Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych
26 lipca 2014
Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.
Ogólnym celem poniższego filmu jest przedstawienie metody rejestracji obrazów w histologii trójwymiarowej oraz rekonstrukcji objętościowej w celu zbadania zmian w makrostrukturze komórkowej gruczołu piersiowego. W tym celu gruczoły piersiowe są wycinane z myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu 7, IGF BP seven, trzy dni po rozpoczęciu laktacji. Następnie gruczoły są przetwarzane i zatapiane w blokach parafiny w celu wykonania skrawków.
Następnie rejestrowane są obrazy powierzchni optycznej bloków tkankowych, a następnie bloki tkankowe są sekcjonowane. Wykonywane są obrazy przekrojów, a przy użyciu specjalistycznego oprogramowania każdy przekrój jest dopasowywany do odpowiadającego mu obrazu powierzchni bloku w celu rekonstrukcji objętości histologicznej gruczołu mlekowego. Wynikowe dane podkreślają różnice w wielkości gruczołów u mutantów i osobników typu dzikiego.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trójwymiarowa konfokalna mikroskopia dwukrotna, jest dostarczanie informacji z znacznie większego zakresu przestrzennego. Metoda ta może być również wykorzystana do badania i walidacji nowych technik i algorytmów w wolumetrycznym obrazowaniu medycznym i terapiach, a także do tworzenia wysokorozdzielczych analiz 3D różnych organów. Zrekonstruowana objętość histologiczna stanowi wiarygodną reprezentację preparatu z procesu, bez propagowanego błędu rejestracji.
Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że myszy z nokautem genu IGF P seven mają mniejsze mioty i nie są w stanie utrzymać wielu licznych miotów, dlatego postanowiliśmy zbadać strukturę ich gruczołów mlekowych. Po zatopieniu tkanki w parafinie, należy użyć mikrotomu obrotowego do przycięcia bloku, aż do usunięcia nadmiaru parafiny. Następnie, za pomocą pionowej frezarki, należy wywiercić otwory o średnicy 1 mm w co najmniej dwóch narożnikach bloku parafiny, prostopadle do kasety, a następnie zamocować blok tkankowy w mikrotomie obrotowym.
Aby skonfigurować system obrazowania powierzchni bloku przed mikrotomem, należy umieścić aparat z teleobiektywem pod niewielkim kątem względem powierzchni bloku tkankowego. Aparat powinien być podłączony do komputera znajdującego się przed mikrotomem. Następnie należy ustawić źródło światła przed blokiem w taki sposób, aby aparat rejestrował odbicie światła od bloku.
Dostosuj kąt kamery tak, aby tkanka na powierzchni bloku była wyraźnie odróżnialna od otaczającej ją parafiny. Wykonaj jedno zdjęcie powierzchni bloku w świetle widzialnym. Następnie, używając mikrotomu, wytnij taśmy czterech skrawków o grubości pięciu mikronów.
Przenieś wstążki do kąpieli w zimnej wodzie, rozdziel poszczególne sekcje wstążki, a następnie nabierz drugą i czwartą sekcję z zimnej wody na szkiełko przedmiotowe. Przenieś je do kąpieli w ciepłej wodzie w celu ich wyprostowania. Wybór drugiej i czwartej sekcji zapewnia przerwę o szerokości 5 µm między sekcjami.
Po rozprostowaniu zmarszczek ponownie zamocuj skrawki na szkiełkach przedmiotowych mikroskopu metodą nabierania. Jak wcześniej, należy zauważyć, że cięcie, montaż i rozprostowywanie zmarszczek skrawków mogą powodować pewne zniekształcenia, takie jak rozdarcia, fałdy, kurczenie się i rozszerzanie. Artefakty te utrudniają rejestrację skrawków histologicznych.
Przebarwić skrawki metodą h i d, wykorzystując automatyczny barwiarkę. Następnie przykryć preparaty szkiełkami za pomocą automatycznej maszynki do przykrywania. Wykorzystując cyfrowy skaner preparatów histologicznych, zdigitalizować slajdy z wybraną rozdzielczością. W niniejszym protokole powiększenie wynosi 20 x, a rozdzielczość 0,47 mikrona.
Ta część filmu przedstawia przegląd procesu rejestracji obrazów, który jest realizowany przy użyciu autorskiego oprogramowania opracowanego w naszym laboratorium w połączeniu z MATLAB c plus plus. Wykorzystując ITK, należy rozpocząć od zmniejszenia próbkowania obrazów histologicznych do rozdzielczości obrazów powierzchni bloku. Spowoduje to zmniejszenie obrazów histologicznych o współczynnik 0,026.
Następnie, w celu segmentacji obrazu i wyboru punktów, otwórz kilka obrazów powierzchni bloku w programie MATLAB i użyj narzędzia kursora danych, aby zmierzyć wartości pikseli otworów rejestracyjnych. Wykorzystaj średnią wartość pikseli jako stały próg do segmentacji otworów rejestracyjnych. Aby usunąć nadmiarowe segmenty, wykorzystaj kołowość oraz powierzchnię segmentowanych obiektów, aby zachować otwory i usunąć niepożądane segmenty.
Następnie dla każdego gruczołu mlekowego wybierz jeden obraz powierzchni bloku jako obraz referencyjny. Dopasuj środki otworów rejestracyjnych pozostałych obrazów powierzchni bloku do środków otworów rejestracyjnych obrazu referencyjnego. Następnie, wykorzystując transformacje uzyskane dla otworów rejestracyjnych, wyrównaj obrazy powierzchni bloku; dla wyrównanych obrazów powierzchni bloku przeprowadź ręczną segmentację lub ekstrakcję tkanki z tła dla przekrojów h i d.
Zastosuj technikę progowania Otsu, aby oddzielić obrazy od tła i utworzyć maski binarne obrazów histologicznych. Następnie, korzystając z histogramu oznakowanych obiektów, zidentyfikuj i wybierz największy obiekt na każdej masce. Wyodrębnij punkty graniczne o szerokości jednego piksela z masek histologicznych oraz masek powierzchni bloku.
Następnie należy zastosować algorytm deskryptorów Fouriera, aby wyznaczyć wstępną sztywną transformację między punktami brzegowymi histologii a odpowiadającymi im obrazami powierzchni bloku. Ta wstępna transformacja obejmuje czynniki translacji, rotacji i skali. Każdy obraz histologiczny należy przekształcić za pomocą wstępnej transformacji uzyskanej w poprzednim kroku.
Aby doprecyzować rejestrację sztywną, należy usunąć sekcje krawędzi o wysokiej krzywiźnie z konturu histologicznego, używając filtra toczącej się kuli (rolling ball filter). Następnie, stosując rozkład jednostajny, należy losowo wybrać 500 punktów z pozostałych punktów obrysu histologicznego. Punkty obrysu histologicznego należy przekształcić za pomocą początkowej transformacji uzyskanej z deskryptorów Fouriera.
Wykorzystaj punkty graniczne powierzchni bloku oraz algorytm iteracyjnych najbliższych punktów (ICP), aby wyznaczyć przekształcenie sztywne pomiędzy punktami granicznymi powierzchni bloku a obrazami histologicznymi. Wykorzystaj losowe punkty graniczne. Następnie przekształć obrazy histologiczne uzyskane w poprzednim kroku, aby stworzyć wizualizację wolumenu histologicznego w oprogramowaniu do wizualizacji 3D.
W programie Me vis lab wybierz moduły, plik różnorodne i dodaj moduł composed 3D from 2D files. Następnie z menu wybierz obraz i dodaj moduł image property convert. Na koniec dodaj moduł view 3D z modułów visualization 3D viewers.
Kliknij dwukrotnie opcję compose 3D from 2D files, aby załadować obrazy, a następnie kliknij create 3D. Dostosuj rozmiar woksela, klikając dwukrotnie image property convert, i ustaw rozmiar woksela na 0.018 0.018 0.01. Wyświetl objętość, klikając dwukrotnie view 3D.
Na koniec, wyświetl stos obrazów przy pięciokrotnym powiększeniu, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie. Aby lepiej scharakteryzować niedobór I-G-F-B-P siedem, przeprowadzono rekonstrukcję 3D gruczołów mlekowych myszy null, zgodnie z opisaną tutaj procedurą. Ryciny te przedstawiają zrekonstruowane wolumeny histologiczne gruczołów mlekowych typu dzikiego oraz null.
Należy zauważyć, że zmutowana gruczoł po prawej stronie jest krótszy i węższy niż typ dziki po lewej, lecz ma zbliżoną głębokość: gruczoł typu dzikiego ma 1.06 millimeters, a gruczoł null 1.02 millimeters głębokości. Zauważmy również, że gruczoły typu dzikiego po lewej stronie wykazują niewielką ilość tkanki zrębowej, co wskazuje różowe barwienie eozyną, podczas gdy gruczoły null po prawej stronie wydają się składać głównie z tkanki zrębowej. Tutaj barwienie hematoksyliną i eozyną, które identyfikuje komórki z jądrami, pokazuje, że gruczoł null zachowuje swoją gęstość, podczas gdy gruczoł typu dzikiego wydaje się zawierać przede wszystkim struktury gruczołowe.
Aby dokładniej to zbadać, zestawiono tutaj obrazy obszaru węzła chłonnego o wyższej rozdzielczości. Widoczne są duże struktury, które powinny być wypełnione mlekiem. W przeciwieństwie do nich, gruczoł IGFBP7 null posiada niewiele dobrze rozwiniętych struktur.
Ponadto struktury te są gęsto wypełnione komórkami przypominającymi fibroblasty. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak stworzyć rekonstrukcję 3D organu poprzez odtworzenie seryjnych skanów przekrojów. Dobrze. Teraz, podczas próby przeprowadzenia tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o spójnym nazywaniu preparatów i skanów, ponieważ będzie ich bardzo dużo, a sekwencyjna organizacja jest kluczem do sukcesu w realizacji tej procedury.
W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób, w jaki unaczynienie przenika przez guz, można zastosować inne metody, np. immunohistochemię w celu wykrycia specyficznych markerów komórkowych i chorobowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia podejście do rejestracji obrazów w celu trójwymiarowej rekonstrukcji wolumetrycznej histologii, koncentrując się na zmianach w makrostrukturze komórkowej gruczołów mlekowych. Poprzez badanie gruczołów mlekowych myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Igfbp7, praca wskazuje na istotne różnice w wielkości gruczołów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Zrozumienie rozwoju gruczołu sutkowego jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat laktacji.
- Techniki rejestracji obrazów usprawniają analizę danych histologicznych.
- Różnice w strukturze gruczołu sutkowego mogą wskazywać na leżące u ich podstaw mechanizmy biologiczne.
- IGF BP seven odgrywa rolę w rozwoju gruczołu sutkowego.
Cel badania
- Opracowanie metody rekonstrukcji trójwymiarowych wolumenów histologicznych.
- Porównanie różnic strukturalnych pomiędzy gruczołami mlekowymi typu dzikiego a gruczołami z deficytem IGF BP siedem.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia makrostruktur komórkowych w gruczołach mlekowych.
Stosowane metody
- Gruczoły mlekowe wycięto z myszy trzy dni po zakończeniu laktacji.
- Gruczoły przetworzono i zatopiono w blokach parafiny.
- Dla każdego bloku tkanki wykonano obrazy powierzchni bloku w świetle widzialnym.
- Do wyrównania obrazów przekrojów z obrazami powierzchni bloku w celu rekonstrukcji objętościowej wykorzystano specjalistyczne oprogramowanie.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczące różnice w wielkości między gruczołami mlekowymi mutantów a typem dzikim.
- Metoda rejestracji obrazów skutecznie zrekonstruowała objętość histologiczną.
- Uzyskane dane dostarczają informacji na temat zmian strukturalnych w gruczołach mlekowych.
- Podejście to może zostać zastosowane do innych tkanek w celu przeprowadzenia podobnych badań.
Wnioski
- Opracowana technika rejestracji obrazu jest wartościowa dla analizy histologicznej 3D.
- Różnice w strukturze gruczołów mlekowych mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad laktacją.
- Metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat organizacji komórkowej w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia badaczom z sektora biofarmaceutycznego ilościową ocenę trójwymiarowych zmian strukturalnych w tkance gruczołu piersiowego, wspierając walidację celów w biologii gruczołów mlekowych oraz szlakach związanych z laktacją. Dzięki zapewnieniu bezbłędnej rekonstrukcji objętościowej histologii, zwiększa ona pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach rozwoju gruczołów oraz interakcji zrąbowo-nabłonkowych. Podejście to ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka, umożliwiając bezpośrednie porównanie fenotypów typu dzikiego i mutantów w rozdzielczości makrostrukturalnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację różnic makrostrukturalnych w gruczołach piersiowych między modelami typu dzikiego a modelami z brakiem IGFBP7.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki niezawodnej wizualizacji 3D komponentów zrębowych i gruczolowych bez propagacji błędów rejestracji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie znormalizowanych, wysokorozdzielczych trójwymiarowych wolumenów histologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość i powtarzalność analiz dzięki spójnemu dopasowaniu przekrojów oraz ekstrakcji punktów granicznych z obrazów histologicznych i powierzchni bloków tkankowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wizualizację zmian strukturalnych związanych z niedoborem IGFBP7, takich jak zmniejszona wielkość gruczołów i zwiększona zawartość zrębu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednie porównanie morfologii gruczołu mlekowego typu dzikiego oraz mutantów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od testowania hipotez na wczesnym etapie odkryć, po identyfikację związków wiodących i walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do biologii gruczołu mlekowego oraz szlaków sygnalizacji z gleby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie wizualizacji 3D makrostruktur gruczołów mlekowych w modelach genetycznych.
- Przesiewanie: Poprawia przygotowanie do analizy dzięki powtarzalnemu dopasowaniu przekrojów histologicznych z wykorzystaniem obrazów powierzchni bloku i specjalistycznego oprogramowania do rejestracji.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak objętość, długość, szerokość i głębokość gruczołu, umożliwiając statystyczne porównanie między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę strukturalną istotną dla procesów laktacji i przebudowy tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w celu rekonstrukcji histologicznej 3D dla wielu organów i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modelach rozwoju gruczołów mlekowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki powtarzalnemu procesowi rejestracji obrazów z wykorzystaniem markerów powierzchniowych (blockface fiducials) i inicjalizacji deskryptorów Fouriera.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go, dostarczając mierzalnych danych fenotypowych 3D w celu priorytetyzacji celów w obrębie zrębu gruczołu mlekowego lub sygnalizacji nabłonkowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju skorygowanych o ryzyko poprzez obiektywne, wolumetryczne fenotypowanie modeli genetycznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, rejestracji obrazów oraz korzystania z autorskiego oprogramowania w środowisku MATLAB do wyboru punktów i transformacji.
- Zależność od aparatury, w tym od mikrotomu obrotowego, pionowej frezarki, kamery z teleobiektywem, źródła światła oraz systemów barwienia i skanowania histologicznego.
- Konieczność standaryzacji w ramach zespołów w zakresie nazywania preparatów, sekwencjonowania przekrojów oraz przechwytywania obrazów powierzchni bloku w celu zapewnienia dokładności dopasowania.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji podczas stosowania metody do innych typów tkanek ze względu na różnice w wielkości, sztywności i właściwościach barwienia.
- Ograniczenia praktyczne obejmują podatność na artefakty przekrojów, takie jak rozdarcia, zagięcia i skurcze podczas montowania, co może utrudnić rejestrację.
