jest ważny, aby zablokować immunoreaktywne gatunki mysich IgG w Matrigelu.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w drugim roztworze blokującym (blok pierwszorzędowy + 20 μg/ml kozi fragment F(ab')2 kozy) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie buforem IF przez 10-15 minut każdy z delikatnym kołysaniem.</li>
		<li>Inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w buforze IF przez 45 minut.</li>
		<li>Myć 3x po 10 min buforem IF z delikatnym kołysaniem.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI, aby uwidocznić jądra.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Akwizycja obrazu: Uzyskaj obrazy konfokalne w środkowej części kolonii komórek wyhodowanych na wierzchu Matrigel. Aby uzyskać więcej informacji, uzyskaj szereg przekrojów optycznych na całej długości struktury ziarniastej za pomocą układania w stos Z.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trójwymiarowa hodowla w 2-dołkowych szkiełkach komórkowych do immunoblottingu
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić szkiełko z 2-dołkową komorą na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.1-2.4, zwiększając ilość odczynników do szkiełka 2-dołkowego, np. pokryj 160 μl Matrigel i dodaj 1,6 ml mieszanki komórek/Matrigelu do każdego dołka szkiełka 2-dołkowego.</li>
	<li>Zbierz struktury groniaste z Matrigelu za pomocą dostępnego na rynku zestawu do pobierania komórek hodowlanych 3D, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Rozcieńczyć do przemywania i zbierania komórek do 1x i wstępnie schłodzić do 4 °C. Mycie i usuwanie Matrigelu powinno odbywać się na lodzie.</li>
	<li>Przemyć struktury groniaste 3x za pomocą buforu do przemywania komórek.</li>
	<li>Zebrać acini do 15 ml probówek wirówkowych za pomocą buforu do pobierania komórek, a następnie przeprowadzić 30-minutową inkubację na kołysku w temperaturze 4 °C. Dobrze wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Spowoduje to rozbicie Matrigelu na małe kawałki i uwolnienie większości komórek w buforze do zbierania komórek.</li>
	<li>Granulować komórki w proporcji 200 x g w wirówce hodowlanej. Usuń pływającą warstwę hydrożelu z granulowanych komórek za pomocą końcówki pipety P200.</li>
	<li>Ponownie zawiesić lizaty w buforze próbki SDS dostarczonym z zestawem. Można również zastosować bufor do lizy RIPA.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja złośliwego i łagodnego fenotypu piersi
<ol>
	<li>Hodować komórki w trzech egzemplarzach dla każdego zestawu poddanego zabiegowi, wykonując kroki 2.1-2.4.</li>
	<li>Wykonaj obrazy kontrastu fazowego struktur zrazikowych z każdej studzienki w rozdzielczości 5X lub 10X za pomocą mikroskopu kontrastu fazowego podłączonego do przesuwnika i komputera. Rób zdjęcia, przesuwając szkiełko z jednej klatki do drugiej, zakrywając w ten sposób całą studzienkę szkiełka komorowego.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę struktur ziarniastych, liczbę pojedynczych okrągłych płaskich acini i liczbę struktur wieloakarnych lub przypadkowo rosnących struktur pozbawionych organizacji i z emanującymi z nich rozgałęzionymi procesami.</li>
	<li>Oblicz procent pojedynczych okrągłych płaskich struktur groniastych w porównaniu ze strukturami złośliwymi i wykreśl jako wykres kolumnowy. Oblicz istotność za pomocą testu t-Studenta.</li>
</ol>

<ol><li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+in+breast+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li>
<li>Rosen, P. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosen%2C+PP+%22Rosen%27s+breast+pathology%22">Rosen's breast pathology</a>. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1%2Fp38+pathway%2C+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-%CE%B2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth%2C+progression%2C+and+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li>
<li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li>
<li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisaliśmy tutaj trójwymiarową hodowlę komórek nabłonka piersi na odtworzonej błonie podstawnej oraz przydatność tego systemu do różnicowania złośliwego i łagodnego fenotypu piersi. System ten może być również używany do hodowli różnych typów komórek z innych tkanek gruczołowych i doniesiono, że jest z powodzeniem stosowany do hodowli komórek nabłonka prostaty, nabłonka oskrzeli i komórek nabłonka tarczycy, by wymienić tylko kilka12-14. Znaczenie kultury 3D polega na tym, że jest to model fizjologicznie istotn...

Trójwymiarowa hodowla (3D) komórek nabłonka piersi na odtworzonej błonie podstawnej jest ważnym systemem modelowym do badania złożonego fenotypu i związanej z nim sygnalizacji prawidłowego raka piersi2,3. Jednostką funkcjonalną piersi jest jednostka zrazikowa przewodu końcowego (TDLU), która składa się z małego przewodu, który rozgałęzia się na acini. Acini są wysoce zorganizowanymi strukturami, składającymi się z dwóch warstw komórkowych, komórek nabłonkowych i mioepitelialnych, które są otoczone błoną podstawną5. Najbardziej charakterystycznymi cechami normalnej acini są polaryzacja komórkowa, przywiązanie do leżącej poniżej błony podstawnej i wyspecjalizowane kontakty komórka-komórka. Ta skomplikowana organizacja jest zaburzona w rakach inwazyjnych. Szeroko stosowane hodowle 2D, w których komórki są hodowane jako monowarstwy, nie pozwalają na tworzenie się acini. W związku z tym kultura jednowarstwowa nie zapewnia systemu do uchwycenia skomplikowanego związku między komórkami nabłonka w normalnej piersi a ich deregulacją w raku piersi. W kilku laboratoriach opracowano funkcjonalne monotypowe kultury nabłonkowe komórek piersi2,3. Hodowla 3D polega na wzroście komórek piersi na Matrigel, który jest rozpuszczonym ekstraktem pochodzącym z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm i jest dostępny na rynku. Stosowane są również inne podłoża 3D, takie jak kolagen I. Komórki piersi mogą być hodowane w 3D za pomocą wbudowanego testu 3D, w którym komórki są hodowane w Matrigel2. Alternatywnie, komórki mogą być hodowane za pomocą testu 3D na górze, zwanego również testem nakładkowym 3D, który jest opłacalny, ponieważ wymaga mniejszej objętości Matrigelu i ułatwia monitorowanie tworzenia kolonii w czasie za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym i jest idealny do obrazowania in situ 2-3. Test 3D na górze został wykorzystany do określenia korelacji między fenotypem ziarniastym a profilem ekspresji genów7.
3D hodowla może być skutecznie wykorzystana do odróżnienia normalnych i łagodnych komórek od raka inwazyjnego. Normalne i łagodne komórki piersi tworzą spolaryzowane struktury zatrzymane w porachunku z dobrze zdefiniowanym światłem w środku na Matrigel, podczas gdy komórki raka inwazyjnego rosną obficie i przypadkowo, bez oczyszczania światła. Unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka sutka E6 / E7 i linia komórkowa MCF10A, która jest spontanicznie unieśmiertelnioną linią komórkową wyizolowaną od 36-letniej pacjentki ze zmianami włóknisto-torbielowatymi, zostały z powodzeniem wykorzystane do uchwycenia łagodnego fenotypu piersi w 3D3,8 i posłużyły jako system modelowy do badania onkogennej i supresorowej funkcji nowotworowej kilku cząsteczek8,9. Te łagodne komórki mogą być zmodyfikowane tak, aby manipulowały genami będącymi przedmiotem zainteresowania poprzez wprowadzenie lentiwirusa/retrowirusa. Jeśli interesujący gen (geny) jest supresorem guza, knockdown za pośrednictwem shRNA doprowadzi do złośliwej transformacji, podczas gdy jeśli gen będący przedmiotem zainteresowania jest onkogenem, nadekspresja w łagodnych komórkach powinna wykazywać złośliwy fenotyp. W obu przypadkach struktury groniaste utworzone w 3D mogą uchwycić złośliwą transformację.
Łagodne pojedyncze komórki pokryte 3D zaczynają się namnażać i tworzyć okrągłe kuliste struktury. Do 5-8 dnia ten kulisty agregat komórek zróżnicuje się w otaczającą spolaryzowaną warstwę komórek, która jest w kontakcie z Matrigelem, oraz wewnętrzną masę mniej spolaryzowanych komórek, które nie mają kontaktu z Matrigelem. W ciągu najbliższych 10-15 dni komórki wewnętrzne zaczną obumierać w wyniku apoptozy, tworząc przezroczyste światło. Złośliwe komórki będą rosły przypadkowo, tracąc swoją polarność. Wysoce złośliwe komórki zwykle tworzą rozgałęzione struktury. Te różnice w fenotypie można uchwycić za pomocą obrazowania z kontrastem w fazie poklatkowej oraz barwienia immunologicznego in situ za pomocą odpowiednich markerów molekularnych. Najczęściej stosowanymi markerami są alfa 6-integryna, podstawowy marker polarności, w połączeniu z markerem proliferacji fosfohistonem 3 i markerem apoptozy rozszczepionej kaspazy-3. To ostatnie jest ważne dla ustalenia, czy w środku acini tworzy się światło, co jest cechą normalnych i łagodnych komórek piersi. Inne markery polarności i kontaktu komórka-komórka to GM130, laminina, ERM, E-kadheryna. Alternatywnie, linie komórkowe raka piersi mogą być zmodyfikowane tak, aby manipulować genem, który jest przedmiotem zainteresowania. W takim przypadku powrót do bardziej zatrzymanego wzrostu łagodnego fenotypu może być wykorzystany jako odczyt w celu odróżnienia od fenotypu raka.
3D kultura może być również ostrożnie wykorzystana do wyznaczenia szlaków sygnałowych zaangażowanych w złośliwą transformację10-11. Korzystając z wyżej wymienionych odczytów, można zastosować inhibitory farmakologiczne, przeciwciała blokujące lub białka rekombinowane, aby precyzyjnie określić sygnalizację molekularną, prowadząc do transformacji złośliwej. Dzięki ciągłym wysiłkom różnych laboratoriów możliwe jest wyekstrahowanie komórek z 3D w celu wyizolowania RNA, a także przygotowania lizatów do immunoblottingu i immunoprecypitacji. Strategie te są opisane w protokole w sposób stopniowy i szczegółowy.

<table><tbody><tr><td>Obniżony czynnik wzrostu Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>Unikaj powtórnego zamrażania</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane Lab-Tek 8-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>Precool na lodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane Lab-Tek 2-dołkowe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>Wstępne chłodzenie na lodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Koza anty mysz F(ab&acute;)2 fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne sprzężone przeciwciała Alexa</td><td>Sondy molekularne</td><td></td><td>Zajrzyj na stronę internetową sond molekularnych</td></tr><tr><td>Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu za pomocą</td><td>sond molekularnych</td><td>DAPI P36935</td><td></td></tr><tr><td>Komórka hodowlana 3D Zestaw do zbioru</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Apha-6-integryna</td><td>Fisher Scientific MAB1378</td><td></td><td>Rozcieńczenie 1:100 dla IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>Rozcieńczenie 1:100 dla IF</td></tr><tr><td>Anty-fosfohiston 3 (Ser10)FITC Sprzężony</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>1:100 rozcieńczenie dla</td></tr><tr><td>IF Anty-rozszczepiona kaspaza 3 (Asp 175)</td><td>Komórka Sygnalizacja</td><td>9661s</td><td>rozcieńczenie 1:50 dla IF</td></tr><tr><td>Anty-E-kadheryna</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>rozcieńczenie 1:200 dla IF</td></tr></tbody></table>

hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Inwazyjne raki piersi to grupa złośliwych nowotworów nabłonkowych charakteryzujących się inwazją sąsiednich tkanek i skłonnością do przerzutów. Wzajemne oddziaływanie sygnałów między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem wywiera silny wpływ na wzrost raka piersi i zachowanie biologiczne1. Jednak większość tych sygnałów z macierzy zewnątrzkomórkowej jest tracona lub ich znaczenie jest niedostatecznie zbadane, gdy komórki są hodowane w kulturze dwuwymiarowej (2D) jako monowarstwa. W ostatnich latach trójwymiarowa (3D) hodowla na odtworzonej błonie podstawnej pojawiła się jako metoda z wyboru do rekapitulacji architektury tkankowej łagodnych i złośliwych komórek piersi. Komórki hodowane w 3D zachowują ważne sygnały z macierzy zewnątrzkomórkowej i zapewniają fizjologicznie istotny system ex vivo 2,3. Warto zauważyć, że istnieje coraz więcej dowodów sugerujących, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w 3D w porównaniu z 2D4. Hodowla 3D może być skutecznie stosowana jako środek do odróżniania złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi oraz do wspierania zaangażowanej sygnalizacji komórkowej i molekularnej3. Jedną z cech wyróżniających łagodne komórki nabłonkowe jest to, że są one spolaryzowane tak, że cytoplazma wierzchołkowa jest skierowana w stronę światła, a cytoplazma podstawy spoczywa na błonie podstawnej. Ta cierpko-podstawowa polaryzacja jest tracona w inwazyjnych rakach piersi, które charakteryzują się dezorganizacją komórkową i tworzeniem się zespoleń i rozgałęzionych kanalików, które przypadkowo naciekają otaczający zrąb. Te histopatologiczne różnice między rakiem łagodnym a rakiem inwazyjnym można odtworzyć w 3D6,7. Korzystając z odpowiednich odczytów, takich jak kwantyfikacja pojedynczych okrągłych struktur groniastych lub różnicowa ekspresja zwalidowanych markerów molekularnych dla proliferacji, polarności i apoptozy komórek w połączeniu z innymi technikami biologii molekularnej i komórkowej, hodowla 3D może stanowić ważne narzędzie do lepszego zrozumienia zmian komórkowych podczas transformacji nowotworowej i do wyznaczenia odpowiedzialnej sygnalizacji.

Kulturę 3D można skutecznie wykorzystać do odróżnienia fenotypu złośliwego ludzkich komórek nabłonkowych piersi od fenotypu łagodnego. Pojedyncze komórki łagodne wysiane na Matrigel rosną jako zorganizowane struktury sferyczne, które można łatwo obrazować jako pojedyncze, okrągłe, płaskie cewki w jednej płaszczyźnie, stosując obrazowanie w kontraście fazowym. Pojedyncze komórki złośliwe wysiane na Matrigel rosną w sposób chaotyczny, wykazują bardzo wysoki współczynnik refrakcji i są trudne do obrazowania w jednej płaszcz...

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie trójwymiarowego systemu hodowli jako sposobu na odróżnienie łagodnego fenotypu piersi od fenotypu złośliwego. Osiąga się to poprzez wysianie komórek kontrolnych i doświadczalnych w trzech powtórzeniach na warstwie Matrigelu o zredukowanej zawartości czynników wzrostu w szkiełku z komorami ośmiodołkowymi. Drugim krokiem jest wymiana na świeże pożywkę kompletną z 2% GFR Matrigel co czwarty dzień, co pozwala na wzrost kolonii przypominających acinusy przez okres od 10 do 15 dni.Następnie, przy powiększeniu 5x, pozyskuje się obrazy w kontraście fazowym kolonii przypominających aser wyhodowanych w 3D. Ostatnim krokiem jest przygotowanie kultur przypominających aser do analizy immunocytochemicznej z zastosowaniem odpowiednich markerów molekularnych, a następnie wykonanie obrazowania konfokalnego w przekroju poprzecznym kolonii przypominających aser po barwieniu immunologicznym. Ostatecznie obrazy w kontraście fazowym oraz obrazy konfokalne komórek hodowanych w kulturze 3D służą do identyfikacji fenotypowych i molekularnych zmian komórkowych, co pozwala na odróżnienie łagodnych komórek piersi od komórek złośliwych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowle dwuwymiarowe czy testy inwazji lub migracji, jest możliwość odtworzenia architektury tkanki łagodnej piersi oraz utraty jej organizacji podczas transformacji złośliwej. Dzięki temu technika ta może być skutecznie wykorzystywana do odróżnienia łagodnych komórek piersi od komórek złośliwych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi, takie jak wpływ defektów szlaków sygnalizacyjnych na fenotyp komórek, a także w identyfikacji nowych onkogennych i/lub supresorowych szlaków nowotworowych.Aby rozpocząć eksperyment, rozmrozić Matrigel z obniżoną zawartością czynników wzrostu (GFR) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie podgrzać kompletną pożywkę HME do 37 °C i umieścić szkiełko z ośmioma komorami na lodzie w celu schłodzenia. Do środka każdej komory schłodzonego szkiełka dodać 40 µL Matrigelu GFR.Rozprowadź żel tak równomiernie, jak to możliwe, używając końcówki do pipety P 200, unikając pęcherzyków powietrza oraz nadmiernego rozprowadzenia, co może prowadzić do powstania menisku. Następnie utrwal żel Matrigel, inkubując szkiełko w temperaturze 37 °C i 5% CO2; gdy żel Matrigel stężeje, zdetrypsynizuj komórki HME, a następnie zbierz je do probówki o pojemności 15 ml i wiruj komórki z prędkością 150 ×g przez cztery minuty, policz komórki i rozcieńcz je do stężenia 12 500 komórek/ml w pełnej pożywce. Do zawiesiny komórkowej dodaj GFR Matrigel do końcowego stężenia 2% i nanieś 400 µL roztworu do każdego dołka wcześniej zakodowanego szkiełka komorowego.Następnie należy umieścić preparat w inkubatorze z buforowanym CO2. Co cztery dni przez okres 15 dni należy wymieniać pożywkę na świeżą pożywkę kompletną. W przypadku badań nad inhibitorami, w momencie wysiewania do pożywki kompletnej dodaje się inhibitory małocząsteczkowe, a następnie co trzy dni wymienia pożywkę na świeżą z dodatkiem inhibitorów, aby rozpocząć wzrost komórek i przygotować powtórzenia trzykrotne dla każdego zestawu traktowania.Wykonaj obrazy w kontraście fazowym struktur aser z każdej studni przy powiększeniu 5x, używając mikroskopu kontrastowego z dołączonym przesuwaczem preparatów i komputerem. Wykonaj zdjęcia, przesuwając preparat z jednej ramki do drugiej, obejmując całą szerokość studni szkiełka komorowego. Policz całkowitą liczbę struktur aser, liczbę pojedynczych, okrągłych i płaskich asinine oraz liczbę wielokrotnych struktur aser lub struktur rosnących chaotycznie, pozbawionych organizacji.Następnie, wykorzystując procesy odgałęziania, oblicz procentowy udział płaskich struktur aser jednorundowych w stosunku do struktur złośliwych i przedstaw te dane na wykresie kolumnowym. Istotność statystyczną oblicz za pomocą dwustronnego, niezależnego testu t Studenta.Przygotować odczynniki do barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie, używając pipety P 200, ostrożnie odessać pożywkę kondycjonowaną. Następnie utrwalić ASIN lub struktury świeżo przygotowanym 2%paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 20 minut; po utrwaleniu przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą 0,5%triton X 100 przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie kultury należy przemyć trzykrotnie 100 mM glicyną, przez 10 do 15 minut podczas każdego płukania. Kolejnym krokiem jest blokowanie komórek w pierwszym buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie kultury inkubuje się przez 30 minut w pierwszym buforze blokującym z dodatkiem 20 µg/mL koziego przeciwciała anty-mysiego Fab2, zwanym również drugim roztworem blokującym, aby zablokować mysie IgG w Matrigelu.Po blokowaniu inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w drugim roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć komórki trzykrotnie buforem do immunofluorescencji lub buforem I, delikatnie kołysząc przez 10 do 15 minut podczas każdego płukania. Następnie inkubować komórki z koniugowanymi z fluoresceincją przeciwciałami wtórnymi w buforze if F przez 45 minut.Następnie komórki należy przemyć trzykrotnie przez 10 minut za każdym razem w buforze if, delikatnie kołysząc próbkami. Preparaty na szkiełkach należy zamontować, stosując odczynnik przeciwblaknący zawierający DPI, aby zwizualizować jądra komórkowe. Szkiełka należy pozostawić do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.Następnie należy wykonać obrazy konfokalne w przekroju środkowym kolonii komórek rosnących na matrigelu oraz serię przekrojów optycznych przez całą długość struktur asner poprzez z-stacking obrazów konfokalnych. Komórki HME kontrolne oraz z knockdownem C CN six barwione DPI w piątym dniu wykazują brak organizacji w komórkach z knockdownem. W piętnastym dniu komórki kontrolne ulegają zahamowaniu wzrostu, tworząc zróżnicowane struktury ASIN z dobrze zdefiniowanym lumenem, co odróżnia je od komórek z knockdownem, które wykazują inwazyjny fenotyp rozgałęziony i cewkowaty. Barwienie immunofluorescencyjne wykazuje utratę ekspresji lamininy, integryny v alpha six oraz E-kadheryny, co wskazuje odpowiednio na rozpad błony podstawnej, utratę polaryzacji podstawnej oraz utratę kontaktów międzykomórkowych.W komórkach złośliwych komórki kontrolne wykazują nienaruszoną warstwę wokół podstawowej ekspresji integryny alpha six oraz apikalnej ekspresji GM one 30 i eca. W miejscu połączenia komórka-komórka złośliwy fenotyp komórek HME z wyciszonym genem CCN six został odwrócony poprzez egzogenną aplikację oczyszczonego rekombinowanego ludzkiego białka CCN six. Dwie wysoce metastatyczne linie komórkowe raka piersi, some 1 49 oraz M-D-A-M-B 2 31, zostały poddane działaniu inhibitorów kinazy p38 map, SB 2 0 3 8 50 i SB 2 0 2 1 90, co doprowadziło do ograniczenia złośliwego charakteru komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść gruntowną wiedzę na temat hodowli komórek piersi w kulturze 3D oraz skutecznego wykorzystania wzrostu przypominającego formowanie struktur gruczołowych na Matrigelu w celu odróżnienia łagodnych od złośliwych fenotypów komórek piersi.

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Trójwymiarowe kultury: narzędzie do badania normalnej architektury gruczołów wydzielania zewnątrzkomórkowego a złośliwej transformacji komórek piersi

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film opisuje technikę hodowli 3D komórek raka płuc w celu zbadania interakcji komórka-matryca. W protokole przeprowadzimy hodowlę 3D komórek raka płuc TUM622 w celu zbadania jego potencjału tworzenia organoidów in vitro.

Trójwymiarowa hodowla komórek raka płuc: metoda badania interakcji komórka-macierz

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek piersi do rozróżniania fenotypów łagodnych i złośliwych. Ta metoda z wykorzystaniem Matrigelu pozwala analizować zmiany fenotypowe i molekularne w badaniach nad rakiem piersi.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Przeglądaj więcej filmów