Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ogólnym celem tej procedury jest genetyczne znakowanie i manipulowanie progenitorami neuronalnymi na powierzchni skórki. Osiąga się to poprzez uprzednie włożenie szklanej pipety wypełnionej roztworem DNA osocza do obszaru powierzchni peelingu. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie DNA do przestrzeni oponowej tak, aby pokrywało je powierzchnia peelingu.

Następnie elektrody są zorientowane tak, aby odpowiednio dostarczyć prąd do powierzchni odklejania. Ostatnim krokiem jest elektroporacja DNA do progenitorów na powierzchni odklejania za pomocą prądu. Ostatecznie metodę tę można połączyć z innymi technikami, aby pokazać historię naturalną i molekularne determinanty powierzchni złuszczania, proliferacji neuronalnych progenitorów, migracji i/lub różnicowania.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja wirusa, jest to, że elektroporacja jest bezpieczniejsza, bardziej elastyczna i nie wymaga tworzenia cząsteczek wirusa ani pakowania. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, takie jak jaki jest wkład tych progenitorów powierzchni peelingu w tkanki, histo genezę i funkcję obwodów nerwowych. Na początek użyj ściągacza do pipet, aby uformować pipety ze szklanych rurek kapilarnych Po wyciągnięciu odetnij końcówkę ostrymi nożyczkami.

Następnie przygotuj 1% szybki zielony roztwór podstawowy, używając przefiltrowanej wody wolnej od nukleaz. Po rozcieńczeniu wolnego od endotoksyn buforu EDTA DNA w osoczu, połącz go w odpowiednich proporcjach z 1% szybkim zielonym roztworem. Za pomocą standardowej pipety umieść żądaną ilość mieszanki plazmidowej do wstrzyknięcia na kawałku filmu wosku parafinowego w celach informacyjnych.

Następnie za pomocą mikroiniektora ostrożnie włóż zmontowaną szklaną pipetę do probówki zawierającej mieszaninę plazmidów. Unikaj dotykania końcówki krawędziami rurki, aby zapobiec pęknięciu. Zassać roztwór do pipety, powoli przykręcając pokrętło transferu.

Po załadowaniu wystarczającej objętości należy wybierać do przodu, aż ciśnienie powróci do pozycji neutralnej zera. Hektor Pascals. Następnie umieść końcówkę obok iniekcji referencyjnej i użyj pedału nożnego z mikrowtryskiwacza, aby wysunąć jedną objętość.

Regulować ciśnienie, aż ilość zrówna się z poprzednio odpipetowaną objętością referencyjną. Po skalibrowaniu objętości wstrzyknięcia należy pobrać zwierzęta do wstrzyknięcia plazmidu. Gdy głębokość znieczulenia zostanie potwierdzona, przytrzymaj szczeniaka za pomocą kciuka i palca wskazującego mniej dominującej ręki.

Użyj dominującej ręki, aby wycelować w pożądany obszar, półkule korowe i inne powierzchowne struktury, takie jak górne wzgórki, powinny być łatwo widoczne. Po zidentyfikowaniu właściwej lokalizacji włóż pipetę obok skóry i czaszki. Uważaj, aby uniknąć tętnic mózgowych.

Aby celować w powierzchnię odklejania, natychmiast przerwij przesuwanie pipety Gdy tylko czaszka zostanie przebita końcówką pipety we właściwej pozycji, wstrzyknij roztwór plazmidu za pomocą pedału nożnego mikrowstrzykiwacza Po wstrzyknięciu ostrożnie wyjmij pipetę. Zapobiegaj wysychaniu i zatykaniu się końcówki między wstrzyknięciami, umieszczając ją w kropelkach testowych znajdujących się na folii parafinowej. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie szczenięta zostaną wstrzyknięte, aby zwiększyć przewodność i zapobiec poparzeniu skóry.

Przykryj trzy milimetrowe platynowe pęsety żelem do elektroporacji. Następnie dostosuj ustawienia elektro do wstrzykiwań do kory mózgowej. Umieść ujemnie naładowaną sondę nad wstrzykniętym obszarem, a dodatnio naładowaną sondę wokół obszaru przeciwległego poniżej oka.

Orientacja elektrody powinna być ustawiona pod kątem od 45 do 60 stopni w stosunku do linii środkowej. Użyj pedału nożnego, aby wyzwolić prąd i przytrzymaj pęsetę TRO na miejscu przez trzy do pięciu impulsów. W zależności od wieku i wagi szczeniaka, impulsy powinny kierować DNA do leżących poniżej komórek powierzchni skórki.

Biegun ujemny można przesunąć po obszarze wtrysku. Pomiędzy impulsami lub można zastosować większą elektrodę, aby zwiększyć obszar elektryczny natychmiast po elektroporacji, ostrożnie oczyść żel z szczeniąt i umieść je pod lampą grzewczą na około pięć minut. Szczenięta ostro tracą swój naturalny czerwonawy mały palec w ciągu kilku minut po elektroporacji z powodu sinicy.

Obserwuj młode pod kątem odzyskania naturalnego koloru i zainicjowania normalnego ruchu przed powrotem do klatek lub wstrzyknięciami do górnej colusa. Zlokalizuj obszar docelowy tuż za i bocznie od Lambdy i mniej więcej na linii środkowej, wykonaj te same kroki, które właśnie pokazano. Przy udanych wstrzyknięciach mieszanka plazmidowa w naturalny sposób wypełnia kontury okrężnicy górnej.

Podczas pracy elektrycznej po wstrzyknięciach górnej części jelita grubego umieść ujemnie naładowaną sondę elektrody na wstrzykiwanym obszarze, a dodatnio naładowaną sondę wokół oka, pyska lub podbródka. W tym przypadku orientacja elektrody jest ustawiona pod kątem od 25 do 40 stopni w stosunku do linii środkowej. Ten obraz przedstawia grzbietową korę boczną po elektroporacji fluorescencyjnych plazmidów reporterowych wyrażających błonę oznaczoną koniczyną na zielono i oznaczoną bfp.

Dwa białka jądrowe pokazane tutaj w czerwonym pseudokolorze. Rozległe dendryty znajdują się w tym korowym neuronze międzyneuronowym około dwa miesiące po elektroporacji. Ogniwa EGFP dodatnie są BRDU-dodatnie, co oznacza, że proliferowały podczas procedury elektroporacji.

Próbując tej techniki, ważne jest, aby skupić się na właściwym ukierunkowaniu powierzchni peelingu, aby uniknąć zakłócenia leżącej poniżej kory i/lub układu krążenia.