Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest monitorowanie oddziaływania dwóch białek ekspresjonowanych w nienaruszonych liściach tytoniu. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie odpowiednich konstruktów, połączenie dwóch interesujących genów z rozdzielonymi białkami fluorescencyjnymi i transformację tych konstruktów do bakterii z rodzaju Agrobacterium. W drugim kroku kultury Agrobacterium są mieszane i wstrzykiwane do liści tytoniu, co prowadzi do ekspresji białek i odtworzenia sygnału fluorescencyjnego.

Jeśli białka znajdą się w bliskim sąsiedztwie, następnie analizuje się pod mikroskopem całe liście lub izolowane protoplasty. Otrzymane wyniki wykazują oddziaływania białko-białko na podstawie emitowanego sygnału fluorescencyjnego wykrywanego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ko-immunoprecypitacja lub system dwuhybrydowy drożdżowy, jest możliwość bezpośredniego monitorowania oddziaływań białko-białko w żywej komórce roślinnej.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak formowanie się kompleksów białkowych w różnych przedziałach komórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować bakterie agro do transformacji liści tytoniu. W sterylnym probówce o pojemności 50 ml zaszczepić 10 ml podłoża LB zawierającego odpowiednie antybiotyki 50 µL zamrożonej w glicerolu kultury AG L one zawierającej interesujący plazmid.

Inkubować w temperaturze 28°C przez co najmniej 24 godziny, wstrząsając z prędkością 190 RPM, aż do momentu uzyskania następnego dnia hodowli o gęstości OD 600 między 1,0 a 2,0. Bakterie odwirować przy 3000 ×g przez 15 minut. Po odlaniu supernatantu, osad zawiesić w świeżo przygotowanym medium do infiltracji i dostosować gęstość zawiesiny do OD 600 wynoszącej 1,0.

Inkubuj komórki bakterii agro w wytrząsarce przez dwie godziny w ciemności w temperaturze pokojowej w celu infiltracji liści tytoniu. Wybierz kilka starszych liści z trzytygodniowej rośliny tytoniu. Wymieszaj równe objętości.

Po trzy mililitry bakterii agrobacterium zawierających interesujące konstrukty. Napełnić strzykawkę o pojemności 5 mL bez igły mieszaniną zawiesiny komórkowej, aby przeprowadzić infiltrację zawiesiny komórkowej do liści tytoniu. Ostrożnie docisnąć strzykawkę do dolnej strony liści w kilku miejscach, podlać rośliny i pozostawić je pod przykryciem, w miejscu chronionym przed światłem, na dwa dni.

Aby wyizolować protoplasty z infiltrowanego liścia, najpierw umieścić liść w czarce Petriego i dodać świeżo przygotowany roztwór enzymów. Za pomocą nowej żyletki pociąć liść na kawałki o powierzchni około 0,5 cm². Następnie przenieść kawałki liścia wraz z roztworem enzymów do próżni.

Kolba do infiltracji. Infiltruj próżniowo przez około 20 sekund, aż z liści zaczną wydostawać się pęcherzyki powietrza. Bardzo ostrożnie przerwij próżnię.

Po 90 minutach inkubuj kolbę przez 90 minut przy 40 RPM w ciemności w temperaturze pokojowej. Uwolnij protoplasty, potrząsając przez jedną minutę przy 90 RPM. Przefiltruj roztwór przez gazę do 15 mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem.

Na roztwór protoplastów nałożyć dwa mililitry buforu FPCN i wirować przez 10 minut przy 70 ×g z wolnym przyspieszaniem i zwalnianiem w temperaturze pokojowej. Nienaruszone protoplasty zgromadzą się na granicy faz między roztworem enzymów a buforem FPCN. Używając końcówki do pipety o szerokim wylocie o pojemności jednego mililitra, przenieść nienaruszone protoplasty do nowej probówki do wirowania. Aby zapewnić powodzenie tej procedury, należy zawsze używać białych końcówek o szerokim wylocie, aby zapobiec rozerwaniu nienaruszonych protoplastów.

Napełnij probówkę buforem W five, a następnie wiruj przez dwie minuty przy 100 ×g z wolnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Aby osadzić protoplasty, ostrożnie usuń nadsącz i resuspenduj osad w około 200 µl buforu W five, zależnie od ilości protoplastów.

Aby przygotować próbkę protoplastów do mikroskopii laserowej, w pierwszej kolejności nanieś dwa małe paski uszczelniacza w odstępie około dwóch centymetrów na szkiełko przedmiotowe. Nanieś 20 µL zawiesiny protoplastów pomiędzy paski i ostrożnie przykryj całość szkiełkiem nakrywkowym. Paski uszczelniacza zapobiegną zmiażdżeniu protoplastów przez szkiełko nakrywkowe.

Aby przygotować próbkę całego liścia do mikroskopii skaningowej laserowej, należy wyciąć fragment liścia o długości jednego centymetra i umieścić go na szkiełku przedmiotowym stroną dolną liścia do góry. Należy dodać około 30 µL wody. Następnie nakłada się szkiełko nakrywkę i mocno przytwierdza ją z obu stron taśmą klejącą.

Obrazowanie wykonuje się przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego typu MICCA TCS SP five dla uzyskania powiększenia. Należy użyć obiektywu o powiększeniu 63 x z glicerolem jako medium obrazującym oraz oprogramowania Leica application suite advanced fluorescent do analizy. Laser Argonne należy ustawić na 30%, a moc lasera przy 488 nanometrach na intensywność 18%. Aby monitorować sygnał przy 515 nanometrach, należy ustawić szerokość pasma emisji pierwszego detektora PMT w zakresie od 495 do 550 nanometrów.

W celu monitorowania autofluorescencji chlorofilu należy ustawić szerokość pasma emisji drugiego detektora PMT w zakresie od 650 do 705 nanometrów. Aby monitorować sygnał M cherry, należy użyć lasera HENI 5 61.

Ustaw natężenie lasera na 18% oraz szerokość pasma emisji trzeciego detektora PMT w zakresie od 587 do 610 nanometrów. Upewnij się, że zdjęcia ze wszystkich kanałów detektora PMT są wykonywane przy tych samych ustawieniach wzmocnienia. Wzmocnienie powinno wynosić od 800 do 900, aby wyeliminować sygnały tła.

Należy pozyskać obrazy w tym formacie, o szerokości i wysokości 1024 na 1024 pikseli, przy prędkości skanowania 100 hertz. W przypadku stosów Z (Z-stacking) należy zastosować maksymalną odległość 0,5 mikrona pomiędzy poszczególnymi przekrojami. W niniejszym badaniu zastosowano metodę BFC w celu monitorowania interakcji cytozolowej białkowej chaperony HSP 90 z białkami dokującymi błonowymi TPR 7 oraz TPR 64.

Jak pokazano na tym schemacie, Venus jest połączony z częścią cytozolową TPR7, która znajduje się w siateczce śródplazmatycznej, lub z 64, która znajduje się w zewnętrznej osłonce chloroplastu. Hs.P 90 jest połączony N-końcem z SCFP, co umożliwia oddziaływanie domen TPR białek 64 i TPR7 z C-końcem HSP 90. Sam SCFP jest eksprymowany w cytozolu jako kontrola negatywna w celu weryfikacji lokalizacji kompleksu białkowego TPR7 i HSP 90. Białka TPR7 i HSP 90 zostały współtransformowane z markerem ER.

Fluorescencję monitorowano w nienaruszonych liściach jako kontrolę. Sam SCFP był ekspresowany wraz z TPR seven oraz markerem ER. Na wszystkich przedstawionych obrazach pasek skali odpowiada 10 mikronom.

Panele po lewej stronie przedstawiają zrekonstytuowaną fluorescencję w kolorze zielonym monitorowaną przy 515 nanometrach. Marker ER jest widoczny w kolorze czerwonym. Na panelach środkowych pokazano nałożenie obu sygnałów, a na panelach prawych.

Zrekonstytuowany sygnał dla TPR7 wraz z HSP90 monitorowano w obszarach nakładania się z markerem ER, co objawiało się kolorem żółtym. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano sygnału dla TPR7 oraz w przypadku kontroli negatywnej w postaci CFP. W kolejnym przykładzie białko chloroplastowe TOX64 wykazano w koekspresji z HSP90 w ramach kontroli.

Tox 64 wykazano w koekspresji z samym SCFP. Podobnie jak wcześniej, monitorowano odtworzoną fluorescencję w kolorze zielonym przy 515 nanometrach. Środkowe panele przedstawiają autofluorescencję chlorofilu monitorowaną przy 480 nanometrach.

Na prawych panelach przedstawiono nałożenie obu sygnałów w kolorze czerwonym. Rekonstytuowaną fluorescencję zaobserwowano w komórkach koekspresujących tox 64 i HSP 90, ale nie w komórkach koekspresujących wyłącznie tox 64 i SCFP.

Ponieważ dokładna lokalizacja tox 64 i HSP 90 jest trudna do określenia na zdjęciach mikroskopowych całych liści, do mikroskopii fluorescencyjnej wyizolowano protoplasty z infiltrowanych liści tytoniu. Podobnie jak wcześniej, monitorowano odtworzoną fluorescencję przy 515 nanometrach oraz autofluorescencję chlorofilu przy 480 nanometrach, a następnie utworzono obrazy nałożone, jak pokazano na tym obrazie nałożonym, gdzie tox 64 i HSP 90 można zidentyfikować jako struktury w kształcie pierścienia otaczające chloroplasty.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania konstruktów, transformacji liści tytoniu oraz optymalnej wizualizacji sygnału fluorescencyjnego wykazującego oddziaływanie dwóch badanych białek.