Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie in vitro bijących skupisk kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w 3D i z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Osiąga się to poprzez uprawę i namnażanie embrionalnych komórek macierzystych aż do momentu utworzenia ciał embrionalnych. Następnie bijące skupiska są wycinane i wysiewane na porowate filtry z POLYTETRAFLUOROETHYLENE lub PTFE, co umożliwia ich długoterminowe utrzymywanie w warunkach napowietrzania.

Następnie hodowle płynne z bijącymi skupiskami są znakowane nanocząstkami harmonicznymi w celu przeprowadzenia wielofotonowej mikroskopii w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki umożliwiają analizę przestrzennego wydłużenia oraz częstotliwości skurczów serca w skali mikroskopowej. Główną zaletą tych nanocząstek jest możliwość zastosowania dowolnej długości fali, zwłaszcza podczerwieni, co pozwala na głębszą penetrację tkanki, a ponadto charakteryzują się one wysoką stabilnością w czasie.

Dzięki temu możemy monitorować długotrwałe procesy w rozciągniętych w czasie ramach czasowych. Ta metoda hodowli komórek macierzystych może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu funkcjonalnego skurczu kardiomiocytów w trzech wymiarach, w szczególności w obszarze dojrzewania serca i inżynierii tkankowej.

Osoby wdrażające nową metodę badawczą powinny mieć świadomość, że procedura znakowania nanocząsteczkami harmonicznymi może być stosowana wyłącznie w mikroskopii wielofotonowej i nie może zostać przeniesiona do innych rodzajów systemów obrazowania. Pomysł wykorzystania nanocząsteczek harmonicznych pojawił się u nas po raz pierwszy w 2005 roku. Nanocząsteczki te wykazują zalety w stosunku do barwników fluorescencyjnych i kropek kwantowych.

W rzeczywistości ich sygnał nie zanika z upływem czasu i mogą one być wykorzystywane do monitorowania rozwijających się próbek w długich odstępach czasu. Wizualna demonstracja przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie dla wydajności i powtarzalności poszczególnych etapów, w szczególności podczas przeprowadzania testów leków, i mogłaby zostać zastosowana również do różnych tkanek lub chorób. Modelowanie tkanek.

Po wyhodowaniu i namnożeniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) zgodnie z protokołem tekstowym oraz inkubowaniu ich z ciepłą kolagenazą IV przez 10 minut, należy zebrać fragmenty kolonii w 2 mL świeżego medium różnicującego (DM) i odwirować przy 115 ×g przez 3 minuty. Fragmenty kolonii należy hodować w zawiesinie w płytkach 6-dołkowych o ultraniskiej adhezji przez cztery dni, aby umożliwić im utworzenie ciał embrionalnych (ebs).

Następnie świeżo utworzone EBS należy wysiać na 24-dołkowe płytki pokryte 0,1% żelatyną i inkubować od 15 do 30 dni, aż do pojawienia się bijących skupisk. Należy usunąć PBS, a następnie, używając acutus, rozdzielić kolonie na pojedyncze komórki po odwirowaniu i zawiesić komórki w medium DM, wlewając dwa mililitry do każdego dołka płytki i inkubując w temperaturze 37°C przez jeden dzień.

Zebrać nowo powstałe EBS i po dwóch do czterech tygodniach hodowli wysiać po trzy na płytkach 24-dołkowych powlekonych 0,1% żelatyną. Zidentyfikować skupiska bijących kardiomiocytów i odseparować je ręcznie, używając wydłużonej, ostro przyciętej pipety Pasteura. Umieścić po cztery filtry PTFE w każdym wkładzie, a następnie umieścić wkład w dołku płytki 6-dołkowej.

Po dodaniu jednego mililitra DM do każdej z nich, umieść jeden wypreparowany, pulsujący skupisk na każdym filtrze PTFE. Aby oznakować skupiska, przenieś filtry PTFE z pulsującymi skupiskami do szklanego naczynia z dnem o średnicy 3,5 centymetra. Dodaj jeden mililitr nanocząsteczek do generowania drugiej harmonicznej w stężeniu 50 µg/mL i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia nieliniowego obrazowania optycznego.

Po przeniesieniu znakowanych HEB lub bijących klastrów kardiologicznych do komory obrazowania, należy zastosować obrazowanie w szerokim polu pod oświetleniem białym, aby zidentyfikować interesujące struktury w obrębie zróżnicowanych EBS lub aktywnych bijących klastrów. Należy przeprowadzić szybkie trójwymiarowe skanowanie o niskiej rozdzielczości w celu odtworzenia ogólnej morfologii klastra kardiologicznego i wybrać w obrębie objętości klastra płaszczyznę obrazowania z kilkoma widocznymi nanocząsteczkami generującymi drugą harmoniczną w celu monitorowania ich w czasie rzeczywistym. Skurcze klastra kardiologicznego wymagają ustawienia skanera optycznego mikroskopu w trybie najszybszym, co umożliwia wielkohercową akwizycję obrazów dwuwymiarowych.

Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania MATLAB zgodnie z protokołem tekstowym, tak jak pokazano tutaj, przed oceną aktywności skurczowej. Przeprowadzono charakterystykę nieliniowej odpowiedzi optycznej filtrów PTFE, aby upewnić się, że fluorescencja tła samego podłoża jest bardzo słaba i nie uniemożliwia pomiaru istotnych próbek biologicznych oraz emisji z wyizolowanych nanocząstek generujących drugą harmoniczną, którą można łatwo zarejestrować poprzez obrazowanie przez podłoże w trybie detekcji epi.

Na tym rysunku przedstawiono struktury serca i EBS oznakowane nanocząsteczkami do generowania drugiej harmonicznej. Kolory czerwony, żółty i zielony odpowiadają autofluorescencji NADH, natomiast intensywne niebieskie punkty drugiej harmonicznej pochodzą od odizolowanych nanocząsteczek do generowania drugiej harmonicznej. Należy zwrócić uwagę na dobry kontrast optyczny oraz stosunkowo rzadkie oznakowanie w porównaniu z kropkami kwantowymi lub nanocząsteczkami konwersji w górę.

Rysunek ten przedstawia widok przekroju kardiologicznego klastra bijącego, znakowanego nanocząsteczkami generującymi drugą harmoniczną. Jak pokazano w tym filmie, struktury 3D są rejestrowane z dużą prędkością w celu monitorowania wzorca skurczu w drugiej komórce. Nanocząsteczki generujące drugą harmoniczną agregują, aby utrzymać wysoką szybkość akwizycji niezbędną do rozdzielenia ruchu nanocząsteczek.

Ogólna czułość akwizycji była niewystarczająca, aby zarejestrować autofluorescencję komórek wraz z emisją drugiej harmonicznej pochodzącą z generacji drugiej harmonicznej. Analiza obrazów nanocząstek przeprowadzona na klatkach filmu wskazuje, że w obrębie tego samego klastra kardiologicznego przesunięcia są rzędu kilku mikrometrów, a częstotliwość jest stała dla ruchu nanocząstek generujących drugą harmoniczną zarówno w płaszczyźnie, jak i poza nią. Po opanowaniu techniki przygotowania komórek, sekcję klastra, hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz oraz procesy końcowe można przeprowadzić w ciągu 24 do 36 godzin, jeśli zostaną one wykonane prawidłowo.

Szczególnie przy tej technice należy unikać kontaktu z otoczeniem, aby zapobiec kontaminacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rejestracje elektrofizjologiczne z użyciem mat wieloelektrodowych, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące korelacji profili potencjałów czynnościowych z częstotliwością skurczów w trzech wymiarach. Nasza nowatorska technika oparta na detekcji sygnału nieliniowego za pomocą nanocząstek harmonicznych może zostać dalej rozwinięta w badaniach in vivo, ponieważ długości fal używanych do obrazowania pozwalają na głębszą penetrację tkanek.

Jednym z możliwych kierunków rozwoju mogłoby być wykorzystanie zintegrowanych struktur pochodzących z komórek macierzystych w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej.