Name: Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej do wizualizacji interakcji białko-białko w żywych liściach tytoniu. Technika ta umożliwia monitorowanie interakcji białek w czasie rzeczywistym w komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Jürgenowi Sollowi za pomocne dyskusje i Chrisowi Carrie za krytyczną lekturę rękopisu. Projekt ten został sfinansowany przez DFG i Fonds der chemischen Industrie (granty o numerach SFB 1035, projekt A04 dla S.S. i Do 187/22 dla R.S.).

1. Transformacja konstruktów BiFC w agrobakteriach
<ol>
	<li>Klonowanie konstruktów BiFC
	<ol>
		<li>Amplifikować interesujący nas gen z odpowiedniej matrycy za pomocą oligonukleotydów zawierających flankujące miejsca attB. Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy korektoracyjnej. Dostosuj długość etapu wyżarzania do zaprojektowanej kombinacji podkładu, a długość etapu wydłużania do wielkości fragmentu. Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyść go za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.</li>
		<li>Przeprowadź reakcję BP z otrzymanym fragmentem i wektorem wejściowym za pomocą rekombinazy BP. Zmieszać 15-150 ng produktu attB-PCR ze 150 ng wektora wejściowego, dodać 2 μl rekombinazy BP i wypełnić buforem TE do całkowitej objętości 8 μl. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję, dodając 2 μl proteinazy K przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przekształć całą reakcję w kompetentne komórki DH5α E. coli i przebadaj uzyskane kolonie za pomocą PCR kolonii pod kątem prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA do wektora. Sekwencjonowanie DNA plazmidów dodatnich przeprowadza się w celu sprawdzenia braku mutacji.</li>
		<li>Użyj uzyskanego klonu wejściowego do rekombinacji LR z odpowiednim wektorem docelowym za pomocą rekombinazy LR. Zmieszać 50-150 ng wektora wejściowego ze 150 ng wektora docelowego, dodać 1 μl rekombinazy LR i wypełnić buforem TE do całkowitej objętości 5 μl. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję, dodając 1 μl proteinazy K przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przekształć całą reakcję w kompetentne komórki E. coli DH5α i przebadaj uzyskane kolonie za pomocą PCR kolonii w celu prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA do wektora. Na tym etapie sekwencjonowanie DNA nie jest konieczne.</li>
		<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu plazmidu Mini, aby zapewnić wysoki stopień czystości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie chemicznie kompetentnych agrobakterii (szczep AGL1, odporność na ryfampicynę i karbenicylinę)
	<ol>
		<li>Usunąć agrobakterie z kultury podstawowej i rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Zaszczepić 5 ml pożywki LB pojedynczą kolonią i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Zaszczepić 50 ml pożywki LB 2 ml kultury na noc i rosnąć przez około 4 godziny w temperaturze 28 °C do OD600 1,0.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 1 ml wysterylizowanego, lodowatego CaCl2 (10 mM). Po tym kroku utrzymuj komórki na lodzie.</li>
		<li>Przygotować podwielokrotności (100 μl) komórek, natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformacja chemicznie kompetentnych agrobakterii
	<ol>
		<li>Rozmrozić jedną podwielokrotność kompetentnych komórek AGL1 na lodzie. Dodaj 1-2 μg plazmidowego DNA do komórek. Inkubować przez 5 minut na lodzie, 5 minut w ciekłym azocie i 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 600 μl pożywki LB do komórek i wstrząsać z prędkością 650 obr./min przez 4 godziny w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Odwirować komórki przez 1 minutę przy 8 000 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 50 μl pozostałej pożywki LB i ułożyć ją na płytkach LB zawierających odpowiednie antybiotyki. Uszczelnić płytki i inkubować przez 2 dni w temperaturze 28 °C. Przesiać kolonie na obecność plazmidu metodą PCR kolonii.</li>
		<li>Zaszczepić jedną dodatnią kolonię w 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki i inkubować w temperaturze 28 °C przez noc. Zmieszać 500 μl nocnej kultury z 500 μl 50% wysterylizowanego glicerolu i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zaszczepić agrobakterie w pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki bezpośrednio z glicerolu do przejściowej przemiany liści tytoniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przejściowa przemiana liści tytoniu
<ol>
	<li>Wzrost agrobakterii
	<ol>
		<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe: acetosyringon (150 mM, rozpuścić w 70% EtOH), przechowywać w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 °C. MES/KOH (0,1 M) pH 5,7, przechowywać w temperaturze 4 °C (sterylny filtr przez filtr 0,2 μM, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas dłuższego przechowywania), MgCl2 (1 M), przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zaszczepić 10 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki 50 μl podstawowej kultury glicerolu AGL1 zawierającej plazmid będący przedmiotem zainteresowania w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i inkubować w temperaturze 28 °C przez co najmniej 24 godziny, wytrząsając z prędkością 190 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 między 1,0-2,0</li>.
		<li>Odwirować bakterie przy 3 000 x g przez 15 min. Zawiesić osad w świeżo przygotowanym podłożu infiltracyjnym [MgCl2 (10 mM), MES/KOH (10 mM) pH 5,7, acetosyringon (150 μM)] i dostosować zawiesinę do OD600 1,0.</li>
		<li>Inkubuj komórki agrobakterii w wytrząsarce nad głową przez 2 godziny w ciemności. Komórki mogą być następnie wykorzystane do infiltracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infiltracja liści tytoniu
	<ol>
		<li>Używaj trzytygodniowych sadzonek tytoniu (Nicotiana benthamiana). Wybierz kilka starszych liści do infiltracji.</li>
		<li>Wymieszać równe objętości agrobakterii przenoszących interesujące nas konstrukty (po 3 ml każdy). Weź strzykawkę o pojemności 5 ml bez igły do infiltracji. Zawiesinę komórkową należy ostrożnie wprowadzić do liści tytoniu, naciskając strzykawkę na spodniej stronie liści w kilku miejscach.</li>
		<li>Podlej rośliny i pozostaw je w ciemności na dwa dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie Protoplastu
Preparat protoplastowy z liści tytoniu został zaadaptowany z Koop et al.16 i nieznacznie zmodyfikowane.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę F-PCN: makrosole [KNO3 (1012 μg/ml), CaCl2•2H2O (440 μg/ml), MgSO4•7H2O (370 μg/ml), KH2PO4 (170 μg/ml), NH 4-bursztynian [(20 mM; przygotować 2 M roztwór podstawowy (bursztynian (236 μg/ml) i NH4Cl (106 μg/ml), dostosować do pH 5,8 do rozpuszczenia)], Mikrosole [EDTA-Fe(III) x Na-sól (40 μg/ml), KJ (0,75 μg/ml), H3BO3 (3 μg/ml), MnSO4•H2O (10 μg/ml), ZnSO4•7H2O (2 μg/ml), Na2MoO4•7H2O (0,25 μg/ml), CuSO4•5H2O (0,025 μg/ml), CoCl2•6H2O (0,025 μg/ml)], MES (390 μg/ml), glukoza (około 80 μg/ml), osmolarność 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę F-PIN: Wszystkie składniki jako F-PCN, ale zamiast glukozy użyj sacharozy (około 110 μg/ml), osmolarność 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę W5: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolarność 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C (sterylny filtr przez filtr 0,2 μm, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas dłuższego przechowywania).</li>
		<li>Przygotować świeży roztwór enzymu do izolacji protoplastów (0,1 g celulazy, 0,03 g macerozymu w 10 ml F-PIN). Inkubować roztwór w temperaturze 55 °C przez 10 minut i schłodzić do temperatury suchej. Dodać 100 μl 10% BSA do 10 ml roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja protoplastów
	<ol>
		<li>Umieść jeden naciekany liść na szalce Petriego i dodaj świeży roztwór enzymu. Użyj nowej żyletki, aby pokroić liść na około 0,5 cm2 kawałki. Przenieść kawałki liści z roztworem enzymu do kolby do infiltracji próżniowej i infiltrować próżniowo przez około 20 sekund, aż z liści wyłonią się pęcherzyki powietrza (bardzo ostrożnie uwolnić próżnię).</li>
		<li>Potrząsać kolbą przez 90 minut przy 40 obr./min w ciemności.</li>
		<li>Uwolnić protoplasty, wstrząsając przez 1 minutę przy 90 obr./min. Przefiltrować roztwór przez gazę (100 μM) do 15 ml probówki wirówkowej (okrągłe dno).</li>
		<li>Nałożyć roztwór protoplastu na 2 ml buforu F-PCN i odwirowywać przez 10 minut przy 70 x g (powolne przyspieszanie i zwalnianie) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nienaruszone protoplasty gromadzą się na granicy faz roztworu enzymatycznego i F-PCN. Weź końcówkę pipety o pojemności 1 ml z szerokim otworem, aby przenieść nienaruszone protoplasty do świeżej probówki wirówkowej i napełnić buforem W5. Wirować przez 2 minuty przy 100 x g (powolne przyspieszanie i zwalnianie) w celu osadzania protoplastów.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i zawiesić osad w buforze W5 o pojemności około 200 μl, w zależności od ilości protoplastów.</li>
		<li>Zawsze używaj końcówek kryz z szerokimi otworami, aby zapobiec pękaniu nienaruszonych protoplastów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Laserowa mikroskopia skaningowa
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Wklej dwa małe paski szczeliwa wokół szkiełka mikroskopowego (w odległości 2 cm od siebie). Umieść 20 μl roztworu protoplastu między paskami i ostrożnie umieść na nich szklankę nakrywającą. Paski szczeliwa zapewniają, że protoplasty nie zostaną zgniecione przez szkło nakrywkowe.</li>
		<li>Aby uzyskać całkowitą ilość próbek liści, odetnij 1 cm kawałek od liścia i umieść go na szkiełku mikroskopowym dolną stroną liścia skierowaną do góry. Dodać około 30 μl H2O, umieścić szklankę nakrywkową na wierzchu i mocno przymocować taśmą klejącą po obu stronach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne i ustawienia mikroskopu
	<ol>
		<li>Obrazowanie wykonywane jest za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego firmy Leica, typu: TCS SP5. Do powiększenia należy użyć soczewki obiektywowej (HCX, PL, APO, CS) o jasności 63X z glicerolem jako medium obrazowania. Ustaw przysłonę numeryczną na 1,3. Do oceny należy użyć pakietu Leica Application Suite/Advanced Fluorescence (patrz Dane uzupełniające S1).</li>
		<li>Ustaw laser argonowy na 30%, a moc lasera na 488 nm na intensywność 18%, aby monitorować odtworzony sygnał BiFC przy 515 nm i ustaw szerokość pasma emisji jednego detektora PMT w zakresie 495-550.</li>
		<li>Aby monitorować autofluorescencję chlorofilu, ustaw szerokość pasma emisji drugiego detektora PMT w zakresie 650-705.</li>
		<li>Do monitorowania sygnału mCherry użyj lasera HeNe 561, ustaw intensywność lasera 561 na 18%, a pasmo emisji trzeciego detektora PMT od 587-610.</li>
		<li>Upewnij się, że zdjęcia wszystkich kanałów detektora PMT są wykonane z tymi samymi ustawieniami wzmocnienia (wzmocnienie powinno wynosić od 800 do 900, aby wykluczyć sygnały tła).</li>
		<li>Rób zdjęcia w formacie szerokość/wysokość 1024 x 1024 pikseli z prędkością skanowania 100 Hz.</li>
		<li>W przypadku układania w stosy w kształcie litery Z należy zachować maksymalną odległość 0,5 μm między każdym stosem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li>
<li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ABCG+transporters%2C+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids%2C+dimerize+in+different+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li>
<li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li>
<li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li>
<li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li>
<li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Planując eksperyment BiFC, należy wziąć pod uwagę kilka punktów. Chociaż nie są wymagane żadne informacje strukturalne o białkach będących przedmiotem zainteresowania, topologia musi być znana podczas pracy z białkami obejmującymi błonę. Białka fluorescencyjne muszą znajdować się w tym samym przedziale subkomórkowym lub być skierowane po tej samej stronie błony, aby umożliwić interakcję. Oczywiście, analizując białka, które wymagają N-końcowej sekwencji docelowej, można wziąć pod uwagę tylko znacznik C-końcowy. Ponieważ ...

Badanie powstawania kompleksów białkowych i ich lokalizacji w komórkach roślinnych in vivo jest niezbędne do badania sieci komórkowych, sygnalizacji i procesów metabolicznych. BiFC umożliwia wizualizację interakcji białko-białko w ich naturalnym środowisku bezpośrednio w żywej komórce roślinnej1-5.
W podejściu BiFC uzupełnienie dwóch niefluorescencyjnych N- i C-końcowych fragmentów białka fluorescencyjnego prowadzi do odtworzonego białka fluorescencyjnego. Do wykrywania oddziaływań białkowych wykorzystano fragmenty wielu różnych białek fluorescencyjnych, np. białka zielonej fluorescencji (GFP), którego chromofor jest chemicznie utworzony przez trzy odrębne reszty6. Białka fluorescencyjne można podzielić na pół w pętli lub ß-nici, aby uzyskać dwa niefluorescencyjne fragmenty, które można połączyć z obydwoma interesującymi białkami. Test może być stosowany do wykrywania interakcji w dowolnym przedziale subkomórkowym w dowolnym organizmie lub komórkach rosnących tlenowo, które można genetycznie modyfikować w celu ekspresji białek fuzyjnych. Jeśli te dwa białka znajdą się w bliskim sąsiedztwie w komórce, fluorescencja jest odtwarzana i może być monitorowana pod mikroskopem bez dodatku egzogennych fluoroforów lub barwników3.
Tytoń (Nicotiana benthamiana) okazał się wygodnym organizmem modelowym do wizualizacji interakcji białek roślinnych, ponieważ białka mogą być łatwo wyrażane poprzez wykorzystanie przemiany liści tytoniu za pośrednictwem agrobacterium z wygenerowanymi konstruktami. Agrobakterie wykorzystują tak zwany plazmid Ti (indukujący nowotwór) kodujący enzymy, które pośredniczą w transdukcji interesującego genu do komórek roślinnych. BiFC ma dobre zastosowanie zarówno do białek rozpuszczalnych, jak i błonowych we wszystkich przedziałach komórkowych i był z powodzeniem stosowany w ostatnich latach do identyfikacji oddziałujących białek in vivo, a także do analizy miejsc interakcji w białkach7-9. Po ekspresji wprowadzonych genów można uwidocznić interakcję białek fluorescencyjnych bezpośrednio w liściach, co jest odpowiednie dla większych struktur komórkowych, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER), błona plazmatyczna lub chloroplasty. Jednak, aby monitorować lokalizację w bardziej wyrafinowanych strukturach, na przykład otoczce chloroplastowej, zaleca się wizualizację fluorescencji w protoplastach wyizolowanych z przekształconych liści tytoniu. Zestaw wektorów BiFC zawierających C-końcowy lub N-końcowy znacznik fluorescencyjny musi być użyty do podejścia BiFC w roślinach10. Opisany poniżej protokół został wykorzystany do zbadania interakcji cytozolowego białka szoku cieplnego 90 (HSP90) z domeną powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) zawierającą białka dokujące Toc64 i AtTPR7 znajdujące się odpowiednio w zewnętrznej otoczce chloroplastu i retikulum endoplazmatycznym11-13. W tym celu HSP90 został połączony z C-końcową częścią SCFP (SCFPC). Znacznik został N-końcowy połączony z opiekunem, aby zapewnić dostęp motywu wiązania C-końcowego MEEVD HSP90 do domen TPR typu zaciskowego. Równolegle N-końcowa część Wenus (WenusN) została połączona z cytozolowymi domenami domeny TPR zawierającymi odpowiednio białka dokujące Toc64 i AtTPR7. Jako kontrolę ujemną sklonowaliśmy rozpuszczalną C-końcową część SCFPC, która znajduje się wyłącznie w cytozolu, a zatem jest odpowiednią kontrolą.
Znaczniki fluorescencyjne badanych białek muszą być zwrócone w stronę tego samego przedziału komórkowego, aby umożliwić zbliżenie się i tym samym odtworzenie sygnału fluorescencyjnego. Aby określić lokalizację odtworzonego sygnału fluorescencyjnego, białko markerowe połączone z innym znacznikiem fluorescencyjnym może zostać przekształcone w celu zademonstrowania subkomórkowej lokalizacji oddziaływania. Białko markerowe ER połączone z mCherrry zostało przekształcone jednocześnie w przypadku ER zlokalizowanego w TPR714. Autofluorescencja chlorofilu posłużyła jako marker chloroplastowy w przypadku Toc64. Dzięki temu można nie tylko monitorować in vivo oddziaływanie Toc64 i AtTPR7 odpowiednio z cytozolowym opiekunem HSP90 bezpośrednio w liściach tytoniu, ale także można zbadać subkomórkową lokalizację interakcji.
BiFC dobrze nadaje się jako uzupełnienie innych metod badania oddziaływań białko-białko. W porównaniu na przykład z koimmunoprecypitacją lub eksperymentami in vitro typu pull-down, dla białek będących przedmiotem zainteresowania nie muszą być dostępne żadne specyficzne przeciwciała, a białka nie muszą ulegać rekombinowanej ekspresji in vitro, co może być trudne, zwłaszcza w przypadku białek błonowych. Co więcej, za pomocą BiFC można również monitorować interakcje przejściowe, ponieważ białka są wychwytywane przez interakcję połączonych znaczników fluorescencyjnych15.

<table><tbody><tr><td>3&#039;,5&#039;-Dimetoksy-4&#039;-hydroksyacetofenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Acetosyringone</td></tr><tr><td>Cellulase, Onozuka-R10</td><td>Serva</td><td>16419</td><td>od Trichoderma viridae</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10&nbsp;</td><td>Serva</td><td>28302</td><td>firmy Rhizopus sp.</td></tr><tr><td>GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-(020)</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11791-(020)</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609-250</td><td></td></tr><tr><td>pDEST-GWVYNE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-VYNE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-SCYCE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr></tbody></table>

interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Wiele białek przejściowo oddziałuje z innymi białkami lub jest zintegrowanych w kompleksy wielobiałkowe, aby spełniać swoje biologiczne funkcje. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) to metoda monitorowania takich interakcji in vivo w komórkach roślinnych. W przedstawionym protokole badane białka kandydujące są łączone z komplementarnymi połówkami białek fluorescencyjnych, a odpowiednie konstrukty są wprowadzane do komórek roślinnych w procesie transformacji za pośrednictwem agrobacterium. Następnie białka ulegają przejściowej ekspresji w liściach tytoniu, a przywrócone sygnały fluorescencyjne można wykryć za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w nienaruszonych komórkach. Pozwala to nie tylko na wizualizację samej interakcji, ale także na określenie subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych. W tym celu geny markerowe zawierające znacznik fluorescencyjny mogą być koeksprymowane wraz z konstruktami BiFC, wizualizując w ten sposób struktury komórkowe, takie jak retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, aparat Golgiego lub błona plazmatyczna. Sygnał fluorescencyjny może być monitorowany bezpośrednio w komórkach naskórka liści lub w pojedynczych protoplastach, które można łatwo wyizolować z przekształconych liści tytoniu. BiFC idealnie nadaje się do badania interakcji białko-białko w ich naturalnym otoczeniu w żywej komórce. Należy jednak wziąć pod uwagę, że ekspresja musi być napędzana przez silne promotory i że partnerzy interakcji są modyfikowani w wyniku fuzji stosunkowo dużych znaczników fluorescencyjnych, co może zakłócać mechanizm interakcji. Niemniej jednak BiFC jest doskonałym podejściem uzupełniającym do innych powszechnie stosowanych metod badania interakcji białko-białko, takich jak koimmunoprecypitacja, testy in vitro pull-down lub eksperymenty z drożdżami i dwiema hybrydami.

W tym przykładzie zastosowano metodę BiFC do monitorowania oddziaływania cytoplazmatycznego chaperonu molekularnego HSP90 z białkami dokującymi błony AtTPR7 i Toc64. Białko AtTPR7 jest elementem translokonu Sec i oddziałuje z chaperonami cytoplazmatycznymi, które prawdopodobnie dostarczają prebiałka wydzielnicze do translokacji potranslacyjnej do błony ER. Podobnie białko Toc64 w zewnętrznej osłonce chloroplastów uczestniczy w imporcie potranslacyjnym, odbierając powiązane z HSP90 prebiałka chloroplastowe. Oba białka pos...

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest monitorowanie oddziaływania dwóch białek ekspresjonowanych w nienaruszonych liściach tytoniu. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie odpowiednich konstruktów, połączenie dwóch interesujących genów z rozdzielonymi białkami fluorescencyjnymi i transformację tych konstruktów do bakterii z rodzaju Agrobacterium. W drugim kroku kultury Agrobacterium są mieszane i wstrzykiwane do liści tytoniu, co prowadzi do ekspresji białek i odtworzenia sygnału fluorescencyjnego.Jeśli białka znajdą się w bliskim sąsiedztwie, następnie analizuje się pod mikroskopem całe liście lub izolowane protoplasty. Otrzymane wyniki wykazują oddziaływania białko-białko na podstawie emitowanego sygnału fluorescencyjnego wykrywanego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ko-immunoprecypitacja lub system dwuhybrydowy drożdżowy, jest możliwość bezpośredniego monitorowania oddziaływań białko-białko w żywej komórce roślinnej.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak formowanie się kompleksów białkowych w różnych przedziałach komórkowych. Aby rozpocząć tę p

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkowe komplementowanie fluorescencji w protoplastach i liściach tytoniu

Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji...

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Poznaj metodę dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej do wizualizacji interakcji białko-białko w żywych liściach tytoniu. Technika ta umożliwia monitorowanie interakcji białek w czasie rzeczywistym w komórkach roślinnych.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Przeglądaj więcej filmów