Name: Nanopodia - cienkie, delikatne wypustki błonowe odgrywające rolę w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji nanopodiów w komórkach endotelialnych i nowotworowych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego TM4SF1. Technika umożliwia badanie ruchu komórek i interakcji międzykomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Haroldowi Dvoraka za pomocne dyskusje, w tym sugestię spróbowania utrwalenia w temperaturze 37 °C PFA. Prace te były wspierane przez grant NIH P01 CA92644 oraz przez umowę z National Foundation for Cancer Research.

1. Hodowla komórkowa na dysku szklanym pokrytym kolagenem
<ol>
	<li>Umieść szklane krążki (o średnicy 12 mm) w szklanym słoiku (4 uncje) i przeprowadź autoklaw w celu sterylizacji krążków.</li>
	<li>Umieść 25 ml 70% etanolu w 50 ml probówce Falcon i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowych. Roztwór ten można używać wielokrotnie, aż poziom roztworu spadnie do 20 ml.</li>
	<li>Umieść ostre kleszcze z bardzo drobnym czubkiem w 70% etanolu na 5 minut przed użyciem go do obsługi szklanego dysku.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij kleszczyki z rurki i zamknij nakrętkę, a następnie delikatnie umieść kleszczyki nasączone etanolem na górze probówki, aby wyschły na powietrzu przez 2 minuty. Nie pozwól, aby końcówka kleszczy dotykała czegokolwiek w kapturze.</li>
	<li>Użyj sterylnych kleszczy, aby chwycić jeden sterylny szklany krążek ze szklanego słoika i umieść go w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Powtarzaj, aż żądana liczba studzienek zostanie wypełniona dyskami.</li>
	<li>Umieścić 500 μl roztworu kolagenu bydlęcego (50 ng/ml) do każdej studzienki zawierającej szklany krążek i umieścić go w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 30 minut. Nie ma nic złego w dłuższej inkubacji.</li>
	<li>Zbierz HUVEC (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej) lub PC3 (komórki nowotworowe prostaty), które były już hodowane na 150-milimetrowej płytce do hodowli komórkowej poprzez trypsynizację i zablokuj aktywność trypsyny za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej. Zebrać komórki do probówki Falcon o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i upewnij się, że żywotność jest większa niż 90%.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Użyj pożywki hodowlanej, aby rozcieńczyć komórki do 105 komórek/ml. Umieść komórki na lodzie.</li>
	<li>Odessać kolagen do kaptura hodowli komórkowej i delikatnie umieścić 500 μl zawiesiny komórkowej w każdym dołku, w którym szklane krążki zostały wstępnie pokryte kolagenem. 5 x 104 komórki / studzienkę w 24-dołkowej płytce da 60% konfluencję dla HUVEC i 30% konfluencję dla komórek PC3. Uwaga: dodaj więcej zawiesiny komórek, aby uzyskać większą gęstość komórek.</li>
	<li>Hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę, 2 godziny, 4 godziny, 6 godzin lub 24 godziny, aby śledzić aktywność nanopodiów i pasaż komórkowy. Zazwyczaj komórki przyczepiają się do szklanego dysku w ciągu pierwszych 30 minut, a następnie zaczynają polaryzować się i migrować w ciągu pierwszej godziny, a w ciągu następnych godzin przeprowadzają interakcje międzykomórkowe i podział komórek.</li>
</ol>
2. Utrwalenie komórek
<ol>
	<li>Każda studzienka będzie potrzebować 500 μl 4% PFA (paraformaldehydu) do utrwalenia komórek. Można stosować zarówno komercyjnie wyprodukowane, jak i świeżo wyprodukowane 4% PFA. Oblicz potrzebną ilość PFA na podstawie liczby przygotowanych studzienek i umieść PFA w 15-mililitrowej probówce Falcon. UWAGA: paraformaldehyd jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy.</li>
	<li>Umieść rurkę falcon w styropianowym stojaku, który był już na miejscu w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Pozostawić probówkę w inkubatorze na 30 minut, aby rozgrzać PFA do 37 °C.</li>
	<li>Umieść poduszkę grzewczą w okapie hodowlanym i włącz go.</li>
	<li>Wyjmij 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej i wstępnie podgrzany PFA z inkubatora i umieść je na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Jedną ręką zasysaj pożywkę ze studzienki, a drugą ręką delikatnie wsuń 500 μl PFA do studzienki przez krawędź studzienki. Aby ułatwić aspirację, przechyl płytkę hodowlaną pod kątem około 45°, opierając ją o styropianowy stojak, tak aby była stabilna pod tym kątem. Ułatwi to aspirację i dodanie roztworu PFA do studzienki bez naruszania komórek w hodowli. Jest to najważniejszy krok do zachowania pierwotnej struktury komórkowej aktywności komórek.</li>
	<li>Powtarzaj proces, aż wszystkie studzienki ze szklanym dyskiem otrzymają PFA. Uwaga: wszystkie kroki, które wymagają zmiany istniejącego wcześniej roztworu ze studni, będą miały te same procedury aspiracji.</li>
	<li>Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Weź płytkę z powrotem do okapu hodowlanego i przechyl ją na styropian zgodnie z opisem w kroku 2.5. Jedną ręką delikatnie przenieś PFA ze studni do probówki zbiorczej; drugą ręką natychmiast po tym umieścić w studzience co najmniej 500 μl PBS o temperaturze pokojowej. Po umyciu wszystkich studzienek należy powrócić i powtórzyć płukanie PBS jeszcze raz w każdej studzience. Opróżnij zebrany PFA do pojemnika na odpady niebezpieczne.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący ICC, dodając 2% płodową surowicę bydlęcą do PBS. Jako środek konserwujący dodaje się 0,04% azydku sodu (rozcieńczonego z 20% roztworu podstawowego). UWAGA: azydek sodu jest związkiem toksycznym. Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez długi czas bez zanieczyszczenia bakteryjnego.</li>
	<li>Trzymając płytkę hodowlaną nadal nachyloną w stosunku do podstawy, ponownie przeprowadź przez każdą studzienkę, zasysając w celu usunięcia PBS, a natychmiast po tym dodając 500 μl buforu blokującego ICC. Komórki są teraz gotowe do barwienia immunofluorescencyjnego. W razie potrzeby utrwalone komórki można przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C przez tydzień bez znacznej utraty białka TM4SF1.</li>
</ol>
3. TM4SF1 Barwienie immunofluorescencyjne nanopodiów
<ol>
	<li>W każdym dołku zastąp 500 μl buforu blokującego ICC nowym buforem blokującym zawierającym 0,01% Triton X-100 i pozostaw go w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Nie używaj więcej niż 0,03% Triton X-100, ponieważ usunie on TM4SF1 z błon komórkowych. Umyte komórki PBS z kroku 2.10 można bezpośrednio przenieść do bufora blokującego zawierającego Triton, jeśli barwienie jest gotowe do natychmiastowego rozpoczęcia.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-TM4SF1 (lub anty-CD9) do 0,5 μg/ml w buforze blokującym ICC.</li>
	<li>Z każdej studzienki należy usunąć bufor ICC/0,01% Triton i zastąpić go 300 μl roztworu przeciwciała anty-TM4SF1. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę nie mniej niż 500 μl PBS. Powtórz 3 razy; Za każdym razem należy przeznaczyć co najmniej 5 minut czasu inkubacji.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowe przeciwciało i roztwór falloidyny w buforze blokującym ICC, używając 1000-krotnego rozcieńczenia drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego znakowanego Alexa 488 (2 μg / ml stężenie końcowe) i 1000-krotnego rozcieńczenia falloidyny (50 ng / ml stężenie końcowe).</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 300 μl drugorzędowego roztworu przeciwciała i falloidyny do każdej studzienki i inkubować przez 2 godziny lub pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórzyć etapy mycia PBS z co najmniej 5-minutową inkubacją na pranie. W ostatnim praniu pozostaw każdą studzienkę w PBS na 1 godzinę.</li>
	<li>Upuść pojedynczą kroplę (~10 μl) środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko.</li>
	<li>Zegnij końcówkę igły strzykawkowej 19 G 1 1/2 cala pod kątem 90°, delikatnie naciskając na twardą powierzchnię. Jedną ręką przytrzymaj zgiętą igłę i delikatnie podnieś szklany krążek ze studni, a drugą ręką chwyć krążek za pomocą ostrych kleszczy.</li>
	<li>Odwróć szklany dysk stroną do dołu, pozwalając, aby strona ogniwa zetknęła się z nośnikiem montażowym na szklanym szkiełku. Delikatnie umieść szklany krążek i pozostaw go do wyschnięcia na noc w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przystąp do obrazowania nanopodiów barwionych immunofluorescencją lub przechowuj szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze -20 °C. Slajdy będą widoczne przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li>
<li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4SF1%3A+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li>
<li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effects+of+L6%2C+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li>
<li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imag%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li>
<li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li>
<li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF%2FVEGF%3A+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li>
<li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Uchu+Seibutsu+Kagaku%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li>
<li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li>
<li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA%2C+cell+surface+proteins%2C+and+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li>
<li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Fisiologia%22%5BJournal%5D)">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li>
<li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+%28SECM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li>
<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Nanopodia to cienkie kanały błony komórkowej, które mocno przylegają do macierzy za pośrednictwem TMED i mogą rozciągać się na ponad 100 μm od spolaryzowanej komórki ruchomej, aby wyczuwać środowisko i pośredniczyć w interakcjach międzykomórkowych2,3. Nanopodia przylegają do matrycy tak mocno, że pozostałości pozostają w tyle, gdy komórka się oddala (ryc. 1 i 2). Nanopodia pozwalają nam zatem badać, w jaki sposób komórki wyczuwają otoczenie i określają ścieżkę ruchu komórek or...

Podczas polaryzacji dla ruchu, komórki zwierzęce rozciągają różne dynamiczne, błonowe wypukłości ze swoich powierzchni, w tym filopodia, lamellipodia, włókna retrakcyjne i falbany1. Niedawno do tej listy dodano nanopodia, nowo rozpoznany rodzaj cienkiej (100-300 μm średnicy), wydłużonej (do 50-100 μm długości) projekcji błonowej, która zapewnia kanały błonowe do przedłużania struktur F-aktyny, takich jak filopodia i włókno retrakcji, i które barwią się dodatnio TM4SF1 (Transmembrane-4-L-six-family-1) w hodowanych komórkach śródbłonka i nowotworowych2,3.
TM4SF1 to białko o topologii podobnej do tetraspaniny, które pierwotnie było znane jako antygen komórek nowotworowych4 przed odkryciem, że cząsteczka ta jest biomarkerem komórek śródbłonka, który odgrywa istotną rolę w proliferacji i migracji komórek śródbłonka2,3. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że TM4SF1 jest zlokalizowany w pęcherzykach okołojądrowych i błonie plazmatycznej i jest wzbogacony w TM4SF1 ewzbogacone mikroomainy(TMED). TMED zakotwicza nanopodia w matrycy i występuje w regularnie rozmieszczonym wzorze pasmowym o długości 1-3 TMED/μm nanopodiów. Nanopodia zazwyczaj rozciągają się od przodu komórki i tylnej części komórki podczas polaryzacji komórki w celu ruchu. Ze względu na mocno przylegający charakter TMED, nanopodia nie są w stanie cofnąć się z powrotem do komórki, gdy się oddala; Porzucone pozostałości nanopodiów śledzą w ten sposób ścieżkę ruchu komórek. Nanopodia zapewniają kanały błonowe do wydłużania i cofania F-aktyny i są miejscami interakcji międzykomórkowych i komunikacji2,3. Cechy te oznaczają, że nanopodia dają unikalną możliwość badania mechanizmów leżących u podstaw składania F-aktyny podczas polaryzacji komórkowej, komórkowego wyczuwania środowiska, określania ścieżki i kierunku ruchu komórek oraz interakcji i komunikacji międzykomórkowej.
Ze względu na wysoce hydrofobową naturę TMED oraz cienką i delikatną błoniastą naturę nanopodiów, należy zachować szczególną ostrożność w celu zachowania TMED i nanopodiów. Zniszczenie nanopodiów i usunięcie TMED za pomocą powszechnych metod laboratoryjnych jest możliwym powodem, dla którego od czasu jego pierwszego odkrycia w 1986 r.ukazały się tylko sześćdziesiąt trzy publikacje na temat TM4SF1 i całkowity brak wiedzy na temat wzbogacania TM4SF1 w mikrodomenach 100-300 μm na powierzchni komórki, aż do doniesienia o TM4SF1 w komórkach śródbłonka w 2009 r.2.
Konwencjonalne metody barwienia immunologicznego często używają rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, metanol lub aceton, do utrwalania komórek i używają 0,1% lub wyższego stężenia Triton X-100 do przenikania komórek5. W opisanych tutaj badaniach wprowadzono trzy główne zmiany w konwencjonalnej metodzie ujawniania TMED i nanopodiów: (i) użyj 37 °C 4% PFA i utrwal komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, (ii) zastosuj delikatne płukanie PBS w temperaturze pokojowej oraz (iii) użyj mniej niż 0,03% Triton X-100 tylko na krótko, aby przeniknąć komórki przed dodaniem przeciwciała pierwotnego, ponieważ Triton X-100 wyższy niż 0,03% wyekstrahuje TM4SF1.
Wszystkie tetraspaniny tworzą mikrodomeny na błonie komórkowej6, a niektóre kolokalizują się z TMED w komórkach śródbłonka i nowotworu2,3. Ponieważ tetraspaniny, takie jak CD9, CD81 i CD151, są powszechnie eksprymowane, opisany tutaj protokół barwienia można rozszerzyć na wiele różnych typów komórek, w których brakuje TM4SF1 do badań funkcji nanopodiów.

<table><tbody><tr><td>Szklane dyski</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Szklany słoik o średnicy 12 mm</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certyfikowane czyste, przezroczyste szklane słoiki o prostych ściankach, 4 uncje</td></tr><tr><td>szkła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest Premium ze zwykłego szkła</td></tr><tr><td>50 ml Tubka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Stożkowa probówka wirówkowa o wysokiej przejrzystości 50 ml, ocena 16 000 RCF. Sterylny.</td></tr><tr><td>Probówka Falcon 15 ml ze styropianowym stojakiem</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml Probówki wirówkowe PP</td></tr><tr><td>Ostre kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Preparujące bardzo cienkie kleszcze odłamkowe</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>150 mm Płytka do hodowli komórkowych</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm Płytka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>19 G 1 &frac12; Igła strzykawkowa</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &frac12;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon's Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, Wysokie stężenie, ogon szczura, 100 mg</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0,25% Trypsyna-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM o wysokiej glukozie (1x), płynny, z L-glutaminą, bez pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Roztwór, pH 7,4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyd)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% w PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml i EGM-2 SingleQuot Kit Suplement & Czynniki wzrostu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Rozpuszczony w wodzie. 4% roztwór podstawowy i stężenie robocze wynosi 0,4%.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie TM4SF1&nbsp;</td><td>Epitop Millipore</td><td>MAB3127</td><td>znajduje się w domenie zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD9&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitop znajduje się w domenie zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anty-mysie 2nd przeciwciało</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Sprzężona z rodaminą Phalloidyna</td></tr><tr><td>Anti-fade mounting media&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Odczynnik Antifade z DAPI</td></tr><tr><td>70% etanolu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>17,5 ml etanolu (200 proof) 7,5 ml wody podwójnie dejonizowanej</td></tr><tr><td>10x PBS (zrobić 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml 10x PBS 180 ml wody podwójnie dejonizowanej</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (zrobić 20 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100 16 ml podwójnie dejonizowanej wody</td></tr><tr><td>4% NaN3 (zrobić 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g NaN3 25 ml podwójnie dejonizowanej</td></tr><tr><td>wody 50 ng/ml Roztwór kolagenu bydlęcego w PBS (zrobić 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Roztwór podstawowy 50 &mu; g/ml (50 ml) 830 &m; l kolagenu I (3 mg) 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS 2% FBS (dodać 1 ml) 0,04% NaN3 (dodać 100 &mu; l 4% NaN3)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (zrobić 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml ICC Blocking Buffer 25 &mu; l 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli komórkowych</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Seria 60) Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &stopnie; C, 5% CO2 Inkubator do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2 Inkubator z płaszczem wodnym</td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza&nbsp;</td><td>K& H Produkcja</td><td>1020</td><td>K& H Podgrzewana podkładka hodowli Lectro z bezpłatną osłoną z polaru (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Hemocytometr wirówkowy</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr></tbody></table>

nanopodia - cienkie, delikatne wypustki błonowe odgrywające rolę w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Przylegające komórki w hodowli utrzymują stan spolaryzowany, aby wspierać ruch i interakcje międzykomórkowe. Nanopodia to cienkie, wydłużone, w dużej mierze F-aktynowo-ujemne wypustki błonowe w komórkach śródbłonka i raka, które można uwidocznić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego TM4SF1 (Transmembrane-4-L-six-family-1). Klastry TM4SF1 o średnicy 100-300 μm TMED (TM4SF1 enriched microdomains) zawierające od 3 do nawet 14 pojedynczych cząsteczek TM4SF1. TMED są rozmieszczone z przerwami wzdłuż nanopodiów w regularnych odstępach od 1 do 3 TMED na μm i mocno zakotwiczają nanopodia w matrycy. Dzięki temu nanopodia mogą rozciągać się na więcej niż 100 μm od przodu lub tyłu spolaryzowanych komórek śródbłonka lub guza i powoduje pozostawienie resztek błony na macierzy, gdy komórka się oddala. TMED i nanopodia zostały pominięte ze względu na ich ekstremalną kruchość i wrażliwość na temperaturę. Rutynowe mycie i utrwalanie zaburza strukturę. Nanopodia są konserwowane przez bezpośrednie utrwalenie w paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 37 °C, a następnie krótką ekspozycję na 0,01% Triton X-100 przed barwieniem. Nanopodia otwierają nowe perspektywy w biologii komórki: obiecują zmienić nasze rozumienie tego, w jaki sposób komórki wyczuwają otoczenie, wykrywają i identyfikują inne komórki na odległość, inicjują interakcje międzykomórkowe w bliskim kontakcie oraz mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w ruch, proliferację i komunikację między komórkami. Metody, które zostały opracowane do badania nanopodiów pochodzących z TM4SF1, mogą być przydatne do badań nanopodiów, które tworzą się w innych typach komórek za pośrednictwem klasycznych tetraspanin, w szczególności wszechobecnych CD9, CD81 i CD151 ulegających ekspresji.

Dla kroku 1:
Jeśli komórki (takie jak HUVEC i PC3 wykorzystane w niniejszym badaniu) są zdolne do prawidłowego wzrostu, przyłączą się one do powleczonego kolagenem dysku w ciągu 30 min od ich wysiania, wkrótce potem ulegną polaryzacji i staną się ruchliwe, a następnie wysuną nanopodia przed kierunkiem swojego przemieszczania się. Rysunek 1A oraz 1B przedstawiają odpowiednio spolaryzowaną i proliferującą komórkę HUVEC. Rysunek 2A przedstawia spola...

Nanopodia to cienkie, ale delikatne kanały błonowe, które rozciągają się do 100 μm od przodu komórki lub z tyłu i wyczuwają środowisko komórkowe. Do obserwacji tych struktur komórkowych wymagane jest bezpośrednie utrwalenie w temperaturze 37 °C, delikatne mycie i unikanie rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, metanol lub aceton oraz wyższych stężeń Triton X-100.

Nanopodia - cienkie, delikatne wypustki błonowe odgrywające rolę w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja nano podii poprzez barwienie immunofluorescencyjne w hodowanych komórkach. In vitro. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę interesujących komórek na szklanych dyskach pokrytych kolagenem.W drugim etapie komórki są mocowane do dysku za pomocą ciepłego PFA, następnie komórki są myte, a następnie inkubowane w buforze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. W ostatnim etapie komórki są barwione przeciwciałem przeciwko TM cztery, SF i umieszczane na szkiełku podstawowym. Ostatecznie obecność rozszerzeń nano podia w ruchomych komórkach proliferujących lub oddziałujących można uwidocznić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii i diagnostyki nowotworów u ludzi, ponieważ ruch proliferacji komórek endotowych i komórek nowotworowych oraz interakcje międzykomórkowe są kluczowymi procesami zaangażowanymi w angiogenezę i wzrost komórek nowotworowych. Demonstracja procedury będzie polegała na dwóch chudych, postdoc z laboratorium Zacznij od autoklawowania 12-milimetrowych szklanych krążków w szklanym słoiku o pojemności czterech uncji, podczas gdy dyski są sterylizowane. Umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów zawierającą 25 mililitrów 70% etanolu w okapie do hodowli komórkowych.Umieść ostre kleszcze z bardzo drobnym czubkiem w etanolu na pięć minut, a następnie ostrożnie zdejmij kleszcze i zakryj rurkę, umieszczając kleszcze na rurce do wyschnięcia na powietrzu przez dwie minuty. Gdy kleszcze wyschną, umieść jeden sterylny szklany krążek na studzienkę w jednym z każdego z pożądanych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowych. Następnie przykryj każdy krążek 500 mikrolitrami roztworu kolagenu bydlęcego i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut.Podczas gdy dyski inkubują, kropli i obserwuj interesujące komórki, zatrzymując reakcję z kompletnymi pożywkami hodowlanymi. Gdy komórki się odłączą, zbierz pływające komórki w 15-mililitrowej probówce Falcon, a następnie policz je po potwierdzeniu, że ich żywotność jest większa niż 90%Osadzaj komórki przez 10 minut w temperaturze 200 G i czterech stopniach Celsjusza. Usuń supernatant, a następnie rozcieńcz komórki do ilości od 10 do 5 komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórkowych i umieść komórki na lodzie.Teraz odessaj roztwór kolagenu z każdej studzienki w kapturze do hodowli komórkowych, a następnie delikatnie dozuj 500 mikrolitrów komórek na każdą hodowlę dyskową pokrytą kolagenem. Komórki przez odpowiednią ilość czasu, aby śledzić aktywność nano podia i przejście komórki. Zazwyczaj komórki przyczepiają się do szklanego dysku w ciągu pierwszych 30 minut, zaczynają polaryzować się i migrować w ciągu pierwszej godziny, a następnie przeprowadzają interakcje międzykomórkowe i podział komórek w ciągu następnych godzin, aby najpierw utrwalić komórki wystarczająco ciepłe PFA dla wszystkich dysków w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie umieść poduszkę grzewczą w okapie hodowlanym. Włącz go, a następnie umieść wstępnie rozgrzany PFA na poduszce grzewczej. Dodanie PFA do krążków jest najważniejszym krokiem w celu zachowania oryginalnej struktury komórkowej czynności komórek, aby ułatwić usunięcie pożywki hodowlanej i dodanie PFA bez zakłócania pracy komórek w hodowli, należy przesunąć płytkę pod kątem około 45 stopni, opierając ją o styropianowy stojak, aby była stabilna pod kątem Jedną ręką.Następnie odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie natychmiast drugą ręką wsunąć 500 mikrolitrów PFA do każdej studzienki przez krawędź studzienki i inkubować krążki przez kolejne pięć minut. Następnie, usuń PFA, jak właśnie pokazano dla pożywki do hodowli komórkowych, dozując zużyty PFA do probówki zbiorczej jedną ręką i natychmiast zastępując PFA 500 mikrolitrami PBS o temperaturze pokojowej drugą po dwukrotnym umyciu studzienek PBS, usuń końcowe płukanie PBS, jak właśnie pokazano, i dodaj 500 mikrolitrów buforu blokującego immunochemię do każdego dysku. Aby uwidocznić nano podia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, najpierw zastąp bufor blokujący chemię immunocytochemii w każdej studzience buforem blokującym 0,01% tritton X 100 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie zastąp bufor blokujący trytton 300 mikrolitrami świeżo rozcieńczonego roztworu przeciwciała anty TM four SF one przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj każdą tarczę trzy razy za pomocą PBS, jak pokazano, pozostawiając PBS na dyskach na pięć minut podczas każdego prania po ostatnim praniu. Inkubować każdą studzienkę z 300 mikrolitrami świeżo rozcieńczonego przeciwciała wtórnego i roztworu Phin i inkubować krążki przez kolejne dwie godziny w temperaturze pokojowej.Teraz ponownie umyj krążki trzy razy, pozostawiając ostatnie płukanie PBS w studzienkach na godzinę. Następnie za pomocą pojedynczego 10 mikrolitrowego upuszczenia pożywki montażowej Antify na jedno szklane szkiełko dla każdej tarczy. Następnie delikatnie zegnij końcówkę igły strzykawkowej o rozmiarze 19, półtora cala pod kątem 90 stopni na twardej powierzchni.Następnie, trzymając igłę w jednej ręce, delikatnie podnieś szklany krążek jeden po drugim, używając ostrych kleszczy, aby chwycić krążek drugą ręką. Umieść każdy szklany krążek stroną zadrukowaną do dołu na nośniku montażowym na szkiełkach, a następnie ostrożnie umieść szkiełka w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej do wyschnięcia przez noc. Wybarwione nano podia można następnie zobrazować lub przechowywać w pudełku na slajdy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Normalnie rosnące komórki przyczepiają się do dysków pokrytych kolagenem w ciągu 30 minut po usadzeniu, polaryzują się i stają się mobilne wkrótce po rozciągnięciu nano podia przed ich ścieżką ruchu. Jak pokazano na tych obrazach, izolowane pojedyncze H-U-V-E-C na ogół będą wykazywać wyraźnie spolaryzowaną morfologię z projekcjami aktyny f na obrzeżach komórki osadzonymi wewnątrz nano podia PC trzy komórki będą wykazywać spolaryzowaną morfologię z ich nano podiami ujawniającymi ścieżkę ruchu trzech komórek PC. Jeśli komórki są w stanie podziału komórkowego, jak widać tutaj w dzielącym się H-U-V-E-C, nano podia mocno przylegają do matrycy przez TM E i pozwalają aktynie F wysuwać się lub chować wewnątrz nano podia.Interakcje międzykomórkowe prowadzące do tworzenia połączeń komórkowych są również powszechnie obserwowane poprzez nieoptymalne temperatury nano podia, jak pokazano w tych przykładach, użycie wiązania PFA w czterech stopniach Celsjusza i mycie PBS na zimno zakłóci i zniszczy strukturę nano podia w spolaryzowanych komórkach. W zimnych komórkach proliferujących PFA i zimnych PBS będzie brakowało podia, a zatem zaobserwuje się retrakcję f aktyny w obrębie nano podia. A przerwy w połączeniach międzykomórkowych będą sztucznie wytwarzane, ponieważ nano podia to cienkie, długie wypustki błonowe, które przyczepiają się do macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez zespół.Intensywność zespołu prawdopodobnie będzie musiała zostać zwiększona za pomocą funkcji jasności i kontrastu w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, aby ujawnić ścieżkę ruchu komórek przez pozostałości nano podia. Jak to zostało zrobione we wstawce tego obrazu, H-U-V-E-C, które były hodowane przez sześć godzin po posiewie z płynnością 60% co na szklanym krążku pokrytym kolagenem, a następnie utrwalone w 37 stopniach Celsjusza, 4% PFA, jak właśnie pokazano, pokazano na tym obrazie. Nano podia zostały ujawnione przeciwciałem anty CD 9, a aktyna F została wybarwiona Phin, co pokazuje, że CD 9 również lokalizuje się w nano podia.Postępowanie zgodnie z procedurą. Inne metody, takie jak cytometria przepływowa w zachodniej krwi, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, w jaki sposób niektóre zabiegi wpływają na poziomy ekspresji TM cztery SF one, a tym samym wpływają na proliferację ruchów komórek i interakcje wewnątrzkomórkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić podtrzymywanie odporności w celu zbadania roli nano podii w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych.

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nanopodia - Cienkie, kruchą struktury błonowe z rolami w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Ten manuskrypt wykorzystuje oparty na Fidżi pakiet oprogramowania open-source VirusMapper do zastosowania analizy pojedynczej cząstki do obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości w celu wygenerowania precyzyjnych modeli struktury w nanoskali.

Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę wizualizacji nanopodiów w komórkach endotelialnych i nowotworowych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego TM4SF1. Technika umożliwia badanie ruchu komórek i interakcji międzykomórkowych.

Nanopodia - cienkie, delikatne wypustki błonowe odgrywające rolę w ruchu komórek i interakcjach międzykomórkowych

Przeglądaj więcej filmów