Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej
28 marca 2014
Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie oddziaływań fluorescencyjnych nanocząstek z subpopulacjami pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie badanych komórek nanocząstkami. W kolejnym kroku komórki są znakowane przeciwciałami przeciwko swoistym markerom powierzchniowym, a następnie analizowane metodą cytometrii przepływowej.
Ostatecznie można zmierzyć interakcję nanocząsteczek z poszczególnymi populacjami komórek odpornościowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest możliwość ilościowego określenia zmian natężenia fluorescencji indukowanych przez nanocząsteczki w nieprzylegających populacjach komórek. Aby zbadać internalizację nanocząsteczek w leukocytach krwi lub oczyszczonych monocytach, należy rozpocząć od wysiania 5 × 10⁵ wybranych komórek w 1 mL pożywki na każdą studzienkę płytki 12-dołkowej.
Następnie do każdej studzienki eksperymentalnej dodaj 10 µL świeżo przygotowanej roboczej zawiesiny fluorescencyjnych nanocząstek dwutlenku krzemu, dodając w tym samym czasie równą objętość pełnej pożywki do studzienek kontrolnych niepoddanych działaniu preparatu. Po jednej godzinnej internalizacji w temperaturze 37 °C przenieś próbki do oddzielnych probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 mL, a następnie odwiruj próbki przez trzy minuty przy 6 000 ×g w temperaturze pokojowej. Aby zabarwić komórki przeciwciałem anty-CD 14, inkubuj 100 µL każdej zawiesiny komórkowej z 10 µL przeciwciała ludzkiego w stosunku 1:11 w buforze do pomiaru przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała w 1 mL buforu do pomiaru, ponownie zawiesić komórki w 200 µL świeżego buforu do pomiaru w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.
Następnie, aby skonfigurować kompensację przenikania widmowego, otwórz okno ustawień instrumentu w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej, a następnie pobierz próbkę wolną od nanocząstek i nieoznaczoną przeciwciałem przy niskiej prędkości przepływu. Dostosowanie ustawień kompensacji w obecności fluorescencyjnych nanocząstek jest najtrudniejszą częścią procedury, ponieważ nanocząstki mogą zakłócać rozproszenie boczne; aby zapewnić sukces, należy zdefiniować bramkę dla interesującej populacji komórek. Ręcznie dostosuj rozproszenie przednie i boczne poprzez regulację kanałów napięcia. Następnie wyznacz odpowiednio dużą bramkę wokół pożądanej populacji komórek.
Załaduj kolejną nieoznaczoną próbkę i otwórz kartę kompensacji w oknie ustawień instrumentu. Reguluj współczynnik kompensacji podczas akwizycji, aż intensywność fluorescencji w kanale przelewowym będzie w przybliżeniu taka sama dla populacji pozytywnych i negatywnych pod kątem danego fluorochromu. Na koniec, po ustawieniu kompensacji dla każdej próbki kontrolnej barwionej pojedynczym fluorochromem, odczytaj próbki traktowane nanocząstkami; w celu lepszej charakterystyki zachowania leukocytów w odpowiedzi na nanocząstki przeprowadzono testy internalizacji, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.
Na przykład, w tym reprezentatywnym eksperymencie, po izolacji PBMC za pomocą rozpraszania światła w przód i pod kątem wyraźnie zidentyfikowano trzy główne subpopulacje leukocytów krwi. Co więcej, po traktowaniu fz dwutlenkiem krzemu limfocyty, monocyty i granulocyty wykazały różne tempo internalizacji nanocząstek, co wskazywała ich intensywność fluorescencji. Na tych obrazach przedstawiono internalizację nanocząstek w pierwotnych monocytach CD 14 pozytywnych oczyszczonych z PBMC.
Niniejsze wykresy punktowe przedstawiają monocyty CD 14-dodatnie w obecności nanocząsteczek dwutlenku krzemu fitz. Histogram ilustruje ilościowe oznaczenie komórek fitzy-dodatnich wyrażone jako intensywność fluorescencji. Analogiczne eksperymenty dotyczące internalizacji przeprowadzono z monocytami TP one traktowanymi zwiększającymi się stężeniami nanocząsteczek dwutlenku krzemu fitz, przyjmując komórki nietraktowane jako kontrolę negatywną.
Wykresy kropkowe ilustrują zależny od dawki wzrost rozpraszania bocznego przy niezmienionym rozpraszaniu przednim w linii komórkowej TP one po internalizacji nanocząstek. Dane z tych wykresów sugerują, że traktowanie nanocząstkami dwutlenku krzemu fitza indukuje zależną od dawki internalizację w monocytach, co objawia się zwiększeniem ziarnistości wewnątrzkomórkowej. Aby uzyskać dalsze informacje na temat oddziaływań między komórkami odpornościowymi a nanocząstkami, mikroglej hodowano in vitro przez siedem dni i inkubowano z nanocząstkami przez jedną godzinę. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała mieszaną pierwotną hodowlę komórek glejowych z dużą liczbą nieprzywierających astrocytów negatywnych pod kątem GFP oraz niektórymi komórkami pozytywnymi pod kątem GFP.
W tym reprezentatywnym eksperymencie za pomocą cytometrii przepływowej, przy zastosowaniu pojedynczego barwienia przeciwciałem CD 11 B, można było wyróżnić trzy subpopulacje glejowe: astrocyty i inne komórki glejowe CD 11 B-ujemne i GFP-ujemne, mikroglej czyli komórki CD 11 B-dodatnie i GFP-ujemne oraz subpopulację CD 11 B-dodatnią i GFP-dodatnią. Dwie ostatnie subpopulacje są zdolne do internalizacji nanocząsteczek, przy czym wydajność ta jest nieco wyższa w populacji GFP-dodatniej. Internalizację nanocząsteczek można dodatkowo zweryfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej, co zaprezentowano na tym obrazie przy użyciu nanocząsteczek dwutlenku krzemu znakowanych rodominą.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu próbek w ciemności, aby uniknąć blaknięcia barwników fluorescencyjnych, oraz o utrzymywaniu próbek w temperaturze czterech stopni podczas inkubacji z przeciwciałami. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząsteczek.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na oddziaływaniu fluorescencyjnych nanocząsteczek z subpopulacjami pierwotnych komórek układu odpornościowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia ilościowe określenie internalizacji nanocząsteczek w różnych komórkach odpornościowych, dostarczając informacji na temat ich zachowania.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Nanotechnologia
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Nanocząstki mogą być wykorzystywane do badania oddziaływań komórek odpornościowych.
- Cytometria przepływowa oferuje w porównaniu z mikroskopią korzyści w zakresie ilościowego oznaczania fluorescencji.
- Zrozumienie procesu internalizacji nanocząstek może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Różne typy komórek odpornościowych mogą wykazywać zróżnicowane odpowiedzi na nanocząstki.
Cel badania
- Analiza oddziaływania nanocząstek z subpopulacjami komórek odpornościowych.
- Ilościowe określenie szybkości internalizacji nanocząstek w różnych typach komórek.
- Pogłębienie zrozumienia odpowiedzi immunologicznej na terapię nanocząstkami.
Zastosowane metody
- Pierwotne komórki odpornościowe poddano działaniu fluorescencyjnych nanocząstek dwutlenku krzemu.
- Komórki znakowano swoistymi przeciwciałami do analizy cytometrycznej.
- Ustawienia kompensacji dostosowano w celu uwzględnienia interferencji nanocząstek.
- Przeprowadzono testy internalizacji w celu oceny wychwytu nanocząstek.
Główne wyniki
- Różne populacje komórek odpornościowych wykazały zróżnicowany stopień internalizacji nanocząsteczek.
- Cytometria przepływowa skutecznie rozróżniła typy komórek na podstawie intensywności fluorescencji.
- Internalizację potwierdzono za pomocą dodatkowych technik mikroskopowych.
- Wyniki wskazały na zależność od dawki w procesie pobierania nanocząsteczek przez monocyty.
Wnioski
- Badanie wykazuje użyteczność cytometrii przepływowej w analizie oddziaływań nanocząsteczek z komórkami odpornościowymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia, w jaki sposób nanocząsteczki mogą wpływać na odpowiedzi immunologiczne.
- Dalsze badania mogą zgłębiać zastosowania terapeutyczne nanocząsteczek w immunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia ilościową ocenę internalizacji nanocząsteczek w subpopulacjach pierwotnych komórek odpornościowych, co wspiera walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w rozwoju nanoterapii. Dostarczając danych o pobieraniu nanocząsteczek w zależności od dawki i typu komórek, zwiększa ona pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad interwencjami opartymi na nanocząsteczkach. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem na etapie odkrywania: przekształcanie oddziaływań nanocząsteczka-komórka w praktyczne, powtarzalne wskaźniki służące do priorytetyzacji portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie stopnia pobierania nanocząstek przez podgrupy komórek odpornościowych, co pozwala wyjaśnić, które populacje komórek wchodzą w interakcję z nanonośnikami.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki standaryzowanemu i powtarzalnemu pomiarowi internalizacji za pomocą natężenia fluorescencji oraz przesunięć światła rozproszonego bocznie.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację typów komórek o wysokim lub niskim powinowactwie do nanocząstek, co kieruje wyborem celu dla immunomodulujących nanoterapii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy komórek odpornościowych do dalszego przesiewu poprzez ustalenie bazowych profili oddziaływań nanocząsteczek.
- Wyniki ilościowe: Generuje wskaźniki intensywności fluorescencji i SSC, które umożliwiają standaryzowane, porównywalne odczyty w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalne procesy przesiewowe dzięki spójnym protokołom bramkowania, kompensacji i znakowania przeciwciałami, które można zastosować do różnych formulacji nanocząsteczek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Możliwość zastosowania w przypadku pierwotnej mikroglei z myszy mutantów, co umożliwia prowadzenie badań nad nanocząsteczkami ukierunkowanymi na OUN w immunologicznych modelach chorobowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki cytometrii przepływowej z potwierdzeniem w mikroskopii konfokalnej, co wzmacnia interpretację mechanistyczną na potrzeby walidacji przedklinicznej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju badań poprzez ujawnianie zróżnicowanych szybkości internalizacji, np. w subpopulacjach mikroglei wykazujących ekspresję GFP, w których stwierdzono zmienne pobieranie nanocząsteczek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnego przesiewu w celu oceny wiązania z celem molekularnym po przedkliniczną ocenę mechanistyczną, szczególnie w przypadku nanoterapii immunomodulacyjnych, w których kluczowe są profile interakcji komórek odpornościowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie ekspozycji na nanocząsteczki z mierzalnymi zmianami ziarnistości i fluorescencji komórek, co pozwala wyjaśnić mechanizmy aktywacji lub modulacji komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanym etapom izolacji, znakowania i kompensacji, które gwarantują powtarzalną kwantyfikację oddziaływań między nanocząsteczkami a komórkami.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (intensywność fluorescencji, przesunięcia SSC), co umożliwia porównanie internalizacji w różnych typach komórek, stężeniach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez ortogonalne potwierdzenie za pomocą mikroskopii konfokalnej, co jest zgodne z mechanistyczną redukcją ryzyka w oparciu o biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako reużywalna metoda dla różnych formatów nanocząsteczek (np. FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) i modeli odpornościowych (leukocyty krwi ludzkiej, mikroglej mysi), co ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczanie ilościowych danych o internalizacji nanocząsteczek z rozdzielczością do pojedynczych komórek, co zwiększa pewność w określaniu celów w strategiach immunomodulacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom kompensacji i panelom przeciwciał, minimalizując zmienność między użytkownikami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację subpopulacji odpornościowych podatnych na oddziaływanie nanocząsteczek, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach rozwoju nanoterapii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazanie formulacji nanocząsteczek o korzystnych lub niepożądanych profilach interakcji z komórkami odpornościowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w kompensacji cytometrii przepływowej, w szczególności w zakresie niwelowania zakłóceń rozproszenia bocznego indukowanego przez nanocząsteczki podczas korekcji nakładania się widm.
- Zależne od dostępu do cytometrów przepływowych z możliwością detekcji fluorescencji i rozproszenia, a także od paneli przeciwciał do identyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji strategii bramkowania (gatingu) i ustawień kompensacji, aby zapewnić spójną interpretację danych między grupami badawczymi (discovery) a grupami przedklinicznymi.
- Wymaga adaptacji przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych (np. komórki adherentne vs. nieadherentne, pierwotne komórki ludzkie vs. mysie) w celu zachowania wierności testu.
- Ograniczenie praktyczne: fluorescencja lub właściwości rozproszenia nanocząsteczek mogą zakłócać działanie niektórych fluorochromów, co wymaga starannego zaprojektowania panelu i walidacji kompensacji, zgodnie z opisem w protokole.
