Name: Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Naucz się izolować pierwotne komórki prekursorowe miogenne z mięśni epaksjalnych ryb, mechanicznie i enzymatycznie je rozdrabniając oraz hodując na podłożu z lamininy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby bardzo podziękować doktorom Josepowi Planasowi i Juanowi Castillo za ich profesjonalną wiedzę w zakresie rozwoju i zastosowania tego protokołu hodowlanego do małych ryb i. Podziękowania należą się również niezliczonym osobom, które niestrudzenie pomagały w rozwarstwianiu i dysocjacji tkanki mięśniowej wielu ryb (zarówno pod względem gatunku, jak i liczby), w tym Matthew Charging, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily i Sinibaldo Romero. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe University of Alabama at Birmingham Department of Biology, Center for Protease Research NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 oraz NDSU Advance FORWARD NSF Grant #HRD-0811239 dla PRB. Wsparcia udzieliło również Centrum Badań nad Otyłością UAB nagroda # P30DK056336, NIH NIDDK. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z udziałem kręgowców opisane tutaj zostały wcześniej zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alabama w Birmingham i są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych, Narodowe Instytuty Zdrowia Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych.
1. Przygotowanie do kultury
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże bazowe w następujący sposób: 9 mM NaHCO3 (1,51 g na 2 l), 20 mM HEPES (9,53 g na 2 l) w DMEM (13,48 g/l; 26,96 g na 2 l).
	<ol>
		<li>Oznaczyć pH i dostosować do 7,40 za pomocą HCl lub NaOH.</li>
		<li>Określ osmolalność i dostosuj do ~ 300 mOsm za pomocą NaCl (w razie potrzeby).</li>
		<li>Filtr sterylizować za pomocą (2) 1 L systemów sterylizacji próżniowej i przechowywać w temperaturze 4 °C w chronić przed światłem przez okres do 2-3 miesięcy. 
		UWAGA: Patrz tabele 1 i 2, aby uzyskać pełne informacje o odczynnikach, narzędziach, materiałach eksploatacyjnych i sprzęcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować płytki poddane działaniu poli-L-lizyny, rozpuszczając 5 mg napromieniowanej γ poli-L-lizyny (> 300 000 mw) w 50 ml ultraczystej sterylnej wody. Mieszać delikatnie przez odwrócenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, zapewniając pełne rozpuszczenie polimerów lizyny.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią ilość roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka, zgodnie z typem płytki (Tabela 3). Pozostaw płytki w okapie z przepływem laminarnym na 5 minut.</li>
	<li>Następnie usuń roztwór poli-L-lizyny i przemyj dwukrotnie sterylną wodą. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym przez 20 minut.</li>
	<li>Otrzymać 1 mg lamininy (pochodzenie Engelbreth-Holm-Swarm) i rozpuścić w 50 ml pożywki zasadowej do końcowego stężenia 20 μg/ml. Nałożyć roztwór lamininy na płytki do hodowli komórkowych poddanych działaniu poli-L-lizyny w stężeniu 2 μg/cm2. (patrz tabela 3 dla różnych rozmiarów płyt)</li>
	<li>Delikatnie zamieszaj roztwór, aby zapewnić pełne pokrycie studni. Uszczelnij płytki taśmą laboratoryjną i umieść w inkubatorze na 24 godziny. W inkubatorze należy ustawić temperaturę odpowiednią dla wykorzystywanych gatunków (zob. tabela 7) i nie ma potrzeby dodawania do niego dodatkowych gazów. 
	UWAGA: Laminina musi przylegać do płytek przez 24 godziny przed wysiewem komórek. Niezastosowanie się do tego spowoduje słabe przyleganie komórek lub jego brak.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zgodnie z opisem w Tabeli 4. Kompletne podłoża najlepiej przygotować w dniu użycia.</li>
	<li>Przygotowując się do izolacji tkanek, zbierz następujące elementy i przeprowadź autoklaw: 300-500 ml zlewki, szklane szalki Petriego, trzonki skalpela, kleszcze (cienkie i grube), nożyczki do preparowania i kilka arkuszy wodoodpornego papieru do autoklawu. 
	UWAGA: Dla każdej osoby pomagającej w procesie preparacji wystarczą (2) uchwyty skalpela, (1) kleszcze (rodzaj w zależności od osobistych preferencji), (1) nożyczki preparacyjne i (5-10) arkuszy wodoodpornego papieru autoklawu.</li>
	<li>Oprócz powyższych autoklawowanych przedmiotów, zbierz 70% etanolu, wagę wagową, sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml (liczba zależy od wielkości kultury) i lód.</li>
</ol>
2. Sekcja tkanek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępny jest wystarczający zapas ryb. 
	UWAGA: Wiek ryby, która ma być użyta, ma kluczowe znaczenie. Podczas gdy ryby dwóch różnych gatunków mogą mieć podobną wagę, młodsza ryba jednego gatunku będzie miała więcej MPC niż starsza ryba innego gatunku. Z reguły najlepsze są młodsze ryby, zwłaszcza podczas pracy z łososiowatymi. W przypadku danionin optymalnie można wykorzystać ryby w wieku jednego roku, podczas gdy ryby łososiowate w wieku 4-6 miesięcy lub młodsze (do 15 g) są optymalne.</li>
	<li>Na każde 5 g tkanki przeznaczonej do wycięcia, podwielokrotność 25 ml pożywki izolacyjnej do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zważyć, zapisać masę i ponumerować probówkę (rurki). Umieść probówki na lodzie.</li>
	<li>Eutanazja 2-3 ryb na raz przez zanurzenie w > 300 mg/l buforowanym wodorowęglanem sodu metanosulfonianu trikainy. Pozostawić ruch operkularny do ustania na > 5 minut, a następnie zanurzyć ryby w 70% etanolu (zawartym w sterylnych zlewkach) na 30 sekund.</li>
	<li>Usuń rybę z 70% etanolu i umieść na wodoodpornym bibułie autoklawu. Bezpośrednio za wieczkiem użyj skalpela, aby wykonać powierzchowne, płytkie nacięcie. Usuń łuski i skórę, chwytając skórę w wyżej wymienionym nacięciu i pociągnij w kierunku ogona ryby.</li>
	<li>Po usunięciu skóry należy wyciąć eposadny, szybko glikolityczny "biały" mięsień ryby z obu stron (unikając wolno utleniającego się "czerwonego" mięśnia znajdującego się w pobliżu linii bocznej) i umieścić w pożywce izolacyjnej. Pozostałą część ryb należy wyrzucić zgodnie z wymogami instytucji. 
	UWAGA: Chociaż hodowla MPC pochodzących z czerwonego mięśnia jest całkowicie możliwa, prawie każda publikacja wykorzystująca teleost MPC wykorzystuje komórki wyizolowane z miotomii osiowej.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.4-2.6, aż uzyskasz wystarczającą ilość mięśni. Podczas sekcji upewnij się, że zgromadzona tkanka mięśniowa pozostaje na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek.</li>
</ol>
3. Dysocjacja mechaniczna
<ol>
	<li>Wlej jedną probówkę z 25 ml/5 g tkanki mięśniowej do szklanej szalki Petriego. Używając dwóch uchwytów skalpela z dołączonymi ostrzami skalpela #10, zmiel tkankę do konsystencji zawiesiny lub purée. Najlepiej sprawdza się ruch "w przód iw tył" polegający na przeciąganiu ostrzy skalpela obok siebie. 
	UWAGA: Chociaż homogenizatory tkankowe mogą wydawać się odpowiednie, liczba żywotnych komórek zostanie znacznie zmniejszona, jeśli nie zniesiona.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i pipetora serologicznego usunąć zawiesinę tkanki i umieścić ją w oryginalnej stożkowej probówce.</li>
	<li>Powtarzać kroki 3.1-3.2, aż wszystkie tkanki we wszystkich probówkach zostaną mechanicznie zdysocjowane.</li>
	<li>Odwirowywać tkankę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić 25 ml supernatantu z pożywką za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml, aspiratora próżniowego lub przez staranną dekantację.</li>
	<li>Dodać 25 ml pożywki myjącej do każdej probówki, ponownie zawiesić tkankę i ponownie odwirować jak powyżej.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie środkiem myjącym, za każdym razem usuwając supernatant.</li>
</ol>
4. Dysocjacja enzymatyczna
<ol>
	<li>W kroku 3.4 przygotuj roztwór kolagenazy, łącząc 0,22 g kolagenazy typu IV i 44 ml pożywki zasadowej (lub wystarczającą ilość 0,11 g/0,22 ml).</li>
	<li>Mieszać w zlewce przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C. Filtrować sterylizować za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm. 
	UWAGA: Może być potrzebny więcej niż jeden filtr strzykawkowy, w zależności od preparatu kolagenazy. Kolagenaza uzyskana od dostawców innych niż Worthington Biochemical stwarza większe trudności podczas filtracji. Kolagenaza służy do dysocjacji wiązań peptydowych w kolagenie, które tworzą endomysium. To trawienie usunie tę barierę ochronną włókien mięśniowych.</li>
	<li>Na każdy g tkanki mięśniowej należy ponownie zawiesić tkankę w 0,2% roztworze kolagenazy. Na 5 g tkanki mięśniowej dodaj 10 ml roztworu kolagenazy i 15 ml pożywki bazowej.</li>
	<li>Dodać 10 μl PSF na ml roztworu kolagenazy/podłoża bazowego (np. 250 μl do 25 ml). Upewnij się, że tkanka jest dobrze zawieszona, ponieważ wpłynie to na efektywność trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Inkubować tkankę mięśniową w kolagenazie przez 60 minut w temperaturze 18 °C, delikatnie kołysząc. W zależności od stopnia dysocjacji mechanicznej i gatunku, trawienie kolagenazy może być wydłużone do 90 minut, chociaż może to wpływać na żywotność komórek.</li>
	<li>Po wytrawieniu kolagenazą odwirować stożkowe probówki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić tkankę w 25 ml pożywki do mycia.</li>
	<li>Odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Powtórzyć z medium myjącym po raz drugi.</li>
	<li>Po dwukrotnym umyciu tkanki, ponownie zawiesić tkankę mięśniową w 25 ml pożywki myjącej i rozcierać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aż jednorodność tkanki/pożywki będzie wchodzić i wychodzić z pipety ze względną łatwością. Zwykle wystarcza 5-10 rozcierań.
	<ol>
		<li>Powtórzyć za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, a następnie metalowej kaniuli o rozmiarze 16 dołączonej do strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować stożkowe probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C. Dekantować supernatant.</li>
	<li>Podczas powyższego 5-minutowego wirowania przygotuj roztwór do wytrawiania trypsyny, łącząc 0,25 g trypsyny z 5 ml pożywki zasadowej.</li>
	<li>Mieszać w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut i przesączyć sterylizować za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.</li>
	<li>Pobrać stożkowe probówki i dodać 100 μl roztworu trypsyny i 4,9 ml pożywki dysocjacyjnej na każdy 1 g tkanki mięśniowej do każdej probówki. Na przykład dodaj 500 μl roztworu trypsyny i 24,5 ml pożywki dysocjacyjnej do 5 g tkanki mięśniowej. 
	UWAGA: Trypsyna jest proteazą serynową , która oddziela miogenne komórki prekursorowe od blaszki podstawnej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić tkankę w pożywce trypsyna/dysocjacja. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Po pierwszej inkubacji trypsyny odwirować stożkowe probówki o masie 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 12 °C.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę, łącząc supernatanty z pożywką izolacyjną o stężeniu 1 objętość supernatantu na 4 objętości pożywki izolacyjnej. Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas drugiego trawienia trypsyny.</li>
	<li>Do pozostałej osadki tkanki powtórzyć kroki 4.12-4.15, łącząc supernatant następujący po kroku 4.15 z supernatantem/pożywką izolacyjną z pierwszego trawienia trypsyną.</li>
	<li>ALTERNATYWNIE: Trawienie kolagenazy i trypsyny można łączyć, aby zmaksymalizować wydajność komórek.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, rozcieraj trawienie kolagenazy za pomocą metalowej kaniuli (najlepiej o długości 6 i rozmiarze 16) przymocowanej do strzykawki o pojemności 20 ml, aż homogenat łatwo przejdzie przez kaniulę.</li>
		<li>Do homogenatu dodać 500 μl roztworu trypsyny (przygotowanego w kroku 4.10) i inkubować w temperaturze 18 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować stożkowe probówki o masie 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 12 °C.</li>
		<li>Zneutralizować trypsynę, łącząc supernatanty z pożywką izolacyjną o stężeniu 1 objętość supernatantu na 4 objętości pożywki izolacyjnej.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas drugiego trawienia trypsyny.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z krokiem 4.18, tak jak w przypadku standardowego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozować końcową mieszaninę sklarowanego osadu/pożywki izolacyjnej do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 12 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć osadów komórkowych. Odpipetować pipetą 2 ml kompletnego podłoża do każdej probówki, rozpuszczając każdą osadkę komórkową.</li>
	<li>Połączyć komórki zawieszone w kompletnym podłożu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłukać każdą probówkę 1 ml kompletnego podłoża, łącząc je z pulą komórek ponownie zawieszonych uprzednio.</li>
	<li>Rozcierać metalową kaniulą i strzykawką 5-10 razy.</li>
	<li>Zawiesinę komórek filtracyjnych przez sitko o wielkości 100 μm, przepłukać kompletnym podłożem.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Dodać wystarczającą ilość kompletnego podłoża do 50 ml i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 15 °C.</li>
</ol>
5. Liczenie, rozcieńczanie i rozsiewanie komórek
<ol>
	<li>Po ostatnim odwirowaniu w kroku 4.25 usunąć supernatant przez staranną dekantację lub za pomocą pipety serologicznej. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnego podłoża.</li>
	<li>Po całkowitym zawieszeniu komórek usunąć 20 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj 5 μl barwnika Trypan Blue i odczekaj 5 minut. Za pomocą hemocytometru określ liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Po oznaczeniu rozcieńczyć komórki do wymaganego stężenia. Teleost MPC najlepiej wysiewać się przy 150 000-200 000 komórek na cm2. W przypadku strategii posiewu z sześcioma dołkami, rozcieńczanie komórek do 1,5 x 106 - 2,0 x 106 na ml wspiera wystarczającą proliferację i różnicowanie.</li>
	<li>Pobrać płytki i komórki nasienne nasączone poli-L-lizyną, pokryte lamininą. (Patrz Tabela 5 dla rozcieńczeń i objętości posiewu specyficznych dla płytki). UWAGA: Tabela 6 przedstawia średnią liczbę komórek wyizolowanych na gram tkanki mięśniowej wyizolowanej od różnych gatunków teleostów. Pstrąg tęczowy (O. mykiss) wykazuje mniej MPC na gram tkanki mięśniowej niż danio pręgowany (D. rerio) i dlatego będzie wymagał większej liczby ryb do odizolowania w celu prawidłowego wysiewu.</li>
	<li>Uszczelnić płytki taśmą laboratoryjną i umieścić w inkubatorze chłodzącym o odpowiedniej temperaturze. MPC ze wszystkich wymienionych tu gatunków (z wyjątkiem myszy) mogą być inkubowane w normalnych warunkach atmosferycznych bez suplementacji dwutlenkiem węgla (CO2 ). (Patrz Tabela 7.)</li>
	<li>ALTERNATYWNIE: Niektóre laboratoria przyjęły protokół, który wzywa do zezwolenia MPC na przyleganie do substratów hodowlanych przez 40 minut.
	<ol>
		<li>Następnie opłucz płytki środkiem myjącym, aby usunąć luźno przylegające i nieprzylegające komórki. Ostrzeżenie: Ten krok jest bardzo ważny, aby uniknąć "niespecyficznego" przylegania innych komórek (np. fibroblastów) do podłoża hodowli.</li>
		<li>Dodaj kompletną pożywkę i umieść komórki w inkubatorze i pielęgnuj zgodnie z opisem poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Program miogenny, niezależnie od tego, jaki badany gatunek, może być najłatwiej zbadany za pomocą systemu in vitro . Rzeczywiście, po izolacji, miogenne komórki prekursorowe (MPC) w rybach lub komórkach miosatelitarnych (MSC) u ssaków łatwo wchodzą w ten wysoce regulowany proces obejmujący proliferację, wycofanie cyklu komórkowego i końcowe różnicowanie mioblastów oraz fuzję tych mioblastów z powstającymi miotubami. Ogólny brak transgenicznych genów reporterowych gatunków ryb (być może z wyjątkiem danio pręgowan...

Znaczne zrozumienie miogenezy ssaków uzyskano dzięki rekapitulacji tego procesu zarówno w pierwotnych hodowlach mysich (Mus musculus), jak i w dobrze opisanej linii komórkowej pochodzącej od myszy, C2C125. Począwszy od lat pięćdziesiątychXX wieku, kultury te doprowadziły do znacznego postępu w zrozumieniu programu mysiego, a co za tym idzie, miogenezy u innych kręgowców. Ponadto techniki eksplantacji włókien miokomórkowych z pojedynczych komórek zwiększyły zrozumienie interakcji między komórkami satelitarnymi a otaczającymi włóknami mięśniowymi7-9. Hodowle komórkowe są szczególnie atrakcyjne do badań miogenezy ze względu na krótki czas od komórki prekursorowej do komórki zróżnicowanej10, względną łatwość transfekcji RNAi11-14, transgeniczne15,16 i badania nadekspresji14,17,18 , ekspansję in vitro, a następnie przeszczep in vivo 18-20, a nawet porównanie miogennych komórek prekursorowych i ich czynników regulujących w taksonach21,22. Chociaż opisano różnice wynikające ze sztucznego środowiska systemu hodowli5,23 , te systemy in vitro okazały się niezbędne do naszej analizy skomplikowanego programu rządzącego tworzeniem wielojądrowych, ostatecznie zróżnicowanych włókien mięśniowych z monojądrowych proliferacyjnych komórek progenitorowych znanych jako komórki miosatelitarne (MSC) wśród ssaków.
Poza klasą Mammalia, zachowanie i/lub rozbieżność mechanizmów kontrolujących miogenezę są słabo poznane, głównie z powodu trudności w hodowli miogennych komórek prekursorowych (MPC) i mioblastów z różnych taksonów. Rzeczywiście, pierwotne kultury mioblastów opisano tylko u trzech ptakóww wieku 24-26 lat, jednego27, kilkuw wieku 28-30 lat i niektórych rybw wieku 1,3,4,31-33 lat. Ciągłe miogenne linie komórkowe od kręgowców innych niż gryzonie34-36są jeszcze rzadsze, a jedyna niessakowa linia komórek miogennych pochodzi z przepiórki japońskiej (Cortunix japonica), QM737. Pomimo wielu prób unieśmiertelnienia, teleostyczna miogenna linia komórkowa pozostaje nieuchwytna, a protokół skutecznej transfekcji tych komórek został opublikowany dopiero w tym roku15. W związku z tym jasne i dobrze zoptymalizowane protokoły hodowli pierwotnych MPC i mioblastów od różnych kręgowców są bardzo potrzebne, aby nie tylko dalej poszerzać naszą wiedzę na temat ewolucji programu miogennego, ale także wykorzystywać moc fizjologii porównawczej do dokonywania przełomów w leczeniu chorób i zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.
Chociaż literatura zawiera wiele doniesień o izolacji MPC/mioblast38-49, często zdarza się, że autorzy opisują protokoły takich izolacji w krótkich, często niekompletnych formatach. Co więcej, najbardziej pouczające protokoły zostały opracowane dla myszy50-53, a niektóre z nich opierają się na selekcji przeciwciał54,55 lub transgenach fluorescencyjnych56,57, co czyni te protokoły bezużytecznymi lub niepraktycznymi w większości gatunków niebędących gryzoniami wykorzystywanych przez biologów mięśniowych. Ponieważ niewiele wiadomo na temat miogenezy ryb, i, szczegółowy i dokładny protokół, opisany pod wskazówkami audiowizualnymi i wykazany z wykazaną skutecznością u daleko spokrewnionych gatunków, byłby najbardziej pomocny w terenie.
Po raz pierwszy opisany przez Powella i współpracowników w 1989 roku58, początkowo opracowano następujący protokół do izolowania MPC i mioblastów od ryb łososiowatych (mianowicie pstrąga tęczowego, Oncorhynchus mykiss, i łososia atlantyckiego, Salmo salar) oraz niektórych większych karpiowatych (np. złotej rybki, Carassiusauratusauratus). W 2000 roku Fauconneau i Paboeuf zoptymalizowali pierwotną hodowlę mioblastów dla pstrąga tęczowego59, a drobne optymalizacje sprawiły, że protokół ten stał się możliwy do zastosowania u kilku mniejszych rybek z kladu Danioninae (danio pręgowany, Danio rerio i danio olbrzymi, Devario aequipinnatus)32 ze względu na wiele narzędzi genetycznych dostępnych dla pracy danio pręgowanego, a tym samym jego bliskich krewnych. Ryby teleost są atrakcyjnymi organizmami do badań ze względu na ich rozbieżną strategię wzrostu (przynajmniej u większości gatunków). Duże łososie, podobnie jak większość ryb, rosną w nieskończoność, z potencjałem wzrostu nieskrępowanym asymptotą w okresie dojrzałości, nawet w starszym wieku60-62 lata. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, duże danioniny, takie jak gigantyczny danio63 i wąsaty danio, wykazują potencjał wzrostu typowy dla ryb teleostowych, co sprawia, że ich bezpośrednie zestawienie jest idealną platformą do zrozumienia, czy wybór losu komórek MPC odgrywa rolę w hiperplazji mięśni szkieletowych w porównaniu z hipertrofią.
Podobnie, wykazaliśmy, że ten protokół może być stosowany u myszy i aksolotlów, o stosunkowo wysokiej wydajności komórek i wskaźnikach żywotności. Salamandry urodele, takie jak aksolotl meksykański (Ambystomamexicanum), posiadają niezwykłą zdolność do regeneracji tkanek, w tym całych kończyn i ogonów64-66. Ta cecha sprawia, że te są interesującymi modelami zaniku i starzenia się mięśni szkieletowych. Korzystając z opisanego poniżej protokołu, można zastosować podobne podejście, jak to miało miejsce w przypadku wielu gatunków ryb, zapewniając jeszcze szerszy kontekst porównawczy dla takich badań. Wielu prawdziwych biologów porównawczych zdaje sobie sprawę, że najbardziej znaczące postępy w biologii podstawowej i biomedycynie translacyjnej można osiągnąć, gdy dane są analizowane w najszerszym spektrum (w tym przypadku całej linii kręgowców).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1. Szczegółowe informacje o odczynnikach</td></tr><tr>Firma<td>odczynnikowa</td><td>(preferowana v. alternatywna)</td><td>Numer katalogowy (preferowana alternatywna)</td><td>Ilość na kulturę</td></tr><tr><td>&gamma;-napromieniowana poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (wysoka glukoza)</td><td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences ( Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1.51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9.53 g</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Środek przeciwgrzybiczy</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 ml</td></tr><tr><td>siarczanu</td> <td>gentamycynyLonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>Surowice koni dawcy</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>Surowice bydlęce</td><td>płodu Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Kolagenaza (Typ IV)</td><td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0,44 g</td></tr><tr><td>Trypsyna (z trzustki)</td><td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Materiały eksploatacyjne, narzędzia i sprzęt</td></tr><tr><td>Narzędzia eksploatacyjne</td><td></td><td>Sprzęt</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych</td><td>Kleszcze (gruboziarniste)</td> <td>Pipetor</td><td></td>serologiczny</tr><tr><td>Sterylne 50 ml Probówki stożkowe Kleszcze</td><td>(drobne)</td> <td>pH-metr</td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Uchwyty skalpela</td><td>Inkubator chłodzący (Echotherm)</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Systemy sterylizacji próżniowej</td><td>Ostrza skalpela (#10, #11)</td>Kaptur <td></td>z <td>przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Wodoodporny autoklaw Papier</td><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Kolektor</td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Szklane szalki Petriego</td><td>Miernik</td><td></td></tr><tr><td></td> mikroosmolalności <td>12-16 G Kaniule z zamkami Luer <</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tabela 3. Zoptymalizowane objętości do powlekania płytek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Rozmiar płytki cm</td><td>^2 na dołek</td><td>Poli-L-lizyna*</td><td>Laminina**</td></tr><tr><td>6 dołek</td><td>9,5</td><td>1,6 ml</td><td>1</td></tr><tr><td>24 dołek</td><td>1,9</td><td>0,32</td><td>0,2</td></tr><tr><td>48 dołek</td><td>0,95</td><td>0,16</td><td>0,1</td></tr><tr><td>96 dołek</td><td>0,32</td><td>0,06</td><td>0,03</td></tr><tr><td>*0,1 mg/ml koncentracja</td><td>** Stężenie 0,020 mg/ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Pożywki do izolacji, dysocjacji i hodowli</td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>do izolacji</td><td>Pożywka</td><td>bazowa dysocjacji do płukania</td></tr><tr><td></td><td>419,25 ml</td><td>395,40 ml</td><td>297,00 ml</td></tr><tr><td>siarczanu gentamycyny**</td><td>0,75 ml</td><td>0,60 ml</td><td></td></tr> <tr><td>-Surowica koni dawcy</td><td>75,00 ml</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Surowica bydlęca płodu***</td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>* PSF: koktajl penicylina/streptomycyna/fungizone (100x); ** Stężenie 50 mg/ml; Charakteryzowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 5. Zalecane rozcieńczenia i objętości posiewu</td></tr><tr><td>Rozmiar płytki</td><td>cm^2 na dołek</td><td>Rozcieńczenie</td><td>Objętość posiewu</td></tr><tr><td>6 dołka</td><td>9,5</td><td>1,5-2,0x10^6 komórek/ml</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>24 dołki</td><td>1,9</td><td>1,5-2,0x10^6 komórek/ml</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 dobrze</td><td>0,95</td><td>1,5-2,0x10^6 komórek/ml</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 studzienka</td><td>0,32</td><td>1,5-2,0x10^6 komórek/ml</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 6. Średnia liczba komórek w tkance</td></tr><tr><td>g Gatunki</td><td>Średnia # komórek/g tkanki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6 400 000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1 783 000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1 797 000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66 800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 7. Zalecane temperatury inkubacji</td></tr><tr><td>Gatunki</td><td>Temperatura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 stopni C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 & C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* Niższe temperatury sprzyjają niższym wskaźnikom proliferacji.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Ze względu na nieodłączną trudność i czas związany z badaniem programu miogennego in vivo, pierwotne systemy hodowlane pochodzące z rezydentnych dorosłych komórek macierzystych mięśni szkieletowych, miogennych komórek prekursorowych (MPC), okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych ssaków. Jednak szczególnie wśród podstawowych taksonów kręgowców dane opisujące mechanizmy molekularne kontrolujące samoodnowę, proliferację i różnicowanie MPC są ograniczone. Szczególnie interesujące są potencjalne mechanizmy, które leżą u podstaw zdolności podstawowych kręgowców do przechodzenia znacznego przerostu włókien szkieletowych po larwach (np. ryb teleostowych) i pełnej regeneracji po utracie przydatków (np. urodele). Ponadto zastosowanie hodowanych mioblastów może pomóc w zrozumieniu regeneracji i podsumowania programu miogennego oraz różnic między nimi. W tym celu szczegółowo opisujemy solidny i skuteczny protokół (i jego odmiany) do izolowania i utrzymywania MPC i ich potomstwa, mioblastów i niedojrzałych miotub, w hodowli komórkowej jako platformę do zrozumienia ewolucji programu miogennego, zaczynając od bardziej podstawowych kręgowców. Opierając się na modelowym statusie organizmu danio pręgowanego (Danio rerio), przedstawiamy informacje na temat zastosowania tego protokołu do małych ryb z kladu karpiowatych Danioninae. W połączeniu protokół ten może być wykorzystany do realizacji szerszego podejścia porównawczego poprzez izolację MPC od meksykańskiego aksolotla (Ambystomamexicanum), a nawet gryzoni laboratoryjnych. Protokół ten jest obecnie szeroko stosowany w badaniu miogenezy u kilku gatunków ryb, w tym pstrąga tęczowego, łososia i dorady1-4.

Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu, prekursorowe komórki mięśniowe (MPCs) powinny być widoczne jako przytwierdzone do podłoża z lamininy (patrz Rysunki 1a oraz 1d). Po wysianiu komórki (MPCs) przyjmują wrzecionowaty kształt charakterystyczny dla tego typu komórek (Rysunek 1) i wykazują obecność MyoD1+ (Rysunek 2). W gatunkach Danio komórki MPC wydają się być bardziej zwarte i mają mniejsze wypustki binarne niż MPC pochodzące od gatunków ...

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i rozbieżnych mechanizmów regulacyjnych w całej linii kręgowców.

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla komórek prekursorowych mięśni szkieletowych z ryb kostnoszkieletowych w celu przeprowadzenia miogenezy in vitro. Osiąga się to najpierw poprzez wycięcie mięśnia epaksjalnego z organizmu. Drugim krokiem jest mechaniczna dysocjacja wyizolowanej tkanki.Następnie tkankę poddaje się dysocjacji enzymatycznej w celu rozproszenia pożądanych komórek. Ostatnim krokiem jest wysianie wyizolowanych komórek prekursorowych mięśniowych na podłożu z Lamininy. Ostatecznie in vitro.Miogeneza jest wykorzystywana do wykazania wpływu różnych zabiegów na zmiany w regulacji i ekspresji genów, ekspresję białek oraz zmiany fenotypu komórek. W tym filmie zostanie zaprezentowane, jak przygotować pierwotny system hodowli z komórek prekursorowych miogennych ryb kostnoszkieletowych. Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ niektóre etapy dysocjacji mogą być trudne do opanowania.Właściwa i odpowiednia dysocjacja jest kluczowa dla wyizolowania odpowiedniego osadu komórkowego do późniejszej hodowli. Na początek należy przygotować wszystkie pożywki i roztwory niezbędne do przeprowadzenia procedury. Następnie należy zgromadzić dodatkowe przedmioty pot

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur pierwotnych miogenicznych komórek prekursorowych/mięśniobłonków z podstawowych linii kręgowców

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Naucz się izolować pierwotne komórki prekursorowe miogenne z mięśni epaksjalnych ryb, mechanicznie i enzymatycznie je rozdrabniając oraz hodując na podłożu z lamininy.

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Przeglądaj więcej filmów