Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie interakcji dwóch białek ulegających ekspresji w nienaruszonych liściach tytoniu. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie odpowiednich konstruktów, połączenie dwóch interesujących genów w celu rozszczepienia białek fluorescencyjnych i przekształcenie tych konstruktów w agrobakterie. W drugim etapie kultury agrobakterii są mieszane i wstrzykiwane do liści tytoniu, co prowadzi do ekspresji białek i odtworzonego sygnału fluorescencyjnego.

Jeśli białka znajdą się w bliskiej odległości, pod mikroskopem analizuje się całe liście lub wyizolowane protoplasty. Uzyskano wyniki, które pokazują oddziaływania białek białkowych na podstawie wyemitowanego sygnału fluorescencyjnego wykrytego przez mikroskopię fluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunoprecypitacja kor lub drożdże do hybrydy, jest to, że interakcja białka białkowego może być bezpośrednio monitorowana w żywej komórce roślinnej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii roślin, takie jak tworzenie kompleksów białkowych w różnych przedziałach komórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj agrobakterie, które zostaną użyte do przemiany liści tytoniu. Zaszczepić 10 mililitrów pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki 50 mikrolitrami kultury podstawowej AG L z jednym glicerolem zawierającej interesujący nas plazmid w sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny, wstrząsając z prędkością 190 obr./min, aż kultura osiągnie OD 600 między 1,0 a 2,0 następnego dnia. Odwiruj bakterie w temperaturze 3000 razy G przez 15 minut. Po odrzuceniu resusu supernatantu, zawiesić osad w świeżo przygotowanym podłożu infiltracyjnym i dostosować zawiesinę do OD 600 1,0.

Inkubuj komórki agrobakterii w wytrząsarce nad głową przez dwie godziny w ciemności w temperaturze pokojowej w celu infiltracji liści tytoniu. Wybierz kilka starszych liści z trzytygodniowej rośliny tytoniu. Wymieszaj równe objętości.

Trzy mililitry każdej z agrobakterii przenoszących interesujące nas konstrukty. Napełnij pięciomililitrową strzykawkę bez igły mieszaniną zawiesiny komórek, aby przeniknąć do zawiesiny komórkowej do liści tytoniu. Ostrożnie dociśnij strzykawkę do spodniej strony liści w kilku miejscach, podlej rośliny i pozostaw je przykryte i chronione przed światłem na dwa dni.

Aby wyizolować protoplasty z naciekanego liścia, najpierw umieść liść na szalce Petriego i dodaj trochę świeżo przygotowanego roztworu enzymu. Za pomocą nowej żyletki pokrój liść na kawałki o wielkości około 0,5 centymetra kwadratowego. Następnie przenieś kawałki liści z roztworem enzymu do próżni

Kolba rozsączająca. Infiltrować próżniowo przez około 20 sekund, aż z liści wyłonią się pęcherzyki powietrza. Zwolnij odkurzacz bardzo ostrożnie.

Po 90 minutach wstrząsać kolbą przez 90 minut z prędkością 40 obr./min w ciemności, w temperaturze pokojowej. Uwolnić protoplasty, wstrząsając przez jedną minutę z prędkością 90 obr./min. Przefiltruj roztwór przez gazę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem.

Nałożyć roztwór protoplastów na dwa mililitry buforu FPCN i odwirować przez 10 minut przy 70 razy G z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem w temperaturze pokojowej. Nienaruszone protoplasty gromadzą się na granicy faz między roztworem enzymu a FPCN za pomocą szerokiej kryzy, jednomililitrowej końcówki pipety, przenoszą nienaruszone protoplasty do świeżej probówki wirówkowej. Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, zawsze używaj białych końcówek kryzy, aby zapobiec pękaniu nienaruszonych protoplastów.

Napełnij probówkę wirówką z pięcioma W przez dwie minuty przy 100 razy G z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Aby osadzać protoplasty, należy ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad. W około 200 mikrolitrach W pięć, w zależności od ilości protoplastów.

Aby przygotować próbkę protoplastów do laserowej mikroskopii skaningowej, najpierw należy umieścić dwa małe paski szczeliwa w odległości około dwóch centymetrów od siebie na szkiełku mikroskopowym. Umieść 20 mikrolitrów roztworu protoplastów między paskami i ostrożnie umieść na wierzchu szklankę nakrywkową. Paski uszczelniające zapobiegną zgnieceniu protoplastów przez szkło nakrywkowe.

Aby przygotować całkowitą próbkę liścia do laserowej mikroskopii skaningowej, odetnij jednocentymetrowy kawałek liścia i umieść go na szkiełku mikroskopowym dolną stroną liścia skierowaną do góry. Dodaj około 30 mikrolitrów wody. Umieść szklankę nakrywkową na górze i przymocuj ją mocno taśmą klejącą po obu stronach.

Obrazowanie wykonuje się za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego firmy MICCA typu TCS SP five do powiększenia. Użyj soczewki obiektywowej o wielkości 63x z glicerolem jako medium obrazowania, użyj zaawansowanego oprogramowania fluorescencyjnego Leica Application Suite do oceny. Ustaw laser Argonne na 30%, a moc lasera na 488 nanometrów na intensywność 18%Aby monitorować jego sygnał na 515 nanometrach, ustaw szerokość pasma emisji pierwszego detektora PMT od 495 do 550 nanometrów.

Do monitorowania autofluorescencji chlorofilu. Ustaw szerokość pasma emisji drugiego detektora PMT od 650 do 705 nanometrów. Do monitorowania sygnału wiśni M należy użyć lasera HENI 5 61.

Ustaw intensywność lasera na 18%, a trzeci detektor PMT ma szerokość pasma emisji od 587 do 610 nanometrów. Upewnij się, że zdjęcia ze wszystkich kanałów detektora PMT są robione z tymi samymi ustawieniami wzmocnienia. Wzmocnienie powinno wynosić od 800 do 900, aby wykluczyć sygnały tła.

Uzyskuj obrazy w tym formacie, szerokości i wysokości 1024 na 1024 pikseli z prędkością skanowania 100 Hz. W przypadku układania w stosy Z należy zachować maksymalną odległość 0,5 mikrona między każdym stosem. W tym badaniu zastosowano metodę BFC do monitorowania interakcji cytozolowego molekularnego białka opiekuńczego HSP 90 z białkami dokującymi błonę TPR 7 i do 64.

Jak pokazano na tym schemacie, Wenus jest sprzężona z cytozolową częścią TPR siódemki, która znajduje się w retikulum endoplazmatycznym lub z 64, która znajduje się w zewnętrznej otoczce chloroplastu. HS.P 90 jest N końcowo połączony z SCFP, umożliwiając interakcję domen TPR rozmowy 64 i TPR siedem Z HSP 90 C, końcem, sam SCFP ulega ekspresji w cytozolu jako kontrola ujemna w celu sprawdzenia lokalizacji kompleksu białkowego TPR siedem HS P 90. TPR seven i HS P 90 zostały poddane jednoczesnej transformacji za pomocą markera ER.

Fluorescencję monitorowano w nienaruszonych liściach jako kontrolę. Sam SCFP wyrażano wraz z TPR siedem i markerem ER. Na wszystkich pokazanych obrazach podziałka liniowa reprezentuje 10 mikronów.

Panele po lewej stronie pokazują odtworzoną fluorescencję w kolorze zielonym monitorowaną w odległości 515 nanometrów. Znacznik ER jest wyświetlany na czerwono. W środkowych panelach nakładka obu sygnałów jest pokazana w prawych panelach.

Odtworzony sygnał dla TPR seven wraz z HS P 90 był monitorowany nakładając się na znacznik ER widoczny na żółto. Nie monitorowano natomiast żadnego sygnału dla TPR 7 i kontroli ujemnej jako CFP. W następnym przykładzie białko chloroplastowe tox 64 ulegało jednoczesnej ekspresji z HS P 90 jako kontrola.

Tox 64 ulegał jednoczesnej ekspresji z samym SCFP. Tak jak poprzednio, odtworzoną fluorescencję w kolorze zielonym monitorowano przy 515 nanometrach. Środkowe panele pokazują autofluorescencję chlorofilu monitorowaną na głębokości 480 nanometrów.

Na czerwono pokazana jest nakładka obu sygnałów w prawych panelach. Odtworzoną fluorescencję zaobserwowano w komórkach wykazujących ekspresję coex tox 64 i HSP 90, ale nie w komórkach. Coex wyrażający sam tox 64 i SCFP.

Ponieważ dokładna lokalizacja tox 64 i HSP 90 jest trudna do ustalenia na obrazach mikroskopowych całych liści. Protoplasty wyizolowano z naciekanych liści tytoniu do mikroskopii fluorescencyjnej. Tak jak poprzednio, odtworzona fluorescencja była monitorowana przy 515 nanometrach, autofluorescencja chlorofilu była monitorowana przy 480 nanometrach i utworzono obrazy nakładkowe, jak pokazano na tym obrazie nakładki, do 64, a HSP 90 można wykryć jako struktury w kształcie pierścienia otaczające chloroplast Off.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować swoje konstrukty, przekształcać liście tytoniu i jak najlepiej wizualizować sygnał fluorescencyjny pokazujący interakcję dwóch interesujących Cię białek.