Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej
28 marca 2014
Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie interakcji nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie interesujących komórek nanocząstkami. W kolejnym kroku komórki są znakowane przeciwciałem przeciwko specyficznym dla komórki markerom powierzchniowym, a następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Ostatecznie można zmierzyć interakcję nanocząstek z poszczególnymi populacjami komórek odpornościowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest to, że dzięki tej technice zmiany intensywności fluorescencji wywołane przez nanocząstki można określić ilościowo w nieprzylegających populacjach komórek W przypadku internalizacji nanocząstek w leukocytach krwi lub oczyszczonych monocytach należy rozpocząć od posiewu pięć razy 10 do jednej piątej komórek będących przedmiotem zainteresowania w jednym mililitrze na studzienkę. W każdym dołku 12-dołkowej płytki.
Następnie dodać 10 mikrolitrów świeżo przygotowanej roboczej zawiesiny nanocząstek fluorescencyjnego dwutlenku krzemu do każdej studzienki doświadczalnej, dodając równą objętość kompletnego podłoża do niepoddanych działaniu substancji studzienek kontrolnych również w tym czasie. Po godzinnej internalizacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przenieś próbki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek polipropylenowych, a następnie wiruj próbki przez trzy minuty w temperaturze 6 000 razy G i temperaturze pokojowej, aby zabarwić komórki CD 14 za pomocą niebieskiej inkubacji 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórkowej w 10 mikrolitrach ludzkiego przeciwciała w stosunku jeden do 11 w buforze przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała w jednym mililitrze biegnącego buforu, ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach świeżego buforu do analizy cytometrii przepływowej.
Następnie, aby skonfigurować spektralną kompensację rozlewania się, otwórz pole ustawień przyrządu w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej, a następnie pobierz nieznakowaną próbkę wolną od nanocząstek przeciwciała przy niskiej prędkości płynu. Dostosowanie ustawień kompensacji w obecności fluorescencyjnych nanocząstek jest najtrudniejszą częścią procedury, ponieważ nanocząstki mogą zakłócać rozpraszanie boczne, aby zapewnić sukces, należy zdefiniować bramkę interesującej populacji komórek Ręcznie dostosuj rozpraszanie do przodu i na bok, regulując kanały napięcia. Następnie narysuj odpowiednio dużą bramę wokół żądanej populacji komórek.
Załaduj kolejną nieoznakowaną próbkę i otwórz kartę kompensacji w polu ustawień urządzenia. Dostosuj współczynnik kompensacji podczas akwizycji, aż intensywność fluorescencji w kanale rozlewowym będzie mniej więcej taka sama dla populacji fluorochromu dodatniego i ujemnego. Na koniec, po dostosowaniu kompensacji dla każdej pojedynczej barwionej probówki kontrolnej fluorochromu, odczytaj próbki poddane działaniu nanocząstek, aby lepiej scharakteryzować zachowanie białych krwinek w odpowiedzi na nanocząstki, przeprowadzono testy internalizacji, jak właśnie wykazano.
Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie trzy główne subpopulacje leukocytów krwi zostały wyraźnie zidentyfikowane przez rozpraszanie do przodu i na bok po izolacji PBMC. Co więcej, po leczeniu dwutlenkiem krzemu fz, limfocyty, monocyty i granulocyty wykazywały różne szybkości internalizacji nanocząstek, na co wskazuje ich intensywność fluorescencji. Na tych obrazach wykazano internalizację nanocząstek w pierwotnych monocytach CD 14 dodatnich oczyszczonych z pbmc.
Te wykresy rozrzutu pokazują monocyty CD 14 dodatnie w obecności nanocząstek dwutlenku krzemu Fitza. Histogram ilustruje kwantyfikację komórek fitzy dodatnich wyrażoną jako intensywność fluorescencji. Podobne eksperymenty internalizacji przeprowadzono z monocytami TP one traktowanymi rosnącymi stężeniami nanocząstek dwutlenku krzemu Fitza z nieleczonymi komórkami jako kontrolą negatywną.
Wykresy kropkowe ilustrują zależny od dawki wzrost rozpraszania bocznego z niezmienionym rozpraszaniem do przodu w jednej linii komórkowej TP po internalizacji nanocząstek. Dane z tych wykresów sugerują, że leczenie nanocząstkami dwutlenku krzemu Fitza indukuje zależną od dawki internalizację w monocytach, podkreśloną przez zwiększenie ziarnistości wewnątrzkomórkowej Aby uzyskać dalszy wgląd w interakcje między komórkami odpornościowymi a nanocząstkami, mikroglej hodowano przez siedem dni in vitro i inkubowano z nanocząstkami przez godzinę. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała mieszaną hodowlę pierwotnych komórek glejowych z dużą liczbą nieprzylegających astrocytów GFP ujemnych i niektórymi komórkami GFP dodatnimi.
W tym reprezentatywnym eksperymencie trzy subpopulacje glejowe można było wyróżnić za pomocą cytometrii przepływowej z pojedynczym przeciwciałem CD 11 B barwiącym CD 11 B, ujemnymi astrocytami GFP ujemnymi i innymi komórkami glejowymi mikrogleju CD11 B dodatnimi komórkami GFP oraz subpopulacją CD 11 B dodatnią GFP. Dwie ostatnie subpopulacje są w stanie internalizować nanocząstki z nieznacznie zwiększonym niedoborem przez populację GFP dodatnią. Internalizację nanocząstek można dodatkowo zweryfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak pokazano na tym obrazie, przy użyciu nanocząstek dwutlenku krzemu z pręcikami dominowymi.
Podczas próby tej procedury należy pamiętać, aby trzymać próbki w ciemności, aby uniknąć bielenia barwników fluorescencyjnych i utrzymywać próbki w temperaturze czterech stopni podczas inkubacji przeciwciał. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące wewnątrzkomórkowej lokalizacji nanocząstek.
Przegląd
To badanie koncentruje się na interakcji fluorescencyjnych nanocząstek z podstawowymi subpopulacjami komórek odpornościowych przy użyciu cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia ilościową ocenę internalizacji nanocząstek w różnych komórkach odpornościowych, zapewniając wgląd w ich zachowanie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Nanotechnologia
- Cytometria przepływowa
Tło
- Nanocząstki mogą być wykorzystywane do badania interakcji komórek odpornościowych.
- Cytometria przepływowa oferuje zalety w stosunku do mikroskopii w kwantyfikacji fluorescencji.
- Rozumienie internalizacji nanocząstek może wpłynąć na strategie terapeutyczne.
- Różne typy komórek odpornościowych mogą wykazywać różne reakcje na nanocząstki.
Cel badania
- Analiza interakcji nanocząstek z subpopulacjami komórek odpornościowych.
- Ilościowa ocena wskaźników internalizacji nanocząstek w różnych typach komórek.
- Ulepszenie rozumienia odpowiedzi odpornościowych na leczenie nanocząstkami.
Zastosowanie metod
- Komórki odpornościowe pierwotne zostały traktowane fluorescencyjnymi nanocząstkami dwutlenku krzemu.
- Komórki zostały oznakowane specyficznymi przeciwciałami do analizy cytometrycznej.
- Ustawienia kompensacji zostały dostosowane, aby uwzględnić ingerencję nanocząstek.
- Przeprowadzono testy internalizacji w celu oceny poboru nanocząstek.
Główne wyniki
- Różne populacje komórek odpornościowych wykazywały różne wskaźniki internalizacji nanocząstek.
- Cytometria przepływowa skutecznie rozróżniała typy komórek na podstawie intensywności fluorescencji.
- Internalizacja została potwierdzona za pomocą dodatkowych technik mikroskopowych.
- Wyniki wskazały na związek zależny od dawki w poborze nanocząstek przez monocyty.
Wnioski
- Badanie wykazuje przydatność cytometrii przepływowej w analizie interakcji nanocząstek z komórkami odpornościowymi.
- Wyniki wnoszą do zrozumienia, jak nanocząstki mogą wpływać na odpowiedzi odpornościowe.
- Dalsze badania mogą zgłębiać terapeutyczne zastosowania nanocząstek w immunologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
