Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych
1 maja 2014
Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie in vitro klastrów perełkowych serca pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym 3D i wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Osiąga się to poprzez hodowlę i namnażanie embrionalnych komórek macierzystych, aż utworzą one ciała Embry'ego. Następnie dudniące klastry są preparowane i powlekane na porowatych filtrach POLITETRAFLUOROETYLENU lub PTFE, co pozwala na utrzymanie ich jako powietrza przez długi czas.
Ciekłe kultury, które następnie biją klastry, są znakowane nanocząstkami harmonicznymi w celu przeprowadzenia mikroskopii wielofotonowej w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki pozwalają na analizę wydłużenia przestrzennego i częstości skurczów serca w skali mikroskopowej. Główną zaletą tych nanocząstek jest to, że można użyć dowolnej długości fali, zwłaszcza podczerwieni, dzięki czemu można wejść głębiej w tkankę, a także są one bardzo stabilne w czasie.
Dzięki temu możemy monitorować nasze długie procesy w długich ramach czasowych. Ta metoda hodowli komórek macierzystych może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie funkcjonalnego skurczu kardiomiocytów w trzech wymiarach. W szczególności dojrzewanie serca i inżynieria tkankowa.
Osoby posiadające nową metodę chorobową powinny mieć świadomość, że procedura znakowania nanocząstkami harmonicznymi może być stosowana tylko do mikroskopii wielofotonowej i nie może być przeniesiona do innego rodzaju systemów obrazowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł wykorzystania nanocząstek harmonicznych w 2005 roku. Te nanocząstki mają przewagę w stosunku do barwników fluorescencyjnych i kropek kwantowych.
W rzeczywistości ich sygnał nie zanika z czasem i mogą być używane do monitorowania rozwijających się próbek przez długi czas. Wizualna demonstracja przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie dla skuteczności i odtwarzalności różnych etapów, w szczególności podczas przeprowadzania testów na obecność narkotyków, i może być również stosowana do różnych tkanek lub chorób. Modelowanie tkankowe.
Po wyhodowaniu i namnażaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub ESC zgodnie z protokołem tekstowym i inkubacji ich z ciepłą kolagenazą, cztery przez 10 minut, zbierz fragmenty kolonii w dwóch mililitrach świeżego różnicowania, pożywki lub DM i wiruj przy 115-krotności grawitacji przez trzy minuty. Kultura, kolonia rozpada się w zawieszeniu w ultra niskich przyczepach. Sześć dołków na cztery dni, aby umożliwić im utworzenie ciał zarodkowych lub ebs.
Następnie połóż nowo utworzony EBS na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach przez 15 do 30 dni, aż pojawią się bijące grona. Usuń PBS i za pomocą acutusa rozdziel kolonie na pojedyncze komórki po odwirowaniu i resus, zawieszając komórki na pożywce DM po dwa mililitry na agro. Dobrze komorować i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień.
Zebrać nowo utworzony EBS i poszczepić po trzy na basenie na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach po dwóch do czterech tygodniach w hodowli. Zidentyfikuj skupiska bijących kardiomiocytów i za pomocą wydłużonej, ostro ściętej pipety do pasty, ręcznie je wypreparuj. Umieść cztery filtry PTFE na wkładkę i umieść każdy z nich w studzience z sześciodołkową płytką.
Po dodaniu jednego mililitra DM do każdego, dobrze dodaj jeden wypreparowany klaster do ubijania na każdym filtrze PTFE. Aby oznaczyć klastry, przenieś filtry PTFE z dudniącymi klastrami do naczynia ze szklanym dnem o grubości 3,5 centymetra. Dodaj jeden mililitr nanocząstek drugiej harmonicznej w ilości 50 mikrogramów na mililitr i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przeprowadzić nieliniowe obrazowanie optyczne.
Po przeniesieniu znakowanych HEB lub klastrów bicia serca do komory obrazowania, użyj obrazowania szerokokątnego w świetle białym w celu zidentyfikowania interesujących struktur w zróżnicowanych EBS lub aktywnych klastrach dudnienia. Wykonaj szybkie skanowanie trójwymiarowe o niskiej rozdzielczości, aby odbudować ogólną morfologię klastra sercowego i wybierz płaszczyznę obrazu w objętości klastra z kilkoma widocznymi nanocząstkami generacji drugiej harmonicznej do monitorowania w czasie rzeczywistym. Skurcze klastra serca ustawiają skaner optyczny mikroskopu w najszybszym trybie, umożliwiając wielohercową akwizycję dwuwymiarowych obrazów.
Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania MATLAB zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, przed oceną aktywności dudnienia. Charakterystyka nieliniowej odpowiedzi optycznej filtrów PTFE jest przeprowadzana w celu zapewnienia, że goły substrat do fluorescencji fotonów jest bardzo słaby i nie może przeszkodzić w pomiarze odpowiednich próbek biologicznych i emisji z izolacji. Nanocząstki drugiej generacji harmonicznej można łatwo uzyskać, obrazując przez podłoże w trybie detekcji epi.
Na tym rysunku nanocząstki drugiej generacji harmonicznej oznaczone strukturami serca i EBS są wyświetlane na ostrzu. Kolory czerwony, żółty i zielony odpowiadają autofluorescencji NADH, podczas gdy intensywnie niebieskie plamki drugiej harmonicznej pochodzą z izolowanych nanocząstek generacji drugiej harmonicznej. Zwróć uwagę na dobry kontrast optyczny i stosunkowo rzadkie znakowanie w porównaniu z kropkami kwantowymi lub nanocząstkami o konwersji w górę.
Rysunek ten ilustruje wycinek nanocząstek drugiej generacji harmonicznych oznaczonych jako klaster bicia serca. Jak pokazano w tym filmie, struktury 3D są rejestrowane z dużą prędkością, aby monitorować wzorzec skurczu w drugiej komórce. Nanocząstki generujące harmoniczne agregują się w celu utrzymania wysokiej szybkości akwizycji w celu rozdzielczości ruchu NP.
Ogólna czułość akwizycji nie była wystarczająca do zarejestrowania autofluorescencji komórek z emisją drugiej harmonicznej z drugiej generacji harmonicznej. Analiza obrazu nanocząstek przeprowadzona na klatkach filmu wskazuje, że w obrębie tej samej grupy sercowej przemieszczenia są rzędu kilku mikrometrów, a częstotliwość jest stała dla ruchu nanocząstek generacji drugiej harmonicznej w tle i poza nim. Po opanowaniu techniki przygotowania komórek, klaster zakładów rozwarstwia powietrzną hodowlę płynów powietrznych i jagnięcie można wykonać w ciągu 24 do 36 godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.
Szczególnie w przypadku tej techniki należy unikać kontaktu z otwartym powietrzem, aby zapobiec zanieczyszczeniom. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak zapisy elektrofizjologiczne przy użyciu wielu matryc elektrod, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak korelacja profili potencjału czynnościowego z częstotliwością dudnień w trzech wymiarach. Nasza nowatorska technika oparta na wykrywaniu sygnału nieliniowego przez nanocząstki harmoniczne może być dalej rozwijana w badaniach in vivo
.Jednym z możliwych osiągnięć może być integracja struktury pochodzącej z komórek macierzystych do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół in vitro znaczenia komórek macierzystych ludzkich zarodkowych (hESCs) przy użyciu nanocząstek generujących drugą harmoniczną. Szczegółowo opisuje metody badania hESCs poprzez mikroskopię wielofotonową i ich różnicowanie w skupiska kardiomioków.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Biologia układu krążenia
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Ludzkie komórki macierzyste zarodkowe mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Monitorowanie skupień kardiomioków jest kluczowe dla zrozumienia rozwoju serca.
- Nanocząstki generujące drugą harmoniczną oferują zalety w obrazowaniu.
- Mikroskopia wielofotonowa zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną dla analizy w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Monitorowanie skupień kardiomioków pochodzących od hESCs w czasie rzeczywistym.
- Analiza przedłużania przestrzennego i częstotliwości skurczów serca.
- Wykorzystanie nanocząstek do głębszego obrazowania tkanek.
Zastosowane metody
- Hodowla i rozmnażanie hESCs w ciała zarodkowe.
- Rozpinanie i osadzanie skupień kardiomioków na porowatych filtrach PTFE.
- Znaczenie skupień kardiomioków nanocząstkami harmonicznymi.
- Przeprowadzanie mikroskopii wielofotonowej w czasie rzeczywistym w celu analizy.
Główne wyniki
- Skuteczne monitorowanie skurczów serca w skali mikroskopijnej.
- Wykazana stabilność nanocząstek w czasie.
- Możliwość użycia różnych długości fal dla głębszej penetracji tkanek.
- Wgląd w dynamikę zachowania skupień kardiomioków.
Konkluzje
- Metodologia pozwala na efektywne monitorowanie skupień kardiomioków in vitro.
- Nanocząstki generujące drugą harmoniczną zwiększają możliwości obrazowania.
- To podejście może poszerzyć zrozumienie rozwoju serca z komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
