Name: Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj ilościowy test regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych. Ta metoda umożliwia badanie procesów regeneracji neuromastów i komórek rzęsowych w modelach chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi opisanymi w "Zasadach opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" (publikacja National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1985 roku) oraz zatwierdzonym protokołem 08-19 Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rosalind Franklin.
1. Gentamycyna - indukcja martwicy komórek włosa
<ol>
	<li>Przygotować siarczan gentamycyny w soli fizjologicznej o stężeniu końcowym 0,004% (4,32 mM).</li>
	<li>Umieścić dorosłe ryby (D. rerio, w wieku 4-6 miesięcy) w pojemniku zawierającym 0,004% (4,32 mM) roztwór gentamycyny. Można użyć dowolnego pojemnika, ale my używamy pojemnika na ryby z Pharmacal Aquatic System, który ma 7 cali szerokości, 6 cali wysokości i 7 cali długości. Umieścić pojemnik z rybami w inkubatorze ustawionym na 28 °C na 24 godziny. Ustaw całkowitą objętość płynu w zbiorniku na wystarczającym poziomie, aby utrzymać ryby w stanie żywotności przez okres 24 godzin. Uwaga: Napowietrzanie płynu gentamycyny nie jest konieczne, jeśli stosuje się wystarczającą objętość w stosunku do liczby leczonych ryb.</li>
</ol>
2. Istotne barwienie komórek rzęsatych
<ol>
	<li>Przygotować stężenie 0,08% (w roztworze soli fizjologicznej) fluorescencyjnego barwnika witalnego [4-4-dietyloaminostyryl)-N-metylopirydyny (wzbudzenie 485 nm λ i emisja λ 603 nm w metanolu) z roboczego roztworu podstawowego 15 mg/ml w etanolu.</li>
	<li>Aby ustalić, czy leczenie gentamycyną było skuteczne, podgrupa ryb kontrolnych i leczonych gentamycyną jest natychmiast barwiona poprzez umieszczenie ryb w studzience 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej niezbędny barwnik. Użyć wystarczającej liczby ryb (i płytek hodowlanych) zgodnie z wymaganiami do osiągnięcia istotności statystycznej. Opierając się na szybkości liczenia neuromastu przez badającego, umieść ryby na płytkach w sposób rozłożony w czasie, tak aby ryby nie były barwione przez ponad 75 minut, jak opisano w kroku 2.3.</li>
	<li>Umieścić płytki z kroku 2.2 w szufladzie ławki pod mikroskopem fluorescencyjnym, która ma być użyta do badania przebarwionych neuromasztów. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zapobiec gaszeniu ważnego barwnika w ciągu 1-godzinnego okresu barwienia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj zarówno zbiorniki na wodę do wypłukiwania, jak i znieczulającą. Woda do wymywania barwnika to normalna woda dla ryb, a w przypadku wody znieczulającej dodaj wystarczającą ilość 2-fenoksyetanolu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1,000 w normalnej wodzie dla ryb.</li>
	<li>Umieść ryby w nadmiarze normalnej wody dla ryb, aby wypłukać nadmiar barwnika przyżyciowego i przejdź do kroku 3.1 w celu obserwacji ryb poplamionych barwnikiem witalnym.</li>
	<li>Aby zbadać regenerację neuromasztów, należy przenieść ryby poddane działaniu gentamycyny, które zostały umyte w normalnej wodzie dla ryb, do inkubatora na 8-16 godzin w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>W różnych momentach między 8-16 godzinami ryby są wyjmowane z inkubatora, myte i barwione, jak wskazano w krokach 2.1-2.4. Przejdź do kroku 3.1 w celu obserwacji ryb barwionych barwnikiem życiowym.</li>
</ol>
3. Znieczulanie ryb i fluorescencyjne liczenie neuromasztów
<ol>
	<li>Osusz każdą rybę na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie umieść ją na zwilżonym kawałku bibuły filtracyjnej, który jest wyśrodkowany na pokrywie plastikowej szalki Petriego.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na stoliku fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby uzyskać cyfrowy obraz barwionych barwnikiem żywotnych neuromasztów szwów środkowej części ciała.</li>
	<li>Użyj kamery cyfrowej umieszczonej na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym, ustaw powiększenie 2X, aby uchwycić obrazy do późniejszej analizy ilościowej. Uwaga: Ustawienie powiększenia mikroskopu stereoskopowego może zależeć od marki używanego mikroskopu, ale ustawienie powinno umożliwiać łatwe oglądanie i liczenie poszczególnych neuromasztów w obrębie szwów środkowej części ciała.</li>
	<li>Określ stopień regeneracji, licząc liczbę widocznych neuromasztów w czterech wyznaczonych szwach na najniższej brzusznej stronie ryby, tuż obok prawej płetwy piersiowej (patrz ryc. 1). Do analizy statystycznej użyj odpowiedniego testu, takiego jak ANOVA lub test T-Studenta. W eksperymentach powinno brać udział co najmniej 5 ryb na punkt czasowy, a wszystkie eksperymenty powinny być powtarzane co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Opierając się na krzywej czasu regeneracji neuromastu (patrz ryc. 3), policz neuromasty między 8-16 godzinami po wypłukaniu gentamycyny, aby mieściły się w liniowej fazie krzywej regeneracji. Uwaga: Zastosowanie liniowej fazy czasowej pozwala na właściwą analizę ilościową pomiędzy grupą kontrolną i eksperymentalną.</li>
</ol>
4. Fluorescencyjne zliczanie pojedynczych komórek rzęsatych w celu uzyskania wyższej rozdzielczości analizy ilościowej, jeśli analiza Neuromastu nie jest statystycznie istotna
<ol>
	<li>Jeśli analiza ilościowa na poziomie neuromastów nie jest znacząca, analiza na poziomie pojedynczej komórki rzęsatej może być również wykorzystana w celu uzyskania wyższego stopnia rozdzielczości. Wybierz ryby w określonym punkcie czasowym po wypłukaniu gentamycyny (punkt czasowy oparty na wcześniejszych badaniach neuromastu), barwnik życiowy barwi ryby, jak opisano w Protokole 2, a następnie poddaj ryby eutanazji za pomocą 2-fenoksyetanolu w rozcieńczeniu 1:500 przez 1-5 minut.</li>
	<li>W przytłumionym świetle, aby zapobiec wygaszaniu, wykonaj cztery nacięcia, aby przygotować kwadratowy płat skóry w następujący sposób. Wykonaj nacięcie wzdłuż górnych żeber ryby, aż zrówna się z płetwami odbytu, następnie wykonaj nacięcie w poprzek brzucha, a na koniec wykonaj dwa pionowe nacięcia po każdej stronie tych nacięć, aby powstał kwadratowy płat skóry. Uwaga: Ten preparat skórny będzie zawierał szwy w środkowej części ciała używane w eksperymentach z neuromastem.</li>
	<li>Umieść próbkę skóry na szkiełku podstawowym, a następnie umieść okrągłą szklaną szkiełko nakrywkowe na wyciętej próbce skóry, aby pomóc zakotwiczyć i spłaszczyć tkankę do późniejszego obrazowania cyfrowego.</li>
	<li>Korzystając z próbek skóry z kroku 4.3, uzyskaj cyfrowe obrazy komórek rzęsatych w każdym neuromascie szwów środkowej części ciała. Wykonaj zdjęcia w powiększeniu co najmniej 60X, a następnie policz komórki rzęsate w poszczególnych neuromastach w celu porównawczej analizy ilościowej grup kontrolnych i eksperymentalnych (patrz ryc. 4).</li>
</ol>

<ol><li>Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lateral+Line+of+Zebrafish%3A+a+Model+System+for+the+Analysis+of+Morphogenesis+and+Neural+Development+in+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates.</a> Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).</li>
<li>Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+Processing+of+Water+Currents+by+Fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+Royal+Soc.+London+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory Processing of Water Currents by Fishes.</a> Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).</li>
<li>Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ototoxin-Induced+Cellular+Damage+in+Neuromasts+Disrupts+Lateral+Line+Function+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish.</a> Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).</li>
<li>Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Stimuli+and+the+Fish+Lateral+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line.</a> Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line.</a> PloS One. 7 (5), e36661(2012).</li>
<li>Raible, D. W., Kruse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Lateral+Line+System+in+Embryonic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).</li>
<li>Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li>
<li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li>
<li>Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signaling+Regulates+the+Extent+of+Hair+Cell+Regeneration+in+the+Zebrafish+Lateral+Line%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line).</a> J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feathers+and+Fins%3A+Non-Mammalian+Models+for+Hair+Cell+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration.</a> Brain Res. 1277, 12-23 (2009).</li>
<li>Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Better+Understanding+of+Human+Eye+Disease+Insights+From+the+Zebrafish%2C+Danio+Rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).</li>
<li>Mione, M. C., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+As+a+Model+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish As a Model for Cancer.</a> Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).</li>
<li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Zebrafish+As+a+Model+Organism+for+Behavioural+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics.</a> BMC. Neurosci. 11, (2010).</li>
<li>Mathur, P., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Zebrafish+As+a+Model+to+Understand+Mechanisms+of+Addiction+and%5BTitle%5D)+AND+%22Complex+Neurobehavioral+Phenotypes.+Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and.</a> Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).</li>
<li>Ignatius, M. S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+As+a+Model+for+Cancer+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal.</a> Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).</li>
<li>Milan, D. J., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Genetic+Models+for+Arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).</li>
<li>Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+Is+Ototoxic+to+All+Hair+Cells+in+the+Fish+Lateral+Line+System%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System.</a> Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).</li>
<li>Littleton, R. M., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+Nontraditional+Model+of+Traditional+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine.</a> J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).</li>
<li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line).</a> PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).</li>
<li>Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat3%2FSocs3a+Pathway+Is+a+Key+Regulator+of+Hair+Cell+Regeneration+in+Zebrafish+%5BCorrected%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected.</a> J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).</li>
<li>Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Dye+Staining+of+Neuromasts+in+Live+Fishes%3A+An+Aid+to+Systematic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ichthyol+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies.</a> Ichthyol Res. , 286-290 (2012).</li>
<li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Probes+That+Stain+Living+Nerve+Terminals%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals.</a> The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li>
<li>Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Mechanosensory+Hair+Cells+of+the+Zebrafish+Lateral+Line+to+Aminoglycosides+Reveals+Distinct+Cell+Death+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways.</a> Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li>
<li>Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).</li>
<li>Herrera, A. A., Banner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+and+Effects+of+Vital+Fluorescent+Dyes%3A+Observation+of+Motor+Nerve+Terminals+and+Satellite+Cells+in+Living+Frog+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles.</a> J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).</li>
<li>Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Vegetative+Hyphal+Fusion+in+Neurospora+Crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa.</a> Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+Regeneration+Is+Impaired+in+an+Adult+Zebrafish+Model+of+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus.</a> Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).</li>
<li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+Transmission+of+Diabetic+Metabolic+Memory+in+Zebrafish+Correlates+With+DNA+Hypomethylation+and+Aberrant+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression.</a> Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).</li>
</ol>

Praca ta została wsparta grantem badawczym z Iacocca Family Foundation, National Institutes of Health Grant DK092721 (dla R.V.I.) oraz funduszami start-upowymi Rosalind Franklin University. Nie zgłoszono żadnych potencjalnych konfliktów interesów związanych z tym artykułem. G.C.P., S.M.M. i N.D. badali dane. M.P.S. Jr. i RI nadzorowali projekt, przyczynili się do dyskusji na temat danych oraz nadzorowali pisanie i redagowanie manuskryptu.

Opierając się na obszernej literaturze, która została utworzona do analizy regeneracji linii bocznej (LL) u embrionalnych i larwalnych daniopręgowanych 8,24,25, celem naszego badania było opracowanie ilościowego testu regeneracji linii bocznej u danio pręgowanego, który można by zastosować do modeli choroby, które najlepiej bada się u dorosłych ryb. Stwierdziliśmy, że pewne punkty krytyczne są ważne przy stosowaniu procedur opracowanych dla ryb embrionalnych/larwalnych u ryb dorosłych. Najważniejsze z tych pun...

System linii bocznej (LL) to mechanosensoryczny organ występujący zarówno u ryb, jak i, który jest odpowiedzialny za słuch, równowagę, reotaksję i pośredniczenie w zachowaniach, takich jak nauka i unikanie drapieżników1-5. Składa się z klastrów komórek rzęsatych otoczonych komórkami podporowymi, z których oba są umieszczone w strukturach zwanychneuromastami 6. Te neuromaszty są zwykle zorganizowane w pionowe linie (zwane szwami) wzdłuż osi podłużnej ciała i ogona, z pewnymi poziomymi szwami obserwowanymi w głowie ryby. U dorosłych neuromastów jest znacznie więcej w obrębie szwów w porównaniu z rybami embrionalnymi lub larwalnymi6. Badania biomedyczne na danio pręgowanym koncentrowały się na wpływie leczenia antybiotykami, urazów wywołanych hałasem, przewlekłych infekcji itp. na komórkach rzęsatych7,8 w celu lepszego zrozumienia ich wpływu na ludzi.
W przeciwieństwie do większości kręgowców, teleosty, takie jak danio pręgowany (Danio rerio), mają zdolność do regeneracji utraconych komórek rzęsatych. Danio pręgowany jest szczególnie przydatny ze względu na szybki czas rozwoju i wysoką zdolność regeneracyjną. Do tej pory jednak; Badania nad rozwojem i/lub regeneracją linii bocznej koncentrowały się głównie na rybach w stadium embrionalnym i larwalnym ze względu na zmniejszoną liczbę neuromasztów linii bocznej, co pozwala na łatwiejsze liczenie i analizę6,9,10.
Jednakże, ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych11-16 jest badanych na dorosłych rybach, a nie na larwach, skupiliśmy się na opracowaniu testu regeneracyjnego linii bocznej u dorosłych ryb danio pręgowanego przy użyciu gentamycyny (aminoglikozydu poprzednio stosowanego u larw danio pręgowanego, a ostatnio stosowanego u dorosłych ryb17), aby dostępny był test, który można by zastosować do obecnych modeli choroby dorosłych ryb danio pręgowanego. Podczas gdy wcześniej opublikowane procedury Van Trump i wsp.17 ustalili warunki ablacji komórek rzęsatych u dorosłych ryb, nie ustalili standardowej krzywej regeneracji neuromastu, która jest wymagana do ilościowego porównania między grupą kontrolną a grupą doświadczalną, np. przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego lub farmakologicznie wywołanych stanów chorobowych u danio pręgowanego18. W związku z tym postępowaliśmy zgodnie z procedurami Van Trump i wsp.17 do ablacji komórek rzęsatych, ale oparli się na swojej pracy w celu ustalenia standardowej krzywej regeneracji neuromastu, aby umożliwić badaczom wykorzystanie naszych danych podczas porównywania grup kontrolnych i eksperymentalnych, takich jak modele choroby dorosłego danio pręgowanego. Test został również zaprojektowany tak, aby umożliwić rozszerzenie analizy na pojedynczą komórkę rzęsatą, gdy wymagany jest wyższy poziom rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Roztwór siarczanu gentamycyny (50 mg/ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2 Fenoksyetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>Jodek 4-4-Dietyloaminyrydylo-N-metylopirydyniowy (4-Di-2-Asp) w metanolu</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm wzbudzenie &lambda; i emisja 603 nm &lambda;</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Mid Sci</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia Microwell ze szklanym dnem</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Analizowanie&nbsp; Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>Każdy mikroskop preparacyjny jest w porządku.</td></tr><tr><td>Aparat do obrazowania</td><td>Obrazowanie Nikon</td><td>Q</td><td>Każdy aparat jest odpowiedni.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Odpowiednie jest dowolne oprogramowanie do obrazowania.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Odpowiedni jest dowolny mikroskop fluorescencyjny o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>System wodny</td><td>KG Aquatics ZFS Rack System</td><td></td><td>Można użyć dowolnego systemu wodnego</td></tr></tbody></table>

test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Ze względu na kliniczne znaczenie zaburzeń słuchu i równowagi u człowieka, organizmy modelowe, takie jak ryba pręgowany, zostały wykorzystane do badania rozwoju i regeneracji linii bocznej. Danio pręgowany jest szczególnie atrakcyjny do takich badań ze względu na szybki czas rozwoju i wysoką zdolność regeneracyjną. Do tej pory badania nad regeneracją linii bocznej na danio pręgowanym wykorzystywały głównie ryby w stadium embrionalnym i larwalnym ze względu na mniejszą liczbę neuromasztów na tych etapach. Ułatwiło to analizę ilościową regeneracji linii bocznej i/lub rozwoju we wcześniejszych stadiach rozwojowych. Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, skupiliśmy się na opracowaniu ilościowego testu regeneracyjnego linii bocznej u dorosłych danio pręgowanego, aby dostępny był test, który można by zastosować do obecnych modeli choroby dorosłego danio pręgowanego. Opierając się na wcześniejszych badaniach Van Trumpa i wsp.17, który opisywał procedury ablacji komórek rzęsatych u dorosłych meksykańskich ślepych ryb jaskiniowych i danio pręgowanego (Danio rerio), nasz test został zaprojektowany, aby umożliwić ilościowe porównanie między grupami kontrolnymi i eksperymentalnymi. Osiągnięto to poprzez opracowanie standardowej krzywej regeneracyjnego neuromastu opartej na procentowym ponownym pojawieniu się neuromastu w okresie 24 godzin po wywołanej gentamycyną martwicy komórek rzęsatych w określonym obszarze linii bocznej. Test został również zaprojektowany tak, aby umożliwić rozszerzenie analizy na poziom poszczególnych komórek rzęsatych, gdy wymagany jest wyższy poziom rozdzielczości.

Optymalizacja procedur ilościowego oznaczania regeneracji neuromastów linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych.
Neuromasty larwalne danio pręgowanego są łatwo mierzalne; jednakże linia boczna dorosłego danio pręgowanego posiada znacznie większą liczbę neuromastów na każdy szew, co utrudnia analizy ilościowe6,17,19,20. Jak widać na Rysunku 1A, głowa posiada znacznie większą liczbę neuromastów w porównaniu z sekcją środkową lub ogonem; region ogona...

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie ilościowego testu regeneracji linii bocznej, który można zastosować w modelu choroby dorosłych ryb danio-ostrobłysk. Osiąga się to najpierw poprzez ablację linii bocznej u dorosłych ryb danio-ostrobłysk poprzez poddanie ich 24-godzinnej kuracji Gentamycyną. Następnie Gentamycynę wypłukuje się, a rybom pozwala się na regenerację neuromastów przez różne okresy czasu w świeżej wodzie.Następnie ryby barwi się barwnikiem witalnym, aby zwizualizować regenerację linii bocznej w wyznaczonych punktach czasowych. Aby potwierdzić, że lek skutecznie zniszczył neuromasty, niektóre ryby należy zabarwić bezpośrednio po wypłukaniu gentamycyny. Następnie zlicza się neuromasty linii bocznych u ryb lub w preparatach skóry, wykorzystując obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.Na koniec grupy eksperymentalne są ilościowo porównywane z grupą kontrolną przy użyciu standardowej krzywej regeneracji neuro-mastów. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną i konfokalną do monitorowania regeneracji linii bocznej w modelach chorób u dorosłych rybek danio-ostrzeowatych. Opracowaliśmy tę technikę, aby zapewnić iloś

an-assay-for-lateral-line-regeneration-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Zdolny do funkcjonalnego powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego, dorosły danio pręgowany jest głównym modelowym systemem do wyjaśnienia wrodzonych mechanizmów regeneracji neuronów. Tutaj opisujemy testy wytrzymałości pływackiej i zachowania podczas pływania jako funkcjonalne odczyty regeneracji rdzenia kręgowego.

Ocena wytrzymałości pływackiej i zachowań związanych z pływaniem u dorosłych danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj ilościowy test regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych. Ta metoda umożliwia badanie procesów regeneracji neuromastów i komórek rzęsowych w modelach chorób neurologicznych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów