Name: Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę etykietowania ludzkich komórek macierzystych embriogenicznych nanocząstkami harmonicznymi do mikroskopii wielofotonowej. Technika umożliwia monitorowanie skurczów klastrów kardiomiocytów w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za częściowe dofinansowanie z Europejskiego Projektu Badawczego 7PR NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) oraz projektu INTERREG IV Francja-Szwajcaria NAOMI.

1. Kultura i ekspansja ludzkiego ESC
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do rozmnażania komórek (zwaną PM) zawierającą Knockout DMEM uzupełnioną 20% surowicą nokautową, 1% aminokwasami endogennymi MEM, 1% L-glutaminą 200 mM, 1% penicyliną-streptomycyną i 3,5 μl β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Rozmrozić ludzki ESC (hESC) w 8 ml pożywki PM i odwirować je przez 5 minut przy 115 x g, aby odrzucić pożywkę do zamrażania uzupełnioną DMSO.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki PM zawierającej 10 mM inhibitora skał, aby zapobiec apoptozie i poprawić przeżywalność komórek po rozmrożeniu (tylko 24-godzinna inkubacja).</li>
	<li>Dodać podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) do PM w żądanym stężeniu (4-10 ng / ml) w celu utrzymania pluripotencji.</li>
	<li>Umieścić hESC na napromieniowanych ludzkich komórkach żywiących napletek (γHFF) (Figura 1A), uprzednio posianych w stężeniu 2 x 104 komórek/cm2.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj podłoże i, jeśli to konieczne, usuwaj porcje kolonii, które zaczynają różnicować się przez aspirację, za pomocą wydłużonej, ostro ściętej pipety Pasteura.</li>
	<li>Raz w tygodniu pasuj kolonie enzymatycznie:
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i inkubować je z 0,5 ml ciepłej kolagenazy dożylnej na dożylną w dawce 1 mg/ml przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Zebrać fragmenty kolonii w 2 ml nowego PM i odwirować przy 115 x g przez 3 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, kolonie mogą być przepasywane mechanicznie przez skrobanie:
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.</li>
		<li>Ręcznie zeskrob kolonie za pomocą narzędzia do skrobaka rolkowego StemPro EZPassage (Rysunek 1B).</li>
		<li>Zebrać fragmenty kolonii i odwirować przez 3 minuty przy 115 x g w celu usunięcia supernatantu.</li>
		<li>Umieść fragmenty na γHFF lub przetwórz je w celu różnicowania w ciała zarodkowe (EB).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół różnicowania ludzkiego ESC
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę różnicującą (DM) za pomocą Knockout DMEM uzupełnionego 2% surowicą Hyclon, 1,0% aminokwasami endogennymi MEM, 1,0% L-glutaminą 200 mM, 1% penicyliną-streptomycyną, 3,5 μl β-merkaptoetanolem.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.</li>
	<li>Tworzenie EB fragmentów kolonii w zawiesinie:
	<ol>
		<li>Usunąć PBS i inkubować je z 0,5 ml ciepłej kolagenazy dożylnej na dożylną w dawce 1 mg/ml przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Zebrać fragmenty kolonii w 2 ml nowej masy i odwirować przy 115 x g przez 3 min.</li>
		<li>Hodować je w zawiesinie na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim nasadce (2 ml na dołek) przez 4 dni (ryc. 1C).</li>
		<li>Zebrać i poszczepić nowo uformowane EB na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach (około 3 EB/dołek) (Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, wymuszona agregacja pojedynczych komórek w EB za pomocą płytki Aggrewell:
	<ol>
		<li>Usuń PBS i zdysocjuj kolonie na pojedyncze komórki za pomocą akutazy (0,5 ml / dołek).</li>
		<li>Odwirować i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,2 x 106/ml.</li>
		<li>Dodać 2 ml na komorę Aggrewell przez 1 dzień (Rysunek 1B').</li>
		<li>Zebrać nowo uformowane EB (Rysunek 1C') i umieścić je na 0,1% pokrytych żelatyną płytkach 24-dołkowych (około 3 EB/basenik).</li>
		<li>Zmieniaj DM co 2-3 dni, aż do pojawienia się bijących skupisk kardiomiocytów (15-30 dni).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Powietrzno-cieczowe kultury 3D ubijania klastrów i etykietowania za pomocą HNP
<ol>
	<li>Zidentyfikuj i ręcznie wypreparuj skupiska bijących kardiomiocytów (ryc. 1D), zwykle pojawiające się po 2-4 tygodniach hodowli, używając wydłużonej, ostro ściętej pipety Pasteura.</li>
	<li>Umieść 4 filtry PTFE na wkładkę, która zostanie umieszczona na płytce 6-dołkowej (Rysunek 1F).</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki DM na wierzch każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać po jednym wypreparowanym klastrze dudnienia na każdym filtrze PTFE (rysunek 1E), maksymalnie 4 dołki, tj. 24 agregaty na płytkę (rysunek 1F').</li>
	<li>Zmieniaj medium DM co 2-3 dni.</li>
	<li>Aby oznaczyć klastry, wyjmij filtr PTFE zawierający duplikat i umieść go na szklanym naczyniu o grubości 3,5 cm (grubość 170 μm).</li>
	<li>Dodawać 1 ml HNP o stężeniu 50 μg/ml przez 30 min.</li>
</ol>
4. Nieliniowe obrazowanie optyczne
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki. Po znakowaniu HNP (patrz krok 3.6) przenieść albo całe różnicujące wczesne hEBs, albo klastry bicia serca (wypreparowane po pojawieniu się skurczu) na filtrach PTFE na naczyniu ze szklanym dnem o grubości 170 μm, zgodnym z odległością roboczą obiektywów o dużej aperturze numerycznej. Alternatywnie, nałóż bezpośrednią warstwę ubitych kiścien na naczynie ze szklanym dnem wstępnie pokrytym 0,1% żelatyną.</li>
	<li>Przenieś próbki do mikroskopu typu "wszystko w jednym" wyposażonego w komorę inkubacyjną zapewniającą stabilną temperaturę, wilgotność i kontrolę CO2 przez dłuższy czas.</li>
	<li>Po wstępnej inspekcji zobrazuj próbkę za pomocą obrazowania szerokokątnego w oświetleniu światłem białym, aby zidentyfikować interesujące struktury w zróżnicowanych EB lub aktywnych klastrach dudnienia, które zostaną wybrane do dalszych badań.</li>
	<li>Jeśli autofluorescencja komórek z NADH i SH z HNP musi być jednocześnie uzyskana, należy ustawić krótszą długość fali wzbudzenia laserowego (tj. 720 nm), aby dopasować ją do absorpcji molekularnej. Do wykrycia SH należy użyć jednego filtra spektralnego wąskoprzepustowego wyśrodkowanego na połowie długości fali wzbudzenia (tj. λ = 360 ± 10 nm), a drugiego do wykrywania autofluorescencji.</li>
	<li>Najpierw wykonaj szybkie, trójwymiarowe skanowanie o niskiej rozdzielczości, aby odbudować ogólną morfologię klastra sercowego i wybierz płaszczyznę obrazu w objętości klastra z kilkoma widocznymi HNP.</li>
	<li>W razie potrzeby należy swobodnie zmieniać długość fali wzbudzenia, aby jak najlepiej dopasować ją do właściwości optycznych próbki lub uniknąć fotowybielania, fotouszkodzeń i obrazowania głębiej w tkankach za pomocą długości fali IR (tj. 790 nm) i odpowiednio wymienić drugi filtr harmonicznych (tj. 395 nm). Zoptymalizuj ustawienia wstępnego kompresora impulsów laserowych przy wybranej długości fali roboczej, maksymalizując sygnał drugiej harmonicznej HNP osadzonych na próbce.</li>
	<li>Aby monitorować skurcze klastra sercowego w czasie rzeczywistym, ustaw skaner optyczny mikroskopu w najszybszym trybie, takim jak tryb rezonansowy, co pozwala na szybką akwizycję obrazów dwuwymiarowych.</li>
	<li>Wybierz ustawienia, które są najlepszym kompromisem między kontrastem obrazu a szybkością akwizycji, takie jak:
	<ul type="dysk">
		<li>Uśrednianie skanów: 4</li>
		<li>Czas przebywania piksela: 0,1 μsec</li>
		<li>Szybkość obrazu: 3,75 klatki na sekundę (fps)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Moc lasera jest dostosowywana w zależności od wielkości plamki ogniskowej i prędkości skanowania. 50 mW (mierzona przy wejściu do obiektywu) to typowa wartość dla czasu przebywania piksela 0,1 μs, a obiektyw Plan APO 20X N.A. 0,75 zachowuje żywotność komórek.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Procedura kalibracji osiowej. Wybierz pojedynczy HNP osadzony na gołym podłożu. Dostosuj ostrość (tj. pozycję osiową nanocząstki), aby zmaksymalizować intensywność SH. Zmieniać w kontrolowany sposób położenie osiowe stolika mikroskopu, aby uzyskać krzywą kalibracyjną odnoszącą się do intensywności SH w funkcji przesunięcia HNP od płaszczyzny ogniskowej. Dane wyjściowe tej procedury kalibracji dla obiektywu Plan APO 20X N.A. 0,75 przedstawiono na rysunku 4C.</li>
	<li>Wybierz HNP obecne we wszystkich klatkach wideo i określ ich okresowe ruchy. Procedurę tę można łatwo zautomatyzować, na przykład za pomocą niestandardowego kodu wyszukującego punkty o maksymalnej intensywności sygnału w zdefiniowanym obszarze zainteresowania i łączącego je między różnymi ramkami (przedstawiono przykładowy kod napisany w Matlabie R2009 b przy użyciu funkcji 'region props' w Image Processing Toolbox).</li>
	<li>Ocenić ilościowe przemieszczenia poza płaszczyzną, związane z niemożliwymi do śledzenia HNP poruszającymi się wzdłuż osi optycznej, poprzez przeliczenie ich modulacji intensywności w różnych układach na przemieszczenie osiowe przy użyciu krzywej kalibracyjnej ustalonej w kroku 5.1. Należy pamiętać, że ta procedura umożliwia dostęp do ruchów osiowych, ale nie może być używana do określania kierunku bezwzględnego (w górę lub w dół).</li>
</ol>

<ol><li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+Fe%28IO3%293+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B-Lasers+and+Optics%22%5BJournal%5D)">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li>
<li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li>
<li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechno%22%5BJournal%5D)">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li>
<li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li>
<li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generating+%28SHG%29+nanoprobes+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).</li>
<li>Baumner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evanescent-field-induced+second+harmonic+generation+by+noncentrosymmetric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles.</a> Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).</li>
<li>Le Xuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostable+second-harmonic+generation+from+a+single+KTiOPO4+nanocrystal+for+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy.</a> Small. 4, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Sandeau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+imaging+of+second+harmonic+generation+from+a+single+nanocrystal%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal.</a> Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).</li>
<li>Johnson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-field+imaging+of+nonlinear+optical+mixing+in+single+zinc+oxide+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires.</a> Nano Lett. 2, 279-283 (2002).</li>
<li>Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanocrystals+for+nonresonant+nonlinear+optical+microscopy+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+C%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine.</a> J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).</li>
<li>Bonacina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+Nanomedecine%3A+Harmonic+Nanoparticles+toward+Targeted+Diagnosis+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceut%22%5BJournal%5D)">Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy.</a> Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHG+nanoprobes%3A+advancing+harmonic+imaging+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology.</a> Bioessays. 34, 351-360 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Photon+Laser+Scanning+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Magouroux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Tracking+of+Murine+Cardiac+Stem+Cells+by+Harmonic+Nanodoublers%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers.</a> Small. 8, 2752-2756 (2012).</li>
<li>Staedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic+Nanocrystals+for+Biolabeling%3A+A+Survey+of+Optical+Properties+and+Biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility.</a> Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).</li>
<li>Extermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodoublers+as+deep+imaging+markers+for+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy.</a> Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).</li>
<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy%3A+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+%3A+sapphire+and+Cr+%3A+forsterite+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li>
<li>Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+opportunities%3A+The+use+of+Nanotechnologies+to+manipulate+and+track+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).</li>
<li>Kaur, S., Singhal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+nano+meets+stem%3A+The+impact+of+nanotechnology+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology.</a> J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).</li>
<li>Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Invasive+Imaging+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechno%22%5BJournal%5D)">Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells.</a> Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).</li>
<li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li>
<li>Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+mesenchymal+stem+cells+by+bioconjugated+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots.</a> Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).</li>
<li>Zimmer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li>
<li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li>
<li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li>
<li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upconverting+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie nanotechnologii w badaniach nad komórkami macierzystymi jest stosunkowo nową, ale szybko rozwijającą się dziedziną. Jak wskazano w różnych artykułach przeglądowych na ten temat, zastosowanie nanocząstek może być stosowane do realizacji różnych zadań badawczych, począwszy od śledzenia komórek (zarówno in vitro , jak i in vivo), po wewnątrzkomórkowe dostarczanie białek i genów, w tym tworzenie biomimetycznych środowisk komórkowych do preferencyjnej stymulacji/hamowania określonych szlaków róż...

Systemy mikroskopii nieliniowej, dzięki swoim nieodłącznym możliwościom trójwymiarowego cięcia, coraz częściej wywołują popyt na fotostabilne fluorofory z dwufotonowymi pasmami absorpcyjnymi w bliskiej podczerwieni. Dopiero w ciągu ostatnich kilku lat, w celu uzupełnienia prac nad znacznikami opartymi na fluorescencji (barwniki, kropki kwantowe, nanocząstki konwertujące w górę), inna metodologia obrazowania wykorzystuje nową rodzinę z natury nieliniowych nanocząstek jako znaczników, tj. nanocząstek harmonicznych (HNP), które zostały opracowane specjalnie do mikroskopii wielofotonowej. Znaczniki te, oparte na nieorganicznych kryształach niecentrosymetrycznych, wywierają kontrast optyczny, generując SH częstotliwości wzbudzenia: na przykład poprzez przekształcenie frakcji pulsacyjnego światła wzbudzenia w bliskiej podczerwieni (λ = 800 nm) na widzialne światło niebieskie (λ/2 = 400 nm). Kilku autorów w niedalekiej przeszłości testowało różne materiały, w tym jodan żelaza Fe(IO3)3 1, niobian potasu (KNbO3)2, niobian litu (LiNbO3)3, tytanian baru (BaTiO3)4,5, fosforan tytanylu potasu (KTiOPO4, KTP)6-8 i tlenek (ZnO)5,9,10. W porównaniu z sondami fluorescencyjnymi, HNP posiadają szereg atrakcyjnych właściwości, takich jak całkowity brak bielenia i mrugania, wąskie pasma emisji, możliwość przestrajania długości fali wzbudzenia (od ultrafioletu do podczerwieni), zdolność odzyskiwania orientacji i spójna odpowiedź optyczna. Te unikalne właściwości zostały niedawno wyjaśnione w dwóch obszernych pracach przeglądowych11,12. Możliwość pracy w zakresie widma podczerwieni, która zwiększa głębię obrazowania poprzez minimalizację rozpraszania i absorpcji, również drastycznie ogranicza fotodegradację próbki13,14. Co więcej, nieskończenie stabilny sygnał gwarantowany przez HNP sprawia, że są to idealne sondy do długoterminowego śledzenia komórek, co jest szczególnie atrakcyjne w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej15.
W tym wizualizowanym eksperymencie, szczegóły protokołu są podane dla znakowania in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą niefunkcjonalizowanych HNP. Synteza i otrzymywanie zawiesin koloidalnych jest szczegółowo opisana w poprzedniej publikacji oraz w piśmiennictwie16 i wykracza poza zakres niniejszej pracy. Przedstawiono metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe (utrzymywane jako długoterminowe kultury powietrzno-cieczowe). Ludzki ESC może różnicować się w obrębie tzw. ciał zarodkowych (EB) na dwa różne sposoby, albo poprzez tworzenie fragmentów kolonii w zawiesinie, albo alternatywnie, wymuszoną agregację pojedynczych komórek w EB za pomocą płytki Aggrewella, jak pokazano na rysunku 1A. Hodowla bijących klastrów komórek serca na porowatych filtrach z politetrafluoroetylenu (PTFE) ułatwia ich długoterminowe utrzymanie do dalszych badań (na przykład elektrofizjologicznych pomiarów potencjałów czynnościowych).
Źródło wzbudzenia mikroskopu skaningowego powinno być w stanie dostarczyć ultrakrótkie impulsy (o czasie trwania impulsu mniejszym niż 300 fsec na próbce) w celu osiągnięcia szczytowej mocy potrzebnej do wykonania obrazowania drugiej harmonicznej HNP. Na przykład najczęstszym źródłem fsec używanym do obrazowania są przestrajalne lasery Ti:Sapphire. Alternatywnie można zastosować inne ultraszybkie lasery, na przykład erbium ion17, chrome forsterite18 lub pompowane Ti:sapphire optyczne oscylatory parametryczne na podczerwień. Mikroskop może być wyposażony w obiektyw o najlepiej dość dużej aperturze numerycznej. Co bardzo ważne, przed pomiarami i za każdym razem, gdy obiektyw jest wymieniany, konieczne jest zminimalizowanie dyspersji występującej w ustawie (soczewkach) poprzez optymalizację ustawień kompresora wstępnego impulsów laserowych przy wybranej długości fali roboczej. Ta procedura, szczegółowo opisana w protokole, zapewnia, że impuls laserowy jest jak najbardziej zbliżony do ograniczonego czasu trwania transformacji (tj. najkrótszy, jak to możliwe) w płaszczyźnie ogniskowej i maksymalizuje nieliniową odpowiedź próbki.
Celem analizy obrazu opisanej na końcu protokołu jest zidentyfikowanie i śledzenie w 3D HNPs ruchów związanych z rytmicznymi skurczami bijących klastrów sercowych. Śledzenie nanocząstek w płaszczyźnie obrazu odbywa się w prosty sposób poprzez identyfikację ich położenia w kolejnych klatkach filmu. Aby uzyskać informacje o ruchu osiowym, konieczna jest wcześniejsza kalibracja nieliniowej odpowiedzi natężenia w funkcji przemieszczenia osiowego. Należy zauważyć, że w przypadku pomiarów długoterminowych wymagana jest aktywna interferometryczna kontrola położenia osiowego próbki w celu utrzymania ważności krzywej kalibracyjnej w obecności dryftów termicznych i/lub mechanicznych.
Użyte tutaj HNP do śledzenia bijących komórek w agregatach są oparte na tlenku niobianu potasu (KNbO3), ale inne dostępne nieliniowe nanomateriały są szczegółowo analizowane w pracy Staedler et al16.
Nieliniowa wydajność optyczna większości dotychczas badanych nanomateriałów jest bardzo porównywalna. Wybór KNbO3 był zasadniczo motywowany dobrą stabilnością roztworu koloidalnego i jego dobrą biokompatybilnością, testowaną na kilku ludzkich liniach komórkowych nawet przy dość wysokim stężeniu i długim czasie ekspozycji16.
Biorąc pod uwagę nowatorstwo nanomateriału użytego do tej pracy, główne cechy HNP w porównaniu do fluorescencyjnych/luminescencyjnych biomarkerów są pokazane w krótkiej oryginalnej animacji komputerowej zrealizowanej przez autorów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Inkubator Mikroskopowy</td><td>OKO LAB</td><td>UNO (górny stopień)</td><td>37 &deg; C, 5% CO2, nawilżany</td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy</td><td>Nikon</td><td>AR1-MP</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie skanowanie, cztery detektory bez fotopowielacza Filtry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SHG i autofluorescencji</td><td>Semrock</td><td>FF01-360/12-25</td><td></td></tr><tr><td>FF01-395/11-25&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FF02-485/20-25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy mikroskopowe</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td><td></td><td>NA 0.30, WD 16 mm,</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo 20X</td><td></td><td></td><td>NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td></tr><tr><td>CFI Apo 40X</td><td></td><td></td><td>NA 1.25, WD 0.18 mm &lambda; S, Inhibitor Rhock powłoki nanokrystalicznej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Serum do nokautu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak rolkowy&nbsp;</td><td>StemPro EZPassage, Instrukcja</td><td>obsługi 23181-010</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>System Gibco</td><td>S11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td></td></tr><tr><td>Serum z hydronu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Żelatynowe</td><td>płytki 6-dołkowe Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe&nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z politetrafluoroetylenu (PTFE)</td><td>Millipore</td><td>NA76/25</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

W tym wizualizowanym eksperymencie, szczegóły protokołu są podane do znakowania in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą nanocząstek drugiej harmonicznej generacji (HNP). Te ostatnie to nowa rodzina sond wprowadzonych niedawno do znakowania próbek biologicznych do obrazowania wielofotonowego. HNP są zdolne do podwojenia częstotliwości światła wzbudzenia w nieliniowym procesie optycznym generowania drugiej harmonicznej bez ograniczeń długości fali wzbudzenia.
Metodologie oparte na wielu fotonach do różnicowania hESC w klastry sercowe (utrzymywane jako długoterminowe hodowle powietrzno-płynne) są szczegółowo przedstawione. W szczególności przedstawiono dowody na to, jak zmaksymalizować intensywną emisję drugiej harmonicznej (SH) izolowanych HNP podczas monitorowania 3D bijącej tkanki serca w 3D. Szczegółowa jest również analiza wynikowych obrazów w celu pobrania wzorców przemieszczeń 3D.

Przed oceną aktywności skurczowej za pomocą obrazowania konfokalnego przeprowadzono dokładną charakterystykę nieliniowej odpowiedzi optycznej filtrów PTFE, zarówno pojedynczo, jak i w obecności HNPs w wysokim stężeniu (1 mg/ml). Upewniono się, że: i) fluorescencja dwufotonowa czystego podłoża jest bardzo słaba i nie przeszkadza w pomiarach odpowiednich próbek biologicznych oraz ii) emisję SH z wyizolowanych HNPs można łatwo zarejestrować, obrazując je przez podłoże w trybie detekcji epi (Rysunek 2). Cele...

Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.

Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie in vitro bijących skupisk kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w 3D i z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Osiąga się to poprzez uprawę i namnażanie embrionalnych komórek macierzystych aż do momentu utworzenia ciał embrionalnych. Następnie bijące skupiska są wycinane i wysiewane na porowate filtry z POLYTETRAFLUOROETHYLENE lub PTFE, co umożliwia ich długoterminowe utrzymywanie w warunkach napowietrzania.Następnie hodowle płynne z bijącymi skupiskami są znakowane nanocząstkami harmonicznymi w celu przeprowadzenia wielofotonowej mikroskopii w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki umożliwiają analizę przestrzennego wydłużenia oraz częstotliwości skurczów serca w skali mikroskopowej. Główną zaletą tych nanocząstek jest możliwość zastosowania dowolnej długości fali, zwłaszcza podczerwieni, co pozwala na głębszą penetrację tkanki, a ponadto charakteryzują się one wysoką stabilnością w czasie.Dzięki temu możemy monitorować długotrwałe procesy w rozciągniętych w czasie ramach czasowych. Ta metoda hodowli komórek macierzystych może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cząsteczki harmoniczne do badań regeneracyjnych

Wykazano, że pęsety plazmoniczne oraz nanostruktury kryształów fotonicznych zapewniają istotną poprawę wydajności i kontroli orientacji w optycznym chwytaniu mikro- i nanocząstek.

Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

Dokładne modelowanie struktur nanohelisowych jest ważne dla predykcyjnych badań symulacyjnych prowadzących do nowatorskich zastosowań nanotechnologii. Obecnie pakiety oprogramowania i kody są ograniczone w tworzeniu atomistycznych modeli spiralnych. Prezentujemy dwie procedury przeznaczone do tworzenia atomistycznych modeli nanohelisowych do symulacji, oraz interfejs graficzny do usprawnienia badań poprzez wizualizację.

Skalowalne nanohelisy do badań predykcyjnych i ulepszonej wizualizacji 3D

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.

Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

Prezentowany tutaj jest protokół wytwarzania mikropęcherzyków z nanocząsteczkami tlenku żelaza (NSM) poprzez samoorganizację, synergię reakcji magnetycznej, akustycznej i optycznej w jednej nanoterapeutycznej platformie do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej.

Mikropęcherzyki reagujące na magnesy, akustycznie i optycznie do hipertermii magnetycznej i potototermicznej skojarzonej terapii nowotworów

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Poznaj metodę etykietowania ludzkich komórek macierzystych embriogenicznych nanocząstkami harmonicznymi do mikroskopii wielofotonowej. Technika umożliwia monitorowanie skurczów klastrów kardiomiocytów w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

Przeglądaj więcej filmów