Name: Elektroporacja powierzchni pialu noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji powierzchni pialu noworodków do etykietowania i manipulacji genetycznej progenitorów nerwowych. Technika ta umożliwia badanie proliferacji, migracji i różnicowania komórek w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie od Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award, a także funduszy od Instytutu Medycyny Regeneracyjnej w Cedars-Sinai i Rodziny Guerin. Opisany projekt był wspierany w formie CTSI Core Voucher ufundowanego przez National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, a obecnie znajduje się w National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Ta procedura jest zgodna z wymaganiami IACUC Cedars-Sinai. Badacze powinni upewnić się, że IACUC przestrzega przepisów instytucjonalnych przed podjęciem dalszych działań. Wszystkie narzędzia i odczynniki należy wysterylizować przed użyciem.
1. Przygotowanie narzędzi, roztworów i mieszaniny DNA
<ol>
	<li>Włóż 100-milimetrowe rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego polerowanego ogniowo do ściągacza do mikropipet. Ustaw ogrzewanie tak, aby umożliwić standardowe pociągnięcie z obciążeniem w celu uformowania końcówki pipety o średnicy około 17,5 mm. Odetnij końcówki ostrymi nożyczkami chirurgicznymi w odległości około 8-9 mm od początku końcówki, aby utworzyć otwór o średnicy około 100 μm.</li>
	<li>Przygotuj 1% w/v szybko zielony roztwór, mieszając przefiltrowaną wodę wolną od nukleaz (przy użyciu filtra strzykawkowego 20 μm) z suchym, szybko zielonym roztworem.</li>
	<li>Wyizolować oczyszczony plazmidowy DNA wolny od endotoksyn, który jest wysoce skoncentrowany (tj. > 3 μg/μl), rozcieńczony w buforze Tris-EDTA (TE). Dodaj żądane ilości plazmidu do mieszaniny rozcieńczonej w buforze TE i dodaj stosunek 1:10 1% szybkiego zielonego roztworu (co daje końcowe stężenie 0,1% w/v fast green). Użyj końcowego stężenia plazmidu 0,5-2,0 μg/μl w celu uzyskania silnej ekspresji transgenów.</li>
</ol>
2. Znieczulenie zwierząt, ładowanie pipet i wstrzykiwanie plazmidu na powierzchnię Pial
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie hipotermią u myszy 1-2 dni po urodzeniu, umieszczając je na szalce Petriego, którą umieszcza się na lodzie na 5-8 minut (czas zależy od wieku/wagi szczeniąt). Gdy hipotermia zostanie potwierdzona przez brak ruchu spowodowany szczypaniem palców u nóg i/lub odruchem ogona, myszy są gotowe do wstrzyknięcia. Umieść zwierzęta z powrotem na lodzie, jeśli widoczne są odruchy bólowe. Procedura wstrzykiwania i elektroporacji trwa łącznie mniej niż 2-3 minuty, więc odpowiednio zaplanuj procedury hipotermii, iniekcji i elektroporacji, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Podczas znieczulenia, za pomocą standardowej pipety, ostrożnie odpipetuj żądaną ilość mieszanki plazmidowej, która ma zostać wstrzyknięta (0,5-2 μl) na kawałek warstwy wosku parafinowego w celach informacyjnych. Tutaj wstrzykuje się całkowitą objętość 0,5 μl mieszanki plazmidowej. Następnie, za pomocą mikrowtryskiwacza, ostrożnie włóż zmontowaną szklaną pipetę kapilarną do probówki zawierającej mieszaninę plazmidu. Podejmij dodatkowe środki ostrożności, aby zapobiec pęknięciu końcówki, upewniając się, że nie dotyka krawędzi rurki. Zassać roztwór do pipety, powoli przykręcając pokrętło transferu. Po załadowaniu wystarczającej objętości do pipety należy przesuwać suwak do przodu, aż ciśnienie powróci do pozycji neutralnej 0 hPa.</li>
	<li>Używając ciśnienia 300-450 hPa do wstrzykiwania, aby zapewnić odpowiednie ciśnienie do równomiernego wypełnienia powierzchni pial/przestrzeni oponowej, umieść końcówkę w pobliżu referencyjnego wstrzykiwania filmu parafinowego z pipetowaną parafiną (od 2.2) i użyj pedału nożnego z mikrowtryskiwacza, aby wyrzucić jedną objętość na film parafinowy. Dostosuj odpowiednio ciśnienie, aż wyrzucana ilość zrówna się z poprzednio odpipetowaną objętością referencyjną.</li>
	<li>Po zrównoważeniu końcówki i potwierdzeniu znieczulenia, szczenięta są gotowe do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Celem eksperymentu jest wstrzyknięcie mieszanki plazmidowej pod czaszkę i powyżej powierzchni pial, aby umożliwić elektroporację DNA w dół do progenitorów na powierzchni pial (ryc. 1A). W przypadku wstrzyknięć do kory mózgowej należy przytrzymać szczenię za pomocą kciuka i palca wskazującego mniej dominującej ręki. Półkule korowe i inne powierzchowne struktury, takie jak górne wzgórki, są widoczne między P0 a P2, co pozwala na łatwe celowanie w te struktury (ryc. 1B). Używając dominującej ręki i docelowego obszaru kory mózgowej (tj. motorycznego, somatosensorycznego itp.), włóż pipetę obok skóry i czaszki, uważając, aby uniknąć tętnic mózgowych. Upewnij się, że nie dopuścić do dalszego przenikania końcówki poza czaszkę (na co wskazuje brak dalszego oporu tuż po przebiciu czaszki).</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór plazmidu za pomocą pedału nożnego mikrowstrzykiwacza i upewnić się, że równomiernie rozprowadza się w tkance (ryc. 2A). 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby empirycznie określić podejście, które maksymalizuje dostarczanie plazmidu, jednocześnie unikając krwiaka spowodowanego ciśnieniem płynu. Można to zrobić, dostosowując czas wstrzyknięcia, kąt, objętość i dokładne miejsce docelowe, aby uniknąć zaburzeń naczyniowych.</li>
	<li>Pamiętaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia końcówki między wstrzyknięciami, umieszczając końcówkę w kropelkach testowych z iniekcji wykonanych wcześniej na papierze woskowanym lub plastikowej folii parafinowej. Jest to wymagane, aby zapobiec gromadzeniu się w końcówce odparowanego i skrystalizowanego roztworu DNA, co może spowodować zatkanie końcówki i niespójne objętości dostarczania.</li>
</ol>
3. Elektroporacja
<ol>
	<li>Ustaw elektroporator na 135-150 V na pięć impulsów, trwających 50 ms, z przerwami 950 ms między każdym impulsem. Aby zwiększyć przewodność i zapobiec poparzeniom skóry, pokryj 3-milimetrową platynową pęsetę żelem do elektroporacji. Sprawdź, czy w tym momencie nie ma szczypania palców u nóg i odruchów ogonowych, aby zapewnić znieczulenie. Jeśli reaguje, umieść na lodzie na kilka minut w celu znieczulenia.</li>
	<li>Do wstrzykiwań kory mózgowej (i wzgórka górnego) należy użyć elektrody 3 mm (ryc. 2B), aby zwiększyć żywotność szczeniąt (w porównaniu z elektrodami 7 i 10 mm, które są używane do elektroporacji strefy komorowej). Umieść ujemnie naładowaną sondę elektrody nad obszarem wstrzyknięcia, a dodatnio naładowaną sondę wokół przeciwległego obszaru poniżej oka, tak aby elektroda była zorientowana pod kątem 45-60° w stosunku do linii środkowej (rysunek 2C).</li>
	<li>Użyj pedału nożnego elektroporatora, aby wyzwolić prąd i przytrzymaj pęsetę w miejscu przez 3-5 impulsów, w zależności od wieku i wagi szczeniąt, skutecznie kierując DNA do leżących poniżej komórek powierzchni pial podczas uwzględniania krzywizny półkul. 
	Uwaga: Biegun ujemny można przesunąć po obszarze wtrysku między impulsami lub można zastosować większą elektrodę w celu zwiększenia obszaru elektroporowanego.</li>
	<li>Natychmiast po elektroporacji ostrożnie usuń żel ze szczeniąt i umieść je pod lampą grzewczą na około 5 minut.</li>
	<li>Szczenięta ostro tracą swój naturalny czerwonawo-różowy odcień w ciągu kilku minut po elektroporacji z powodu sinicy. Obserwuj młode pod kątem odzyskania naturalnego koloru i zainicjowania normalnego ruchu przed powrotem do klatek.</li>
	<li>Zapewnij resocjalizację z matką, obserwując, czy przynosi ona młode z powrotem do gniazda i zaczyna je pielęgnować. Jeśli stanie się agresywna, upewnij się, że szczenięta nie mają resztek żelu i wysiaduj je z częścią ściółki, aby przenieść zapach na szczenięta.</li>
</ol>
4. Modyfikacje dla celowania w górne kolikilusy
Kierowanie:
<ol>
	<li>Wstrzyknij górny wzgórek w taki sam sposób jak korę, ale zwróć uwagę, że obszar docelowy leży tuż za i bocznie do lambda i mniej więcej na linii środkowej (ryc. 3A i 3B). Przy udanych iniekcjach mieszanka plazmidowa w naturalny sposób wypełnia kontury wzgórka górnego. Po pomyślnym wykonaniu iniekcji zwierzęta są gotowe do elektroporacji.</li>
</ol>
Elektroporacja:
<ol>
	<li>W bardzo podobny sposób, w przypadku wstrzyknięć górnego wzgórka, umieść ujemnie naładowaną sondę elektrody na wstrzykniętym obszarze, a dodatnio naładowaną sondę wokół oka, pyska lub podbródka, kierując DNA do powierzchownych obszarów górnego wzgórka (ryc. 3C). W tym przypadku orientacja elektrody jest ustawiona pod kątem 25-40° w stosunku do linii środkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+historical+perspective+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+that+glitters+isn%27t+gold%3A+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li>
<li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginal+zone%2Flayer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li>
<li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li>
<li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li>
<li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+cerebral+cortex%3A+Boulder+Committee+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li>
<li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon%3A+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li>
<li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li>
<li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li>
<li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li>
<li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li>
<li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li>
<li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li>
<li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li>
<li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li>
<li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li>
<li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+maturation+of+GABA%28A%29+and+GABA%28C%29+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li>
<li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li>
<li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li>
<li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li>
<li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najbardziej krytycznym aspektem dla udanej elektroporacji komórek progenitorowych powierzchni pial są: 1) ukierunkowanie mieszanki plazmidowej na powierzchnię pial; 2) unikanie powstawania krwiaków w miejscu wstrzyknięcia; oraz 3) unikanie śmiertelności związanej z elektroporacją śródmózgowia.
Właściwe celowanie w powierzchnię pial odbywa się poprzez mierzone i ostrożne nakłucie czaszki, aby uniknąć penetracji powierzchni pial. O niewłaściwym kierowaniu na leżącą nad nią skórę lub leżącą pod n...

Neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe są obecne w całym OUNssaków 1,2. Ich charakter i właściwości w embrionalnych i dorosłych strefach rozrodczych otaczających komorowe obszary mózgu i rdzenia kręgowego zostały obszernie udokumentowane w ciągu ostatniej dekady1-3. W dużej mierze wynika to z rozwoju coraz bardziej precyzyjnych narzędzi genetycznych, takich jak specyficzna dla układu nerwowego rekombinacja Cre floksowanych alleli lub śledzenie linii retrowirusowej4. Jednak jeden region progenitorowy – strefa progenitorowa na powierzchni pial – dopiero niedawno został opisany w szczegółach5-7 i czeka na kompleksowe badanie.
Powierzchnia mózgu jest zdefiniowana jako interfejs między powierzchnią mózgu a otaczającymi ją oponamimózgowymi 8. Podczas rozwoju neuroepitelialne, a później promieniowe stopy końcowe glejowe przyczepiają się do tej powierzchni9,10. W tym regionie obserwuje się jedne z pierwszych neuronów w ludzkim mózgu i wiele mitoz neuronalnych11. Później, podczas neurogenezy embrionalnej, wiadomo, że interneurony korowe przechodzą przez obszar pialny, oprócz swoich tras migracyjnych w strefie pośredniej i strefie podkomorowej12-14. W tym okresie komórki macierzyste mogą być hodowane z tej strefy i wydaje się, że jest to aktywne miejsce neuro- i glejogenezy5. W dorosłym mózgu doniesiono, że interneurony mogą powstać z komórek progenitorowych na powierzchni mięśnia pierwotnego po prowokacjihipoksyjnej 7. Jednak wkład tego regionu w jego genensis podczas rozwoju embrionalnego i pourodzeniowego pozostał niejasny, częściowo ze względu na trudności w dokładnym zbadaniu tego regionu6. W wzgórku górnym i korze mózgowej interneurony powierzchowne (lub warstwa I w korze mózgowej) mogą modulować wyjście obwodu leżącego poniżej populacji neuronów pobudzających, a tym samym znacząco przyczyniać się do funkcji tych struktur. W szczególności interneurony warstwy 1 są w doskonałej pozycji do regulowania wypalania neuronów w górnych warstwach kory mózgowej, biorąc pod uwagę ich rozległą łączność z powierzchownymi i głębokimi warstwami kolumn korowych15,16. W podobny sposób interneurony poziome otrzymują bodźce pobudzające z włókien korowych i siatkówkowych, wystają na stosunkowo duży obszar i spekuluje się, że pośredniczą w hamowaniu populacji neuronów reagujących na odległe bodźce wzrokowe17,18. Ponadto ich morfologia jest dobrze przystosowana do odgrywania potencjalnej roli w wzorzystej aktywności falowej w rozwijającym się układzie wzrokowym19. Co ciekawe, rozwój i dojrzewanie interneuronów zachodzi w dużym stopniu po urodzeniu. Co więcej, stwierdzono, że ten proces dojrzewania jest regulowany przez aktywność neuronalną i dlatego jest substratem plastyczności rozwojowej z konsekwencjami na całe życie dla funkcji obwodu20,21. Warto zauważyć, że nie opisano żadnych promotorów, które mogłyby specyficznie celować w te komórki transgenicznie. Dzielący się progenitorzy mogą być ukierunkowani za pomocą retrowirusa7, ale produkcja wirusa jest czasochłonna i wymaga umiejętności, aby uzyskać wysokie miana potrzebne do transdukcji komórki.
Elektroporacja doprowadziła do renesansu w badaniach nad rozwojem neurologicznym, ponieważ pozwala na szybkie i skuteczne genetyczne badanie ścieżek sygnałowych w neuronalnych progenitorach 4,22,23. Elektroporacja polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA, a następnie dostarczeniu impulsów elektrycznych na zewnątrz głowy, w celu jednokierunkowego wkierowania DNA do proliferujących komórek progenitorowych otaczających komory 4,22,23. Wydaje się, że elektroporacja wymaga przejścia komórek przez fazę M cyklu komórkowego w celu ekspresji transgenów plazmidowych24. W szczególności stwierdzono, że tylko komórki przechodzące przez fazę M w ciągu 8 godzin od elektroporacji plazmidów będą wyrażać transgeny pomimo ich skutecznego dostarczania do wszystkich komórek w promieniu ~160 μm od ściany komory24. Spekuluje się, że wynika to z potrzeby rozpadu otoczki jądrowej w celu umożliwienia dostępu jądrowego plazmidów episomalnych, ponieważ substancje chemiczne powodujące przenikanie jądrowe mogą indukować ekspresję plazmidów w komórkach postmitotycznych25. Elektroporacja, pierwotnie stosowana w zarodku22, została przystosowana do użytku w mózgu po urodzeniu znacznie później26,27. Ostatnio dostosowaliśmy elektroporację do stosowania w manipulacji genetycznej komórek progenitorowych powierzchni pialnej6. Co więcej, stosując to podejście, wykazaliśmy, że najwyraźniej istnieją dwie odrębne linie przodków w tym regionie - międzyneuronalna i astrocytowa6. Protokół ten szczegółowo opisuje prosty, szybki i potężny sposób celowania w te komórki w celu zbadania mechanizmów regulujących rozwój tych komórek.

<table><tbody><tr><td>Polerowane ogniowo rury borokrzemianowe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Company</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich, Inc.</td><td>F7528</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikrowtryskiwacz XenoWorks</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Generator</td><td><a name="ZASIĘG! B6">Aparat Harvard, BTX Instrument Div</a></td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>3-mm platynowe pęsety</td><td>Aparat Harvard, instrument BTX Div</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>Żel elektrody SignaGel</td><td>Cardinal Health</td><td>70315-025</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA, pH 8,0</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>Lampa grzewcza na podczerwień</td><td>VWR</td><td>36547-009</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki Ostre</td><td>narzędzia naukowe</td><td>14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Neonatal Pial Surface Electroporation

W ciągu ostatnich kilku lat powierzchnia błony została zidentyfikowana jako nisza zarodkowa o znaczeniu podczas embrionalnej, okołoporodowej i dorosłej neuro- i glejogenezy, w tym po urazie. Jednak metody genetycznego badania tych populacji przodków i śledzenia ich linii były ograniczone ze względu na brak swoistości lub czasochłonną produkcję wirusów. W związku z tym postęp w tym regionie był stosunkowo powolny, z zaledwie kilkoma badaniami w tej lokalizacji. Elektroporacja jest stosowana od ponad dekady do badania właściwości nerwowych komórek macierzystych w zarodku, a ostatnio w mózgu po urodzeniu. W tym miejscu opisujemy skuteczną, szybką i prostą technikę manipulacji genetycznej komórek progenitorowych na powierzchni pialnej w oparciu o dostosowane podejście do elektroporacji. Elektroporacja powierzchniowa Pial pozwala na łatwe znakowanie genetyczne i manipulację tymi komórkami progenitorowymi, co stanowi oszczędność czasu i oszczędność czasu w badaniu tych komórek.

Elektroporacja powierzchni opony miękkiej skutkuje ekspresją plazmidowego DNA w komórkach – głównie progenitorach – znajdujących się na powierzchni opony miękkiej lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie6. Bardziej szczegółowo, orientacja elektrod ma kluczowe znaczenie dla określenia kierunku przemieszczania się plazmidu i jego późniejszej ekspresji. Zatem w konfiguracjach z dwiema elektrodami plazmid jest kierowany w przybliżeniu wzdłuż linii prostej między elektrodą ujemną a dodatnią. W związku z tym, jeśli biegun...

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji. Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest genetyczne znakowanie i manipulowanie progenitorami neuronalnymi powierzchni peel. Osiąga się to poprzez wprowadzenie szklanej pipety wypełnionej roztworem plazmidowego DNA do obszaru powierzchni peel. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie DNA do przestrzeni oponowej, znajdującej się nad powierzchnią peel.Następnie elektrody są ustawione tak, aby odpowiednio doprowadzić prąd do powierzchni skórki. W ostatnim kroku DNA jest wprowadzane metodą elektroporacji do progenitorów powierzchni skórki poprzez przyłożenie prądu. Ostatecznie metoda ta może być łączona z innymi technikami w celu wykazania naturalnego przebiegu oraz determinant molekularnych proliferacji, migracji i/lub różnicowania progenitorów neuronalnych powierzchni skórki.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja wirusowa, jest to, że elektroporacja jest bezpieczniejsza, bardziej elastyczna i nie wymaga tworzenia ani pakowania cząsteczek wirusa. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych, takie jak wkład tych progenitorów z powierzchni zewnętrznej do histogenezy tkanek i funkcji obwodów neuronalnych. Na początek należy użyć wyciągacza pipet do uformowania pipet z szklanych rurek kapilarnych, a po wyciągnięciu odciąć końcówkę ostrymi nożyczkami.Następnie należy przygotować 1% roztwór zapasu fast green, używając filtrowanej wody wolnej od nukleaz. Po rozcieńczeniu plazmidowego DNA badanego, wolnego od endotoksyn, w buforze EDTA, połączyć go w odpowiednich proporcjach z 1% roztworem fast green. Za pomocą standardowej pipety nanieść pożądaną ilość mieszaniny plazmidowej przeznaczonej do iniekcji na kawałek folii z wosku parafinowego w celu odniesienia.Następnie, używając mikroinjektora, ostrożnie wprowadź zmontowaną szklaną pipetę do probówki zawierającej mieszaninę plazmidów. Unikaj dotykania krawędzi probówki końcówką, aby zapobiec jej pęknięciu. Odessaj roztwór do pipety, powoli przekręcając pokrętło transferowe w stronę przeciwną.Po pobraniu odpowiedniej objętości, obracaj tarczę w przód, aż ciśnienie powróci do neutralnej pozycji zero hektopaskali. Następnie umieść końcówkę obok wstrzyknięcia referencyjnego i użyj pedału mikroinkjektora, aby wycisnąć jedną objętość.Reguluj ciśnienie, aż objętość będzie równa wcześniej pobranej objętości referencyjnej. Po skalibrowaniu objętości iniekcji, wyjmij zwierzęta w celu wstrzyknięcia plazmidu. Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia, przytrzymaj młode za pomocą kciuka i palca wskazującego niedominującej ręki.Używając ręki dominującej, skieruj się na wybrany obszar; półkule korowe i inne struktury powierzchowne, takie jak wzgórka górne, powinny być wyraźnie widoczne. Po zlokalizowaniu właściwego miejsca wprowadź pipetę przez skórę i czaszkę, uważając, aby nie uszkodzić tętnic mózgowych.Aby skierować działanie na powierzchnię skóry, należy natychmiast zaprzestać posuwania pipety. Gdy tylko końcówka pipety przebije czaszkę i znajdzie się w prawidłowej pozycji, należy wstrzyknąć roztwór plazmidu, korzystając z pedału mikroinkubatora. Po wstrzyknięciu ostrożnie wyjmij pipetę. Aby zapobiec wysychaniu i zapychaniu się końcówki pomiędzy kolejnymi iniekcjami, należy umieszczać ją w kropelkach testowych znajdujących się na folii parafinowej. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie szczenięta zostaną poddane iniekcji, aby zwiększyć przewodnictwo i zapobiec przypaleniu skóry.Pokryj końcówki trzechmilimetrowych platynowych pęset TRO żelem do elektroporacji. Następnie dostosuj ustawienia elektryczne dla wstrzyknięć do kory mózgowej. Umieść sondę o ładunku ujemnym nad obszarem wstrzyknięcia, a sondę o ładunku dodatnim wokół przeciwległego regionu pod okiem.Elektroda powinna być ustawiona pod kątem od 45 do 60 stopni względem linii środkowej. Należy użyć pedału sterującego do wyzwolenia impulsu prądu i przytrzymać pęsety TRO w miejscu przez trzy do pięciu impulsów. W zależności od wieku i masy ciała szczeniaka, impulsy powinny wprowadzić DNA do komórek powierzchniowych skóry w miejscu aplikacji.Ujemną elektrodę można przesuwać nad obszarem iniekcji. W przerwach między impulsami lub po zastosowaniu większej elektrody w celu zwiększenia pola elektrycznego bezpośrednio po elektroporacji, należy starannie oczyścić szczenięta z żelu i umieścić je pod lampą grzewczą na około pięć minut. W ciągu kilku minut po elektroporacji szczenięta gwałtownie utracą naturalny czerwonkawy odcień skóry z powodu sinicy.Obserwuj szczenięta do momentu powrotu naturalnego kolorytu i rozpoczęcia normalnego poruszania się, przed ich powrotem do klatek lub wykonaniem iniekcji do wierzchołka wzgórza (superior colliculus). Zlokalizuj docelowy obszar tuż za i na boczny stronie od punktu Lambda, mniej więcej w linii środkowej, postępując zgodnie z wcześniej zaprezentowanymi krokami. Przy prawidłowo wykonanych iniekcjach mieszanina plazmidów naturalnie wypełnia kontury wierzchołka wzgórza.Podczas przeprowadzania elektroporacji po wtryskach do górnego kolumny, należy umieścić ujemnie naładowaną sondę elektrody nad obszarem wstrzyknięcia, a sondę dodatnio naładowaną wokół oka, pyska lub brody. W tym przypadku orientacja elektrody wynosi od 25 do 40 stopni względem linii środkowej. Ten obraz przedstawia grzbietowo-boczną korę po elektroporacji fluorescencyjnych plazmidów reporterowych wykazujących ekspresję znakowanego błonowo białka clover w kolorze zielonym oraz tag bfp.Dwa białka jądrowe przedstawione tutaj w czerwonym pseudokolorze. Rozległe dendryty znajdują się w tym korowym neuronie pośrednim około dwa miesiące po elektroporacji. Komórki dodatnie pod kątem EGFP są dodatnie pod kątem BRDU, co wskazuje, że proliferowały one podczas procedury elektroporacji.Podczas stosowania tej techniki ważne jest, aby skupić się na precyzyjnym celowaniu w powierzchnię skórki, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod nią kory i/lub naczyń krwionośnych.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektroporacja powierzchni płata noworodków

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidowego DNA do komórek neuronalnych móżdżku mysich zarodków za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia funkcji genów in vivo w prawidłowym rozwoju mózgu oraz zmian w ekspresji genów komórek neuronalnych podczas progresji guza.

Dostarczanie genów oparte na elektroporacji in utero: technika wstrzykiwania plazmidowego DNA do embrionalnych komórek móżdżku mysich zarodków

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek...

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Poznaj metodę elektroporacji powierzchni pialu noworodków do etykietowania i manipulacji genetycznej progenitorów nerwowych. Technika ta umożliwia badanie proliferacji, migracji i różnicowania komórek w układzie nerwowym.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Przeglądaj więcej filmów