Name: Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę rejestracji obrazów do trójwymiarowej rekonstrukcji histologicznej gruczołów sutkowych myszy. Technika ta umożliwia analizę makrostruktury komórkowej i porównanie różnic między typami dzikimi a mutacyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Laboratorium Badań nad Obrazowaniem Biomarkerów (BIRL) w Instytucie Badawczym Sunnybrook za ich usługi histologiczne. Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez Fundację Terry'ego Foxa, Kanadyjską Fundację Raka Piersi - Prairie - NWT, a także grant CIHR #MOP-97996.

1. Próbka
<ol>
	<li>Chirurgicznie wyciąć gruczoły sutkowe z myszy CDH1 typu dzikiego, a także myszy bez Igfbp7 trzy dni po rozpoczęciu laktacji.</li>
	<li>Rozłóż gruczoły na szkiełkach podstawowych, aby pomóc odzyskać natywną morfologię gruczołu sutkowego.</li>
</ol>
2. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Utrwalić gruczoły sutkowe w obojętnym buforze 4% PFA O/N w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Przechowuj gruczoły w 70% etanolu przed przetwarzaniem tkanek.</li>
	<li>Przenieś gruczoły do małych kaset do przetwarzania tkanek.</li>
	<li>Przetwarzaj tkanki za pomocą automatycznego procesora tkanek
	<ol>
		<li>Odwodnić tkanki w kąpielach zwiększających etanol i ksylen 70% etanolu przez 45 minut, 2 razy w 95% etanolu przez 45 minut, 3 razy w 100% etanolu przez 1 godzinę i 2 razy w ksylenie przez 45 minut.</li>
		<li>Przesiąknąć tkanki parafiną 3 razy po 1 godzinie w próżni pod przyłożonym ciśnieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz tkanki w parafinie, aby utworzyć bloki do cięcia.</li>
</ol>
3. Histologia i obrazowanie Blockface
<ol>
	<li>Przycinaj bloki parafiny za pomocą mikrotomu obrotowego, aż nadmiar parafiny zostanie usunięty.</li>
	<li>Za pomocą frezarki pionowej wywiercić otwory o średnicy 1 mm w co najmniej dwóch rogach bloku parafinowego prostopadłego do kasety.</li>
	<li>Zamontuj blok tkankowy na mikrotomie obrotowym.</li>
	<li>Skonfiguruj system obrazowania blokowego19 przed mikrotomem.</li>
	<li>Przechwyć obraz bloku optycznego przed przekrojem.</li>
	<li>Wytnij wstęgi składające się z czterech odcinków o grubości 5 μm na mikrotomie.
	<ol>
		<li>Przenieś wstążki do kąpieli w zimnej wodzie.</li>
		<li>Oddziel drugą i czwartą sekcję wstążki i zamontuj je na szkiełkach mikroskopowych. Wybór drugiej i czwartej sekcji zapewnia odstęp 5 μm między sekcjami.</li>
		<li>Rozpręż każdą sekcję w ciepłej kąpieli wodnej (48 oC), aby ją rozgniotować, a następnie ponownie zamontuj ją na szkiełku mikroskopowym. 
		UWAGA: Cięcie, montaż, rozgniatanie sekcji powoduje pewne zniekształcenia sekcji, takie jak rozdarcie, zagięcie, skurczenie i rozszerzenie. Artefakty te komplikują rejestrację skrawków histologicznych.</li>
		<li>Zabejcuj skrawki za pomocą H&E za pomocą automatycznego barwiacza.</li>
		<li>Nakryj szkiełka podstawowe za pomocą automatycznego szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Digitalizuj slajdy za pomocą cyfrowego skanera histologicznego slajdów w interesującej Cię rozdzielczości. Dla tego protokołu powiększenie wynosi 20x, a rozdzielczość 0,47 μm.</li>
		<li>Zmniejsz próbkowanie obrazów histologicznych do rozdzielczości obrazów blokowych, 18 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rejestracja obrazu
<ol>
	<li>Segmentacja obrazu i wybór punktów
	<ol>
		<li>W obrazach typu blockface mierzy się wartości pikseli otworów rejestracyjnych i wykorzystuje wartość średnią jako stały próg do segmentacji otworów rejestracyjnych w rogach bloku parafinowego.</li>
		<li>Ponieważ niektóre dodatkowe części mogą być również segmentowane przy użyciu stałego progu, użyj kołowości i obszaru podzielonych na segmenty obiektów, aby znaleźć otwory i odrzucić dodatkowe obiekty. Aby to zrobić, napisz mały kod i znajdź stosunek (4π x powierzchnia)/(obwód)2 dla podzielonych na segmenty obiektów. Ten stosunek dla okrągłych obiektów wynosi 1.</li>
		<li>Dla każdego gruczołu sutkowego wybierz jeden obraz bloku jako odniesienie i wyrównaj pozostałe obrazy bloku do odniesienia, używając środka otworów rejestracyjnych i technik rejestracji opartych na punktach orientacyjnych.</li>
		<li>W przypadku wyrównanych obrazów blokowych ręcznie podziel tkankę na segmenty lub wyodrębnij ją z tła. Użyj największego obiektu w masce do końca protokołu.</li>
		<li>W przypadku sekcji BHP wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać automatyczną segmentację.
		<ol>
			<li>Użyj techniki progowania Otsu20, aby segmentować obrazy od tła i tworzyć binarne maski obrazów histologicznych.</li>
			<li>Zidentyfikuj i zaznacz obiekt o największym rozmiarze w każdej masce, korzystając z histogramu oznaczonych obiektów.</li>
			<li>Wyodrębnij punkty graniczne o szerokości jednego piksela zarówno z masek histologicznych, jak i maski blokowej.</li>
			<li>Użyj algorytmu kodu łańcuchowego21, aby przedstawić punkty graniczne za pomocą sekwencji odcinkowych pasowań liniowych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna sztywna rejestracja
	<ol>
		<li>Użyj algorytmu deskryptorów Fouriera22, aby znaleźć początkową sztywną transformację między punktami granicznymi histologii a odpowiadającymi im obrazami blokowymi. Ta początkowa transformacja obejmuje współczynniki translacji, obrotu i skali.</li>
		<li>Przekształć każdy obraz histologiczny za pomocą początkowej transformacji uzyskanej w poprzednim kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Udoskonalenie sztywnej rejestracji
	<ol>
		<li>Usunąć odcinki krawędzi o dużej krzywiźnie z konturu histologicznego za pomocą filtra kulkowego23.</li>
		<li>Wybierz losowo 500 punktów z pozostałych histologicznych punktów granicznych przy użyciu równomiernego rozkładu.</li>
		<li>Przekształć losowe punkty graniczne histologii za pomocą początkowej transformacji uzyskanej z deskryptorów Fouriera.</li>
		<li>Wybierz cały zestaw punktów granicznych powierzchni bloku i użyj algorytmu iteracyjnego punktu najbliższego bloku (ICP)24, aby znaleźć sztywną transformację między losowymi punktami granicznymi powierzchni bloku, miejscem docelowym i histologicznymi punktami granicznymi.</li>
		<li>Przekształć wyrównane obrazy histologiczne uzyskane w poprzednim kroku, a stos wyrównanych obrazów histologicznych utworzy objętość histologiczną.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do wizualizacji 3D, aby stworzyć wizualny obraz objętości histologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyświetlanie stosu obrazów w 5-krotnym powiększeniu
	<ol>
		<li>Zmniejsz próbkowanie oryginalnych obrazów histologicznych do 5-krotnego powiększenia.</li>
		<li>Przytnij obszar zainteresowania na jednym z obrazów histologicznych.</li>
		<li>Oblicz lokalizację tego regionu na innych 5-krotnych obrazach histologicznych, korzystając z kombinacji sztywnych transformacji z dwóch etapów rejestracji.</li>
		<li>Przytnij obszary zainteresowania do obszaru o tym samym rozmiarze na wszystkich innych obrazach histologicznych.</li>
		<li>Na koniec ręcznie doprecyzuj wyrównanie między regionami. Napisz program, który nakłada na siebie dwa obrazy i pozwala wybrać wartości obrotu i translacji jednego z obrazów na drugi, a następnie zapisuje przekształcony obraz, gdy wyrównanie zostanie zaakceptowane.</li>
		<li>Przeglądaj stosy wyrównanych 5-krotnie obszarów histologicznych za pomocą oprogramowania do wizualizacji 3D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sunkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Atlas%3A+An+integrated+spatiotemporal+port+for+exploring+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system.</a> Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).</li>
<li>Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Allen+Human+Brain+Atlas%3A+Comprehensive+gene+expression+mapping+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain.</a> Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).</li>
<li>Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).</li>
<li>Evdokimova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+binds+to+the+IGF-1+receptor+and+blocks+its+activation+by+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors.</a> Science Signaling. 5 (255), 92(2012).</li>
<li>Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+IGFBP-3+and+IGFBP-rP1+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer.</a> European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).</li>
<li>Amemiya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+like+growth+factor+binding+protein-7+reduces+growth+of+human+breast+cancer+cells+and+xenografted+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors.</a> Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).</li>
<li>Benatar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+reduces+breast+tumor+growth+by+induction+of+senescence+and+apoptosis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways.</a> Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).</li>
<li>Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBardinet%2C+E+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted+Intervention-Part+I%22">Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I</a>. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).</li>
<li>Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+and+warping+of+magnetic+resonance+images+to+histological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections.</a> Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).</li>
<li>Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registering+histologic+and+MR+images+of+prostate+for+image-based+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+radiology%22%5BJournal%5D)">Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection.</a> Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).</li>
<li>Dauguet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+stained+histological+slices+and+3D+non-linear+registration+with+in+vivo+MRI+for+whole+baboon+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).</li>
<li>Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+registration+using+needle+paths+and+point+landmarks+for+evaluation+of+interventional+MRI+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).</li>
<li>Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+registration+of+magnetic+resonance+image+data+to+histological+sections+with+model-based+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).</li>
<li>Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).</li>
<li>Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+M+%22Computational+Methods+in+Systems+Biology%22">Computational Methods in Systems Biology</a>. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).</li>
<li>Wu, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+microscopy+of+colorectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+multiple+stained+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of multiple stained histology images.</a> Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).</li>
<li>Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+histology+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Medical+Imaging.+7962%2C+79621E%2C+doi%3A10.1117%2F12.878762%22%5BJournal%5D)">Validation of histology image registration.</a> SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+thresholding+using+an+iterative+selection+method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Picture thresholding using an iterative selection method.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Freeman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+processing+of+line-drawing+images%5BTitle%5D)+AND+%22ACM+Computing+Surveys+%28CSUR%22%5BJournal%5D)">Computer processing of line-drawing images.</a> ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).</li>
<li>Giardina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+curve+approximation+by+harmonically+related+vectors+with+elliptical+loci%29%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Graphics+and+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci).</a> Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).</li>
<li>Shojaii, R., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+edge+point+selection+method+for+registration+of+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Tissue+Image+analysis+in+Microscopy%2C+Histopathology+and+Endoscopy.+%28OPTIMHisE%29+Workshop%2C+MICCAI%22%5BJournal%5D)">A novel edge point selection method for registration of histology images.</a> Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).</li>
<li>Besl, P., McKay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+registration+of+3-D+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">A method for registration of 3-D shapes.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).</li>
<li>Chatterjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Igfbp7+causes+precocious+involution+in+lactating+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland.</a> PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).</li>
<li>Manjunath, B. S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+texture+segmentation+using+Markov+random+field+models%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Unsupervised texture segmentation using Markov random field models.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).</li>
<li>Krishnamachari, S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiresolution+Gauss-Markov+random+field+models+for+texture+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation.</a> IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

W tym badaniu opracowaliśmy proces rejestracji obrazu w celu rekonstrukcji objętości histologicznej 3D z seryjnych obrazów histologicznych 2D, która nie wymaga wewnętrznych losowo wybranych punktów orientacyjnych ani wszczepionych markerów odniesienia w tkance, które mogą zniekształcić tkankę. Zgodnie z opisaną metodą, same obrazy bloków optycznych są używane jako obrazy referencyjne przed przekrojem. Używamy zewnętrznych otworów wywierconych w bloku parafinowym, aby pomóc w wyrównaniu obrazów bloku i skorygować poprzecz...

IGFBP7 (białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 7) należy do rodziny białek wiążących IGF i wykazano, że wiąże receptor IGF14. Wiadomo, że regulacja w dół IGFBP7 jest skorelowana ze złym rokowaniem w raku piersi5, podczas gdy ponowne wprowadzenie IGFBP7 w modelach guzów ksenoprzeszczepu znacznie hamuje wzrost guzów6 poprzez indukcję apoptozy i starzenie się komórek7. W celu zbadania wpływu IGFPB7 stworzono mysz z zerowym Igfbp75 (dane niepublikowane). Chociaż u tych myszy nie rozwijają się nowotwory, wykazują zmiany w histologii jajnika, mięśni i wątroby, a także defekty we wzorcach rozwojowych gruczołu sutkowego (dane niepublikowane). Wadliwy fenotyp został po raz pierwszy wskazany, ponieważ myszy zerowe mają mniejsze rozmiary miotów i nie są w stanie utrzymać wielu dużych miotów (dane niepublikowane).
objętości histologiczne 3D mają potencjał, aby dostarczyć użytecznych informacji do analiz ilościowych i porównawczych oraz oceny zmian patologicznych w wolumetrycznych obrazach medycznych. Trójwymiarowa konfokalna, dwufotonowa mikroskopia może dostarczyć informacji morfologicznych o wysokiej rozdzielczości gruczołu w zasięgu lokalnym14 , ale ma ograniczone pole widzenia i głębokość. Rekonstrukcja objętości histologicznej dostarcza więcej informacji na znacznie większym obszarze przestrzennym. Przy użyciu tradycyjnych metod przewiduje się pewne zniekształcenia podczas przygotowywania skrawków histologicznych, takie jak kurczenie się, rozszerzanie, rozdarcia i fałdy. Zniekształcenia te utrudniają rejestrację seryjnych obrazów histologicznych w stosie 3D w celu zrekonstruowania objętości 3D. Wraz ze wzrostem liczby kolejnych odcinków z wadami, podobieństwa między nienaruszonymi sekcjami zmniejszają się, a co za tym idzie, komplikuje to proces rejestracji.
Zaproponowano różne metody rejestrowania skrawków histologicznych i tworzenia ciągłej objętości histologicznej. Niektóre techniki zależą od zmian intensywności8, a inne opierają się na kształcie sekcji9. W przypadku niektórych okazów struktury anatomiczne mogą być wykorzystywane jako punkty orientacyjne10,11 wraz z metodami rejestracji opartymi na punktach orientacyjnych12,13. Jednak te wewnętrzne struktury mogą nie być wykrywalne w całej objętości, a w przypadku niektórych okazów nie można zidentyfikować wiarygodnych struktur anatomicznych. Niektóre grupy stosowały podejście do rejestracji parami i rejestrowały kolejne obrazy histologiczne jeden do drugiego za pomocą konturów lub struktur anatomicznych16-18. Rejestrowanie szeregowych odcinków histologicznych względem siebie bez użycia obrazów referencyjnych może spowodować propagację błędu pasowania i zmianę rzeczywistego kształtu objętości histologicznej. Podejście do rejestracji parami opiera się na spójności kształtu skrawków histologicznych i struktur wewnętrznych w całym stosie obrazów; W związku z tym wymaga gęstego pobierania próbek próbki, co nie zawsze jest możliwe, np. w przypadku próbek klinicznych.
W tym potoku używamy obrazów blokowych jako zestawu obrazów referencyjnych do rekonstrukcji objętości histologicznej19. Obrazy bloków tkanki parafinowej są wykonywane po zamontowaniu na mikrotomie i przed przecięciem każdego odcinka. Tym samym uszkodzenie poszczególnych przekrojów seryjnych nie przeszkadza w rejestracji odcinków seryjnych8,11,15. Rejestrujemy obrazy blokowe w inny sposób niż inne grupy. Obrazy twarzy bloku optycznego są uzyskiwane przez soczewkę telecentryczną w celu wyeliminowania lub zminimalizowania zniekształceń beczkowatych i perspektywicznych, które zwykle występują przy użyciu zwykłych soczewek w optyce. Jest to jedna z zalet proponowanego podejścia w porównaniu z innymi opublikowanymi metodami, które wykonują obrazowanie blokowe przy użyciu zwykłych soczewek. Obrazy są wykonywane pod lekkim skosem, aby wykorzystać odbicie powierzchni bloku do wzmocnienia kontrastu między tkanką a powierzchnią parafiny oraz do wyeliminowania cienia tkanki w głąb, pod powierzchnią parafiny. Filtr fotograficzny służy również do polaryzacji światła pochodzącego z powierzchni bloku i tkanki w celu zrównoważenia kontrastu19. Aby skorygować przemieszczenie bloku na mikrotomie obrotowym, w rogach bloku wierci się dwa do trzech otworów, które są łatwo wykrywalne na obrazach bloku. Centroidy tych otworów są używane wraz ze sztywną pasacją opartą na punktach orientacyjnych w celu wyrównania obrazów bloków.

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% roztwór paraformaldehydu</td></tr><tr><td>Małe kasety do przetwarzania tkanek</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny procesor tkanek Leica ASP300</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>Parafina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Medium do zatapiania tkanek Paraplast</td></tr><tr><td>Centrum zatapiania Leica EG 1160 Mikrotom</td> obrotowy <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frezarka</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice mikroskopowe</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H& E bejca</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna bejca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe&nbsp;</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>Szkieł nakrywkowy MEDITE RCM 7000</td> Skaner slajdów <td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>Oprogramowanie programistyczne</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji 3D</td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histologia rekonstrukcja objętości ułatwia badanie 3D kształtu i zmiany objętości narządu na poziomie makrostruktur zbudowanych z komórek. Może być również wykorzystywany do badania i walidacji nowatorskich technik i algorytmów w wolumetrycznym obrazowaniu medycznym i terapiach. Tworzenie atlasów 3D o wysokiej rozdzielczości różnych narządów1,2,3 to kolejne zastosowanie histologicznej rekonstrukcji objętościowej. Stanowi to zasób do badania struktur tkankowych i relacji przestrzennych między różnymi cechami komórkowymi. Przedstawiamy podejście do rejestracji obrazu do histologicznej rekonstrukcji objętościowej, które wykorzystuje zestaw optycznych obrazów blokowych. Zrekonstruowana objętość histologiczna reprezentuje wiarygodny kształt obrabianej próbki bez propagowanego błędu rejestracji po obróbce. Wybarwione hematoksyliną i eozyną (H&E) odcinki dwóch mysich gruczołów sutkowych zarejestrowano na odpowiadających im obrazach blokowych przy użyciu punktów granicznych wyodrębnionych z krawędzi próbki na obrazach histologicznych i blokowych. Dokładność rejestracji została oceniona wizualnie. Wyrównanie makrostruktur gruczołów sutkowych zostało również ocenione wizualnie w wysokiej rozdzielczości.
To badanie przedstawia różne etapy tego procesu rejestracji obrazu, począwszy od wycięcia gruczołu sutkowego, a skończywszy na rekonstrukcji objętości histologicznej 3D. Podczas gdy obrazy histologiczne 2D ujawniają różnice strukturalne między parami sekcji, objętość histologiczna 3D zapewnia możliwość wizualizacji różnic w kształcie i objętości gruczołów sutkowych.

Wadą tradycyjnych technik mikroskopowych jest to, że zrozumienie organu na poziomie mikroskopowym ogranicza się do jednego pola widzenia w danym momencie. Nawet preparaty typu „total disclosure”, zapewniające obraz całych przekrojów, nie dostarczają informacji trójwymiarowych. Dzięki rozwojowi technologii dynamicznego skanowania całych preparatów wzrosła nasza zdolność do oglądania przekrojów w całości, jednak ekstrapolacja struktur wymaga trójwymiarowej rekonstrukcji objętościowej histologicznej.
<p class="jove_cont...

Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.

Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Ogólnym celem poniższego filmu jest przedstawienie metody rejestracji obrazów w histologii trójwymiarowej oraz rekonstrukcji objętościowej w celu zbadania zmian w makrostrukturze komórkowej gruczołu piersiowego. W tym celu gruczoły piersiowe są wycinane z myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu 7, IGF BP seven, trzy dni po rozpoczęciu laktacji. Następnie gruczoły są przetwarzane i zatapiane w blokach parafiny w celu wykonania skrawków.Następnie rejestrowane są obrazy powierzchni optycznej bloków tkankowych, a następnie bloki tkankowe są sekcjonowane. Wykonywane są obrazy przekrojów, a przy użyciu specjalistycznego oprogramowania każdy przekrój jest dopasowywany do odpowiadającego mu obrazu powierzchni bloku w celu rekonstrukcji objętości histologicznej gruczołu mlekowego. Wynikowe dane podkreślają różnice w wielkości gruczołów u mutantów i osobników typu dzikiego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trójwymiarowa konfokalna mikroskopia dwukrotna, jest dostarczanie informacji z znacznie większego zakresu przestrzennego. Metoda ta może być również wykorzystana do badania i walidacji nowych technik i algorytmów w wolumetrycznym obrazowaniu medycznym i terapiach, a także do tworzenia wysokorozdzielczych analiz 3D różnych organów. Zrekonstruowana objętość histologiczna stanowi wiarygodną reprezentację preparatu z procesu, bez propagowanego błędu rejestracji.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że myszy z nokautem genu IGF P seven mają mniejsze mioty i nie są w stanie utrzymać wielu licznych miotów, dlatego postanowiliśmy zbadać strukturę ich gruczołów mlekowych. Po zatopieniu tkanki w parafinie, należy użyć mikrotomu obrotowego do przycięcia bloku, aż do usunięcia nadmiaru parafiny. Następnie, za pomocą pionowej frezarki, należy wywiercić otwory o średnicy 1 mm w co najmniej dwóch narożnikach bloku parafiny, prostopadle do kasety, a następnie zamocować blok tkankowy w mikrotomie obrotowym.Aby skonfigurować system obrazowania powierzchni bloku przed mikrotomem, należy umieścić aparat z teleobiektywem pod niewielkim kątem względem powierzchni bloku tkankowego. Aparat powinien być podłączony do komputera znajdującego się przed mikrotomem. Następnie należy ustawić źródło światła przed blokiem w taki sposób, aby aparat rejestrował odbicie światła od bloku.Dostosuj kąt kamery tak, aby tkanka na powierzchni bloku była wyraźnie odróżnialna od otaczającej ją parafiny. Wykonaj jedno zdjęcie powierzchni bloku w świetle widzialnym. Następnie, używając mikrotomu, wytnij taśmy czterech skrawków o grubości pięciu mikronów.Przenieś wstążki do kąpieli w zimnej wodzie, rozdziel poszczególne sekcje wstążki, a następnie nabierz drugą i czwartą sekcję z zimnej wody na szkiełko przedmiotowe. Przenieś je do kąpieli w ciepłej wodzie w celu ich wyprostowania. Wybór drugiej i czwartej sekcji zapewnia przerwę o szerokości 5 µm między sekcjami.Po rozprostowaniu zmarszczek ponownie zamocuj skrawki na szkiełkach przedmiotowych mikroskopu metodą nabierania. Jak wcześniej, należy zauważyć, że cięcie, montaż i rozprostowywanie zmarszczek skrawków mogą powodować pewne zniekształcenia, takie jak rozdarcia, fałdy, kurczenie się i rozszerzanie. Artefakty te utrudniają rejestrację skrawków histologicznych.Przebarwić skrawki metodą h i d, wykorzystując automatyczny barwiarkę. Następnie przykryć preparaty szkiełkami za pomocą automatycznej maszynki do przykrywania. Wykorzystując cyfrowy skaner preparatów histologicznych, zdigitalizować slajdy z wybraną rozdzielczością. W niniejszym protokole powiększenie wynosi 20 x, a rozdzielczość 0,47 mikrona.Ta część filmu przedstawia przegląd procesu rejestracji obrazów, który jest realizowany przy użyciu autorskiego oprogramowania opracowanego w naszym laboratorium w połączeniu z MATLAB c plus plus. Wykorzystując ITK, należy rozpocząć od zmniejszenia próbkowania obrazów histologicznych do rozdzielczości obrazów powierzchni bloku. Spowoduje to zmniejszenie obrazów histologicznych o współczynnik 0,026.Następnie, w celu segmentacji obrazu i wyboru punktów, otwórz kilka obrazów powierzchni bloku w programie MATLAB i użyj narzędzia kursora danych, aby zmierzyć wartości pikseli otworów rejestracyjnych. Wykorzystaj średnią wartość pikseli jako stały próg do segmentacji otworów rejestracyjnych. Aby usunąć nadmiarowe segmenty, wykorzystaj kołowość oraz powierzchnię segmentowanych obiektów, aby zachować otwory i usunąć niepożądane segmenty.Następnie dla każdego gruczołu mlekowego wybierz jeden obraz powierzchni bloku jako obraz referencyjny. Dopasuj środki otworów rejestracyjnych pozostałych obrazów powierzchni bloku do środków otworów rejestracyjnych obrazu referencyjnego. Następnie, wykorzystując transformacje uzyskane dla otworów rejestracyjnych, wyrównaj obrazy powierzchni bloku; dla wyrównanych obrazów powierzchni bloku przeprowadź ręczną segmentację lub ekstrakcję tkanki z tła dla przekrojów h i d.Zastosuj technikę progowania Otsu, aby oddzielić obrazy od tła i utworzyć maski binarne obrazów histologicznych. Następnie, korzystając z histogramu oznakowanych obiektów, zidentyfikuj i wybierz największy obiekt na każdej masce. Wyodrębnij punkty graniczne o szerokości jednego piksela z masek histologicznych oraz masek powierzchni bloku.Następnie należy zastosować algorytm deskryptorów Fouriera, aby wyznaczyć wstępną sztywną transformację między punktami brzegowymi histologii a odpowiadającymi im obrazami powierzchni bloku. Ta wstępna transformacja obejmuje czynniki translacji, rotacji i skali. Każdy obraz histologiczny należy przekształcić za pomocą wstępnej transformacji uzyskanej w poprzednim kroku.Aby doprecyzować rejestrację sztywną, należy usunąć sekcje krawędzi o wysokiej krzywiźnie z konturu histologicznego, używając filtra toczącej się kuli (rolling ball filter). Następnie, stosując rozkład jednostajny, należy losowo wybrać 500 punktów z pozostałych punktów obrysu histologicznego. Punkty obrysu histologicznego należy przekształcić za pomocą początkowej transformacji uzyskanej z deskryptorów Fouriera.Wykorzystaj punkty graniczne powierzchni bloku oraz algorytm iteracyjnych najbliższych punktów (ICP), aby wyznaczyć przekształcenie sztywne pomiędzy punktami granicznymi powierzchni bloku a obrazami histologicznymi. Wykorzystaj losowe punkty graniczne. Następnie przekształć obrazy histologiczne uzyskane w poprzednim kroku, aby stworzyć wizualizację wolumenu histologicznego w oprogramowaniu do wizualizacji 3D.W programie Me vis lab wybierz moduły, plik różnorodne i dodaj moduł composed 3D from 2D files. Następnie z menu wybierz obraz i dodaj moduł image property convert. Na koniec dodaj moduł view 3D z modułów visualization 3D viewers.Kliknij dwukrotnie opcję compose 3D from 2D files, aby załadować obrazy, a następnie kliknij create 3D. Dostosuj rozmiar woksela, klikając dwukrotnie image property convert, i ustaw rozmiar woksela na 0.018 0.018 0.01. Wyświetl objętość, klikając dwukrotnie view 3D.Na koniec, wyświetl stos obrazów przy pięciokrotnym powiększeniu, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie. Aby lepiej scharakteryzować niedobór I-G-F-B-P siedem, przeprowadzono rekonstrukcję 3D gruczołów mlekowych myszy null, zgodnie z opisaną tutaj procedurą. Ryciny te przedstawiają zrekonstruowane wolumeny histologiczne gruczołów mlekowych typu dzikiego oraz null.Należy zauważyć, że zmutowana gruczoł po prawej stronie jest krótszy i węższy niż typ dziki po lewej, lecz ma zbliżoną głębokość: gruczoł typu dzikiego ma 1.06 millimeters, a gruczoł null 1.02 millimeters głębokości. Zauważmy również, że gruczoły typu dzikiego po lewej stronie wykazują niewielką ilość tkanki zrębowej, co wskazuje różowe barwienie eozyną, podczas gdy gruczoły null po prawej stronie wydają się składać głównie z tkanki zrębowej. Tutaj barwienie hematoksyliną i eozyną, które identyfikuje komórki z jądrami, pokazuje, że gruczoł null zachowuje swoją gęstość, podczas gdy gruczoł typu dzikiego wydaje się zawierać przede wszystkim struktury gruczołowe.Aby dokładniej to zbadać, zestawiono tutaj obrazy obszaru węzła chłonnego o wyższej rozdzielczości. Widoczne są duże struktury, które powinny być wypełnione mlekiem. W przeciwieństwie do nich, gruczoł IGFBP7 null posiada niewiele dobrze rozwiniętych struktur.Ponadto struktury te są gęsto wypełnione komórkami przypominającymi fibroblasty. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak stworzyć rekonstrukcję 3D organu poprzez odtworzenie seryjnych skanów przekrojów. Dobrze. Teraz, podczas próby przeprowadzenia tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o spójnym nazywaniu preparatów i skanów, ponieważ będzie ich bardzo dużo, a sekwencyjna organizacja jest kluczem do sukcesu w realizacji tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób, w jaki unaczynienie przenika przez guz, można zastosować inne metody, np. immunohistochemię w celu wykrycia specyficznych markerów komórkowych i chorobowych.

reconstruction-3-dimensional-histology-volume-its-application-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rekonstrukcja objętości histologii 3-wymiarowej i jej zastosowanie do badania gruczołów sutkowych myszy

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Rozwój gruczołu sutkowego u gryzonia był zazwyczaj oceniany za pomocą ocen opisowych lub poprzez pomiar podstawowych cech fizycznych. Gęstość rozgałęzień jest wskaźnikiem rozwoju sutka, który jest trudny do obiektywnego oszacowania. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę ilościowej oceny charakterystyki rozgałęzień gruczołu mlekowego.

Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Opisujemy techniki indukcji różnicowania dwóch linii nabłonka piersi, HC11 i EpH4. Podczas gdy obie wymagają płodowej surowicy cielęcej, insuliny i prolaktyny do produkcji białek mleka, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w mammosfery w trójwymiarowej hodowli. Te uzupełniające się modele są przydatne do badań transdukcji sygnału różnicowania i nowotworu.

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Opisano metodę doprzewodowego wstrzykiwania odczynników do roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do mysiego drzewa sutkowego do obrazowania in vivo i zapobiegania rakowi piersi. Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ubocznych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Poznaj metodę rejestracji obrazów do trójwymiarowej rekonstrukcji histologicznej gruczołów sutkowych myszy. Technika ta umożliwia analizę makrostruktury komórkowej i porównanie różnic między typami dzikimi a mutacyjnymi.

Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Przeglądaj więcej filmów