Name: Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj techniki wstrzykiwania komórek, barwników i DNA do rozwijających się serc embrionalnych myszy w celu badania losu komórek i lokalnej manipulacji ekspresją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Fundacji Leducq (MITRAL) oraz Agence Nationale pour la Recherche (grant ANR Specistem) za finansowanie tych badań.

1. Przygotowanie
Procedury na zwierzętach
Uzyskaj zgodę komisji etyki zwierząt i postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi pracy z wirusem, HuESC i/lub iPSC (jeśli dotyczy), a także obchodzenia się z myszami, pozyskiwania mysich zarodków i przeprowadzania operacji na myszach. W przypadku krycia w określonym czasie dzień czopa jest uważany za dzień embrionalny (E) 0,5 / 0,5 dnia po stosunku.
<ol>
	<li>Igły do mikroiniekcji: 
	W przypadku mikroiniekcji ex utero należy wyciągnąć szklane pipety (borokrzemianowe rurki kapilarne o średnicy zewnętrznej 1,2 mm) za pomocą ściągacza/ukosowarki do pipet, aby uzyskać wewnętrzną średnicę końcówki 1 lub 10 μm oraz ostrą i stożkową końcówkę do wstrzykiwania odpowiednio DNA lub komórek. Do wstrzykiwań za pośrednictwem ultradźwięków należy używać niestandardowych sterylnych igieł, które mają średnicę zewnętrzną/wewnętrzną (OD/ID) 1,14 mm/0,53 mm, z końcówką OD/ID 50/35 μm.</li>
	<li>Wypełnione krzemem szalki Petriego: 
	Przygotuj silikon zgodnie z opisem w instrukcji. Napełnij czystą szklaną szalkę Petriego o średnicy 60 mm warstwą elastomeru o grubości ~1 cm. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Instrumenty: 
	Utrzymuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylnym stanie przed zabiegiem i w jego trakcie.</li>
	<li>Przygotowanie DNA: 
	Dodać 3 μg DNA i 12 μl Opti-MEM w jednej probówce. Dodać 3 μl Lipofectamine 2000 i 12 μl Opti-MEM do innej probówki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wymieszać oba roztwory. Zużyć natychmiast.</li>
	<li>Przygotowanie komórek: 
	Przygotować zawiesinę 106 komórek/ml DMEM (Dulbecco's Eagle Medium, wysoka glukoza i 50% surowica szczurów). 50 μl końcowej zawiesiny komórek wystarcza na 8-10 zarodków.</li>
	<li>Przygotowanie barwnika: 
	Użyj zielonej fluorescencji CDCFDA-SE o stężeniu 25 mg/ml DMSO. Przygotować 20 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć w stosunku 1:100/1:200 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS.</li>
	<li>Przygotowanie wirusa: 
	Użyj komercyjnego lentiwirusa 3generacji z ekspresją PGK-GFP o mianie ~10 9-10 10 jednostek transdukcyjnych/ml DMEM. Aby uzyskać informacje na temat przygotowania lentiwirusa, patrz Tiscornia i wsp.14 Nosić środki ochrony osobistej oraz bezpiecznie używać i usuwać wirusa.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków E9.5 i E10.5 do iniekcji ex vivo
<ol>
	<li>Eutanazja ciężarnej myszy w 9,5 lub 10,5 dniu embrionalnym.</li>
	<li>Wysterylizuj klatkę piersiową i brzuch myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej, aby otworzyć jamę brzuszną i odzyskać róg macicy w RT w PBS i przenieś go po dwóch płukaniach PBS na wypełnioną silikonem szalkę Petriego z podłożem M16.</li>
	<li>Przypnij róg macicy za pomocą szpilek przeciw owadom do warstwy silikonu tak, aby unaczyniona strona macicy znajdowała się na dole.</li>
	<li>Przetnij powierzchnię macicy drobnymi kleszczami i nasadką decidua 1 mm poniżej powierzchni.</li>
	<li>Delikatnie odzyskaj zarodek w woreczku żółtkowym, rozkładając ścianki decidua.</li>
	<li>Przechowywać zarodki w temperaturze 37 °C w pożywce M16 przed wstrzyknięciem komórek. Do wstrzyknięcia każdy zarodek przenosi się do silikonowego naczynia wypełnionego pożywką M16 podgrzaną w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie DNA lub komórki pod mikroskopem stereoskopowym
<ol>
	<li>Napełnij szklaną pipetę od tyłu strzykawką Hamiltona i potrząśnij pipetą, aby usunąć pęcherzyki na końcówce.</li>
	<li>Ustawić pipetę na uchwycie do mikroiniekcji, ustawić ciśnienie trzymania na 50 (DNA) lub 30 (komórki) hPa, a ciśnienie wtrysku na 150 (DNA) do 300 (komórki) hPa. Ustaw czas wstrzyknięcia na 0,2 sekundy (DNA) lub 0,5 sekundy (komórki). Ustawienia te mogą się nieznacznie różnić w zależności od typu mikroiniektora i pipety.</li>
	<li>Przypnij zarodek do silikonowego dna przez woreczek żółtkowy, nie dotykając właściwego zarodka. Obserwuj obszar serca i otwórz worek tuż nad tym obszarem.</li>
	<li>Dodaj 4 szpilki wokół zarodka, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas wstrzykiwania komórek.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora (ustawionego na ręczny) powoli ustawić końcówkę pipety pod kątem 45° nad osierdziem, tuż nad obszarem serca, który ma zostać wstrzyknięty (Rysunek 1).</li>
	<li>Przesunąć pipetę w obszar zainteresowania i uruchomić wstrzyknięcie. Wyjmij pipetę tak szybko, jak to możliwe. Upewnij się, że serce bije prawidłowo po wstrzyknięciu DNA/komórki.</li>
</ol>
4. Hodowla zarodków, izolowanych serc i eksplantatów
<ol>
	<li>Hodowla zarodków E9,5 w 25% M2 pożywce i 75% surowicy szczurzej, uzupełnionej penicyliną/streptomycyną, wstępnie ogrzanych w temperaturze 37 °C i natlenionych 40%O2.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do szklanej probówki o pojemności 25 ml, delikatnie dodać zarodek i natlenić 40%O2 przed nakręceniem nakrętki na probówkę. Inkubować do 36 godzin w temperaturze 37 °C, obracając lub wytrząsając (30 obrotów/min).</li>
	<li>W pożądanym momencie (np. 24 godziny) należy dokładnie wyciąć serca cienkimi kleszczami, nie dotykając serc, najpierw odcinając głowy zarodkom; serce można łatwo wyciąć, wyciągając je za pomocą dystalnej drogi odpływu.</li>
	<li>Hoduj izolowane serce przez kolejne 36-48 godzin w DMEM z 50% FCS na wkładce pokrytej Matrigelem umieszczonej w 12-dołkowej płytce. Zobacz Dyer & Patterson (2013) dla ulepszonego protokołu posiewu serca15.</li>
	<li>Wykonaj dowolny eksplantat z interesującego Cię regionu. Na przykład wypreparuj kanał przedsionkowo-komorowy (AVC) i hoduj go przez 48 godzin na żelu kolagenowymtypu 16.</li>
</ol>
5. Iniekcja pod kontrolą USG w serce w macicy
<ol>
	<li>Konfiguracja ultrasonografu i mikrowtryskiwacza:
	<ol>
		<li>Użyj systemu ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości z przetwornikiem 40 MHz i zestawem do mikroiniekcji na szynie.</li>
		<li>Ustawić objętość wstrzykniętego wtrysku na mikrowstrzykiwaczu na 69 nl na wstrzyknięcie. Zapoznaj się z instrukcją producenta mikroiniekcji, aby zapoznać się z instrukcją mikrowtryskiwacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zestawu do mikroiniekcji i iniekcja:
	<ol>
		<li>Umieścić szklaną mikropipetę w mikrowstrzykiwaczu. Aby zapewnić skuteczne wstrzykiwanie, należy najpierw pokryć wewnętrzną stronę pipety olejem mineralnym, zasysając do maksymalnej objętości. Następnie ponownie wysuń olej, pozostawiając 1-2 mm oleju wewnątrz igły.</li>
		<li>Wstrzykniętą iniekcję należy odsysać aż do osiągnięcia maksymalnej objętości. Należy uważać, aby nie dotknąć końcówką igły żadnych powierzchni, ponieważ może to spowodować stępienie końcówki i utrudnienie wstrzyknięcia.</li>
		<li>Aby ustabilizować róg macicy zawierający zarodki podczas wstrzyknięcia, należy użyć zmodyfikowanej szalki Petriego z otworem pośrodku (o średnicy 2,5 cm), pokrytej cienką silikonową membraną z małą szczeliną wyciętą pośrodku, i umieścić ją powyżej miejsca nacięcia. Ustabilizuj szalkę Petriego na stole do obsługi myszy, umieszczając 3-4 grudki gliny pod krawędziami naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura iniekcji:
	<ol>
		<li>Ogol brzuch ciężarnej myszy (w pożądanym stadium embrionalnym) przed znieczuleniem w celu usunięcia włosów. Potraktuj brzuch chemicznym środkiem do usuwania włosów, aby usunąć resztki włosów i wysterylizuj 70% etanolem.</li>
		<li>Znieczulij ciężarną mysz tlenem/izofluranem za pomocą maski na twarz. Użyj 3-5% izofluranu w 100% tlenu do wstępnego znieczulenia, a następnie 1-1,5% podczas pozostałej części zabiegu. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, delikatnie szczypiąc jej łapy i/lub ogon.</li>
		<li>Umieść mysz na wznak na stole do obsługi myszy (ustawionym na podgrzanie do 37 °C) i przykryj oczy smarem, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.</li>
		<li>Nałóż żel elektrodowy na elektrody i przyklej łapy do elektrod, aby monitorować tętno, częstość oddechów i EKG. Ustaw termometr doodbytniczy do monitorowania temperatury ciała.</li>
		<li>Sprawdź najpierw, czy mysz jest w ciąży, wizualizując i licząc zarodki za pomocą ultradźwięków. Nałóż żel ultradźwiękowy na brzuch i umieść głowicę skanującą nad pęcherzem. Aby zachować spójność, najpierw uwidocznij pęcherz moczowy i policz zarodki w lewym i prawym rogu macicy, zaczynając od pozycji pęcherza. Upewnij się, że serca embrionalne biją normalnie.</li>
		<li>Jeśli mysz jest w ciąży, umieść szalkę Petriego nad przyszłym miejscem nacięcia gliną. Lekko dociśnij naczynie do brzucha, tak aby naczynie miało bezpośredni kontakt.</li>
		<li>Wyjmij naczynie i ponownie wysterylizuj brzuch. Wykonaj 1,5-2 cm brzuszne nacięcie linii środkowej, około 0,75-1 cm powyżej pochwy, aby otworzyć brzuch i otrzewną. Unikaj obrażeń narządów wewnętrznych.</li>
		<li>Zewnętrzizuj lewy lub prawy róg macicy za pomocą kleszczy, delikatnie przeciągnij go przez silikonową membranę naczynia i ponownie ustabilizuj naczynie na glinie. Należy unikać intensywnego ciągnięcia lub manipulacji, ponieważ może to spowodować krwawienie z naczyń macicy i przedwczesną śmierć samicy i/lub zarodków.</li>
		<li>Należy ponownie policzyć zarodki, aby zapewnić odpowiednie prowadzenie dokumentacji dotyczącej tego, które zarodki zostały wstrzyknięte.</li>
		<li>Nałóż żel ultradźwiękowy na rogi macicy, aby zobrazować serce i zapobiec odwodnieniu.</li>
		<li>Wyobraź sobie pierwszy zarodek, który ma zostać wstrzyknięty. Sprawdzaj normalne bicie serca embrionalnego i prowadź zapisy orientacji czaszkowo-ogonowej i lewo-prawo zarodka. W razie potrzeby nieznacznie zmień położenie rogu macicy, aby zapewnić prawidłową orientację. Jeśli okaże się to trudne, przejdź do następnego zarodka.</li>
		<li>Ostrożnie nakłuć macicę igłą do mikroiniekcji, aby ustawić igłę pod kątem 45° nad zarodkiem, nieco poza osierdziem (ryc. 3). W celu znakowania komórek nasierdzia należy zobrazować serce w widoku czterokomorowym i ustawić igłę tak, aby była skierowana w stronę rowka przedsionkowo-komorowego (ryc. 3). Jeśli kąt wymaga regulacji, wyciągnij igłę i zmień położenie. Nie należy regulować kąta z igłą wewnątrz macicy, ponieważ może to spowodować złamanie igły. Unikaj nakłuwania innych tkanek, takich jak kończyny lub łożysko.</li>
		<li>Przyłóż igłę do ściany osierdzia i nakłuj ją delikatnym, ale szybkim ruchem. Ogólnie rzecz biorąc, będzie pewien opór, ale zbyt szybkie przesuwanie igły może spowodować, że końcówka igły przebije samo serce. Końcówka powinna kończyć się w przestrzeni osierdziowej rowka przedsionkowo-komorowego. W przypadku krwawienia z osierdzia komórki krwi będą widoczne jako biały wzór przypominający śnieg. W takim przypadku należy przerwać wstrzykiwanie zarodka i przejść do innego zarodka.</li>
		<li>Wstrzyknąć wstrzykiwany. Wstrzyknąć maksymalnie 700 nl do przestrzeni osierdziowej, aby zapobiec niekorzystnemu wpływowi na rozwój serca. Należy monitorować prawidłowe wstrzyknięcie przez niewielki, skroniowy obrzęk worka osierdziowego.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i upewnić się, że wstrzyknięty materiał może zostać wyrzucony, aby upewnić się, że igła nie została zatkana przez fragmenty tkanki.</li>
		<li>Zmień położenie stołu manipulacyjnego, aby zobrazować i wstrzyknąć następny zarodek. Liczbę wstrzykiwanych zarodków należy utrzymywać maksymalnie 3-4 (w jednym rogu macicy), aby zapobiec przedłużonemu znieczuleniu, umożliwić kontrolę zarodków w przeciwległym rogu macicy oraz zapewnić, że zabieg nie zaburzy rozwoju zarodka.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu pożądanej liczby zarodków należy usunąć nadmiar żelu do ultradźwięków i delikatnie umieścić róg macicy z powrotem w jamie brzusznej we właściwej pozycji.</li>
		<li>Zamknij brzuch matki, używając jednej warstwy szwu na otrzewną i mięśnie brzucha, a drugiej warstwy szwu na skórę.</li>
		<li>Wstrzyknij myszy pierwszą dawkę leku przeciwbólowego. Należy zastosować jedno wstrzyknięcie 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny na 15 minut przed zakończeniem znieczulenia i trzy dodatkowe wstrzyknięcia w odstępach 12-godzinnych.</li>
		<li>Przerwij znieczulenie i monitoruj mysz pod kątem odpowiedniej rekonwalescencji po zabiegu. Umieść ciężarną mysz w osobnej klatce na żądany czas obserwacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li>
<li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li>
<li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+the+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li>
<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vix.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane powyżej protokoły wstrzyknięć ex vivo do serca mają na celu zachowanie funkcji mięśnia sercowego przez co najmniej 48 godzin w zarodkach myszy w średnim stadium (E9.5-E11.5). Te metody iniekcji pozwalają na przestrzennie ukierunkowane wstrzykiwanie DNA lub komórek. Kilka przykładów pokazanych na rysunkach 1-3 stanowi dowód słuszności koncepcji nakreślenia ex vivo i in vivo molekularnych mechanizmów procesów rozwojowych, które zachodzą w ograniczonych regionach serca, ta...

Ponad dziesięć lat temu, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (HuESC) pochodziły z ludzkich blastocyst1. Od tego czasu komórki te stały się przedmiotem ważnej dziedziny badań, która odpowiada na nierozwiązane pytania w biologii rozwoju człowieka. Co więcej, badania HuESC dają nadzieję medycynie regeneracyjnej. W ostatnich latach ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zostały wygenerowane z komórek somatycznych specyficznych dla pacjenta, dostarczając modeli chorób genetycznych2. Opisano wiele protokołów in vitro różnicowania embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku różnych linii komórkowych, w tym linii serca3. Zróżnicowane komórki są często fenotypowane poprzez analizę ekspresji RNA i białek, barwienie immunologiczne i/lub testy funkcjonalne in vitro. Jednak pluripotencjalne pochodne komórek macierzystych muszą zostać umieszczone w odpowiednim środowisku embrionalnym, aby sprawdzić, czy w pełni przejmują los komórkowy swojego embrionalnego odpowiednika i czy podsumowują prawdziwą funkcję in vivo w odpowiedzi na sygnały regionalne. Chociaż inżynieria tkankowa jest obiecująca, nie dostarcza jeszcze wszystkich znanych i nieznanych wskazówek dotyczących prawidłowego rozwoju tkanki embrionalnej in vivo 4,5.
Znakowanie komórek za pomocą barwników lub wektorów retrowirusowych w embrionach, w tym embrionach myszy, przyniosło ważne informacje na temat embrionalnego pochodzenia linii komórkowych podczas rozwoju serca6. Na przykład wstrzyknięcie barwnika do przestrzeni osierdzia zarodków myszy ex vivo, a następnie hodowla in vitro izolowanych serc, zastosowano do znakowania komórek nasierdzia i ich potomków7. Jednak znakowanie barwnikami i komórkami retrowirusowymi stosuje się głównie do wczesnych zarodków myszy z wciąż słabo rozwiniętymi narządami lub zarodków kurzych, które są łatwiej dostępne8. Wyjątkiem jest mózg, który jest łatwiejszy do namierzenia w zarodkach9,10. Takie podejście nie zostało jeszcze zastosowane do bijącego embrionalnego serca myszy.
Aby uzupełnić bezpośrednie znakowanie barwnikami lub wirusem i przeprowadzić śledzenie linii u bardziej zaawansowanych zarodków myszy i dorosłych myszy, podejście do znakowania komórek zostało połączone z analizą myszy transgenicznych przy użyciu technologii Cre/Lox. Podejście Cre/Lox11 ma jednak pewne ograniczenia ze względu na czasoprzestrzenną specyficzność genomowych regionów regulatorowych wykorzystywanych do kierowania ekspresją rekombinazy oraz skuteczność rekombinacji Cre/Lox12. Co więcej, podejście to nie rozwiązuje w pełni konkretnych kwestii związanych z nabywaniem losu komórkowego przez migrację komórek, ponieważ może ono oznaczać prekursor dopiero po aktywacji regionu regulatorowego używanego do napędzania ekspresji Cre. Nie może ona również mieć zastosowania do embrionów ludzkich z oczywistych względów etycznych.
Biorąc pod uwagę te ograniczenia, zaprojektowaliśmy serię nowych protokołów do wstrzykiwania różnych środków znakujących komórki, takich jak barwniki fluorescencyjne, wirusy, modulatory ekspresji genów, takie jak shRNA i wektory znakowania komórek oparte na DNA, lub komórki w zarodku myszy na E9.5 i późniejszych etapach rozwoju w docelowych regionach serca.
Zastrzyki DNA/komórek wykorzystują stereomikroskop i proste urządzenie do mikroiniekcji w połączeniu z hodowlą zarodków ex vivo do 48 godzin, lub izolowaną hodowlą eksplantatów serca lub embrionu przez 48-72 godziny. Informujemy również o protokole mikroiniekcji za pośrednictwem ultradźwięków w embrionalnych sercach myszy w macicy. Technika ta umożliwia monitorowanie rozwoju zarodków13 i pozwala na długoterminową obserwację wstrzykniętych i/lub znakowanych komórek.
Stwierdziliśmy, że te podejścia zachowują funkcję narządu i zapewniają bardziej reprezentatywne środowisko niż badania potencjału komórek macierzystych in vitro. Daje również możliwość śledzenia migracji znakowanych i/lub wstrzykiwanych komórek w celu monitorowania ich losu. Ostatecznie powinno to pozwolić na lepsze zrozumienie regionalnych wzorców tkanek i kluczowych procesów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Konfiguracje/Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 MHz Przetwornik</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5242</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Azot</td><td></td><td></td><td>wymagany do zwiększenia ciśnienia w wtryskiwaczu</td></tr><tr><td>System szynowy</td><td>Rotator</td> VisualSonics <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>do obracania szklanej rurki z zarodkami wewnątrz inkubatora Standardowy</td>inkubator 5% CO2, 37 &#176;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> C</td></tr><tr>mikroskop<td>stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>borokrzemianowe rurki kapilarne</td> World <td>Precision Instrument</td><td>KTW-120-6</td><td>1.2-&mu; m średnica zewnętrzna</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter</td><td>Model P87</td><td></td></tr><tr><td>Igły do mikroiniekcji</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>OD/ID 1,14 mm/53 mm, z 50/35 &mu; m Końcówka OD/ID</td></tr><tr><td>Strzykawki Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td> Petriego <td>o średnicy 10 cm</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Membrana silikonowa</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4,3 x 4,3 cm</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>środek do usuwania włosów&nbsp;</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lubrykant do oczu</td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>Żel do elektrod (Signa)</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenex Buprenex (chlorowodorek buprenorfiny)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0,05-0,1 mg/kg w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td><mocne>Inne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pestki</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>o średnicy 60 mm</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do pożywek i kultur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 średni</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>wysoka glukoza i 50% surowica szczura</td></tr><tr><td>M16 średnia</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Surowica szczura</td><td>Janvier</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>Pennicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>tlen 40%</td> <td>Ciecz</td><td></td> powietrzna <td>wymagana do natlenienia pożywki hodowlanej zarodka</td></tr><tr><td>Surowica</td> <td>cielęca płoduFisher</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>do powlekania naczyń hodowlanych do hodowli eksplantatów</td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane</td><td>Holender /Pomarańczowy</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td>Injectates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDCFDA-SE</td><td>Sondy invitrogenowe/molekularne</td><td>C1165</td><td>25 mg/ml DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 &#176;C. Przed użyciem rozcieńczyć 1:100-200 w soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>lentiwirus wykazujący ekspresję PGK-GFP&nbsp;</td><td></td><td></td><td>~ 8E9 jednostek przetwornikowych / ml DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testowanie losów embrionalnych lub pluripotencjalnych pochodnych komórek macierzystych w protokołach in vitro doprowadziło do kontrowersyjnych wyników, które niekoniecznie odzwierciedlają ich potencjał in vivo. Najlepiej, aby komórki te zostały umieszczone w odpowiednim środowisku embrionalnym, aby uzyskać określony fenotyp. Co więcej, badania nad śledzeniem linii komórkowych u myszy po znakowaniu komórek barwnikami lub wektorami retrowirusowymi pozostały w większości ograniczone do zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju z wciąż słabo rozwiniętymi narządami. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zaprojektowaliśmy standardowe i ultradźwiękowe protokoły mikroiniekcji do wstrzykiwania różnych środków w docelowe regiony serca u zarodków myszy na E9,5 i późniejszych etapach rozwoju. Eksplantat lub zarodki embrionalne są następnie hodowane lub pozostawiane do dalszego rozwoju w macicy. Czynniki te obejmują barwniki fluorescencyjne, wirusy, shRNA lub komórki progenitorowe pochodzące z komórek macierzystych. Nasze metody pozwalają na zachowanie funkcji narządu przy jednoczesnym monitorowaniu migracji i losu znakowanych i/lub wstrzykiwanych komórek. Technologie te mogą zostać rozszerzone na inne narządy i będą bardzo pomocne w rozwiązywaniu kluczowych problemów biologicznych w biologii rozwoju.

Stosując opisane powyżej protokoły iniekcji, można znakować komórki i/lub wstrzykiwać je do embrionalnego serca myszy. Jako dowód słuszności koncepcji przedstawiono kilka przykładów, w których protokół iniekcji połączono z hodowlą ex vivo eksplantu AVC, izolowanego serca lub całego embrionu (Rysunek 1).
Rysunek 1 przedstawia przygotowanie zarodka przed wstrzyknięciem komórek. Zarodek E9.5 zostaje usunięty z decidui przy zachowaniu integralności pęcher...

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie iniekcji barwników komórkowych lub DNA do embrionalnych serc myszy. W celu zbadania przeżywalności komórek lub lokalnej manipulacji ekspresją genów, proces ten realizuje się poprzez najpierw wypreparowanie embrionów z ciężarnej myszy i odsłonięcie embrionalnego serca. Następnie barwnik DNA lub komórki są wstrzykiwane do docelowego obszaru zainteresowania w sercu.Następnie, po inkubacji zarodka, usuwa się serce i umieszcza je w hodowli. Na koniec, za pomocą mikroskopii określa się los wstrzykniętych lub znakowanych komórek. Ostatecznie, los wstrzykniętych, znakowanych lub zmodyfikowanych genetycznie komórek jest monitorowany przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii świetlnej i epifluorescencyjnej, co pozwala wykazać funkcjonalne znaczenie konkretnych genów i komórek podczas rozwoju serca.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza u myszy, jest możliwość lokalnego i precyzyjnego wstrzykiwania komórek laboratoryjnych lub zmodyfikowanych genetycznie in vivo. Pozwala to na badanie tych komórek w odpowiednim środowisku. Procedurę tę zaprezentujemy ja oraz Emily aar, doktorantka z laboratorium.Po przygotowaniu sprzętu, odczynników i roztworów zgodnie z protokołem tekstowym, pobierz zarodki E 9.5 i E 10.5 od uśpionej ciężarnej myszy; najpierw użyj 70% ethanol do sterylizacji klatki piersiowej, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, aby otworzyć jamę brzuszną i wyjąć róg macicy, a następnie przenieś go do PBS o temperaturze pokojowej. Po dwóch dodatkowych przemyciach w PBS przenieś róg macicy do szalki Petriego wypełnionej silikonem. W obecności pożywki M 16 użyj szpilek entomologicznych, aby przymocować róg macicy do warstwy silikonu w taki sposób, aby unaczyniona strona macicy znajdowała się poniżej.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety należy naciąć powierzchnię macicy i odciąć błonę naskórną na poziomie 1 mm poniżej powierzchni. Rozsunąć ściany błony naskórnej i ostrożnie wyłowić embrion wraz z pęcherzykiem żółtkowym. Przed przystąpieniem do iniekcji komórkowych embrion należy przechowywać w pożywce M 16 w temperaturze 37°C.Najpierw za pomocą strzykawki Hamiltona napełnij szklaną pipetę od tyłu DNA lub komórkami, a następnie potrząśnij pipetą, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Umieść końcówkę pipety w uchwycie do mikroiniekcji i skonfiguruj injektor zgodnie z poniższymi ustawieniami. Następnie przymocuj embrion do silikonowego dna, przebijając worek żółtkowy, tak aby nie dotknąć właściwego embrionu.Następnie należy zidentyfikować obszar serca i otworzyć worek tuż nad tym obszarem. Wokół zarodka należy umieścić cztery szpilki, aby zapobiec jego przemieszczaniu się podczas wstrzykiwania komórek. Używając mikromanipulatora w trybie ręcznym, należy powoli ustawić końcówkę pipety pod kątem 45 stopni nad osierdziem, tuż nad obszarem serca, w który będzie wykonywana iniekcja.Przesuń pipetę do obszaru zainteresowania, wyzwól wtryskiwanie i jak najszybciej wyjmij pipetę. Upewnij się, że serce bije prawidłowo po wstrzyknięciu DNA lub komórek. Stosując protokół wstrzykiwania opisany w tym filmie w celu zbadania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego, do eksplantu AVC w stadium E 9.5 wstrzyknięto shRNA obniżające poziom białka wymaganego do przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego komórek endokardialnych. Embrion kontrolny otrzymał wstrzyknięty pusty wektor szkieletowy; analogicznie, do AVC w stadium E 10.5 wstrzyknięto pochodzące z komórek hESC przedzaworkowe komórki śródbłonka wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą promotora SOX9, po czym serce eksplantowano i hodowano przez 48 godzin.Komórki te nabywają markerów EMT, takich jak periostyna, podobnie jak endogenne komórki endokardium. Przedstawione tutaj podejścia ex vivo są stosunkowo proste, lecz ograniczone do maksymalnie krótkookresowej obserwacji trwającej od 48 do 72 godzin. Jednak procedura wstrzykiwania pod kontrolą ultradźwięków opisana w protokole tekstowym stanowi podejście trudniejsze technicznie, ale oferuje możliwość długotrwałej obserwacji, nawet w okresie poporodowym w utero.Przedstawiono tutaj metodę wstrzykiwania barwników lub wektorów wirusowych in utero w celu znakowania komórek w konkretnych regionach serca. Dzięki tej metodzie możliwe jest specyficzne znakowanie komórek epikardium za pomocą barwników fluorescencyjnych lub wirusów, a metodę tę można rozszerzyć o podawanie komórek lub innych substancji wstrzykiwalnych. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metodę taką jak hodowla embrionów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące długoterminowego wpływu genu, cząsteczki lub odczytów długookresowych, takich jak morfogeneza tkanki po jej rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii rozwoju i genetyki serca. Umożliwia ona odkrywanie nowych genów, a także badanie losów ludzkich komórek w odpowiednim kontekście embrionalnym. Jest to szczególnie przydatne w sytuacjach, gdy nie ma dostępu do transgenicznej linii myszy.

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie komórek i wstrzyknięcie do rozwijających się zarodkowych serc myszy

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Badania rozwojowe na myszach są utrudnione przez niedostępność zarodka podczas ciąży. Aby promować długoterminową hodowlę embrionalnego serca w późnych stadiach ciąży, opracowaliśmy protokół, w którym wycięte serce jest hodowane w półstałym, rozcieńczonym Matrigelu.

Nowatorska metoda hodowli ex vivo embrionalnego serca myszy

Ten manuskrypt opisuje technikę wizualizacji rozwijającego się układu naczyniowego. Tutaj zastosowaliśmy in utero, wewnątrzsercowe mikrozastrzyki lektyny pomidorowej znakowanej FITC na zarodki myszy. Za pomocą tej techniki wyznaczamy naczynia perfundowane i nieperfundowane w całej nerce embrionalnej.

In Utero (w macicy) Dosercowe wstrzyknięcia pomidoro-lektyny na zarodki myszy w celu oceny przepływu krwi w nerkach

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Poznaj techniki wstrzykiwania komórek, barwników i DNA do rozwijających się serc embrionalnych myszy w celu badania losu komórek i lokalnej manipulacji ekspresją genów.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Przeglądaj więcej filmów