Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie iniekcji komórek obumierających lub DNA do embrionalnych serc myszy. W celu zbadania tkanki tłuszczowej lub miejscowego manipulowania ekspresją genów, dokonuje się tego poprzez najpierw wypreparowanie zarodków ciężarnej myszy i odsłonięcie embrionalnego serca. Następnie barwnik DNA lub komórki są wstrzykiwane do docelowego obszaru zainteresowania w sercu.

Następnie, po inkubacji zarodka, serce jest usuwane i umieszczane w hodowli. Na koniec los wstrzykniętych lub znakowanych komórek określa się za pomocą mikroskopii. Ostatecznie los wstrzykniętych, znakowanych lub genetycznie zmodyfikowanych komórek jest monitorowany za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii świetlnej i epifluorescencyjnej, ujawniając funkcjonalne znaczenie określonych genów i komórek podczas rozwoju serca.

Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak transgeneza u myszy, jest to, że możemy lokalnie i dokładnie wstrzykiwać komórki laboratoryjne lub genetycznie modyfikować in vivo. Pozwala to na badanie tych komórek w odpowiednim środowisku. Tę procedurę zademonstrujemy ja i Emily aar, doktorantka z laboratorium.

Po przygotowaniu sprzętu, odczynników i roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy pobrać zarodki E 9,5 i E 10,5 od ciężarnej myszy poddanej eutanazji, najpierw używając 70% etanolu do sterylizacji klatki piersiowej, wykonać brzuszne nacięcie linii środkowej, aby otworzyć brzuch i odzyskać róg macicy przed przeniesieniem go do PBS o temperaturze pokojowej. Po dwóch dodatkowych myciach w PBS przenieś go na wypełnioną silikonem szalkę Petriego. W przypadku podłoża M 16 użyj szpilek przeciw owadom, aby przypiąć róg macicy do warstwy silikonu tak, aby unaczyniona strona macicy znajdowała się pod spodem.

Następnie za pomocą cienkich kleszczyków przeciąć powierzchnię macicy i przykryć orzech liściasty na głębokości jednego milimetra pod powierzchnią. Rozłóż ścianki decidua i delikatnie wyjmij zarodek w woreczku z żółtkiem. Przechowywać go w M 16, pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem komórek w celu przeprowadzenia wstrzyknięć.

Najpierw użyj strzykawki Hamiltona, aby napełnić szklaną pipetę od tyłu DNA lub komórkami i potrząśnij pipetą, aby usunąć pęcherzyki. Na końcówce umieścić pipetę na uchwycie do mikroiniekcji i ustawić wtryskiwacz zgodnie z poniższymi ustawieniami. Następnie przypnij zarodek do silikonowego dna przez worek z żółtkiem, nie dotykając właściwego zarodka.

Następnie zidentyfikuj obszar serca i otwórz worek tuż nad tym obszarem. Dodaj cztery szpilki wokół zarodka, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas wstrzykiwania komórek. Używając mikromanipulatora ustawionego na tryb ręczny, powoli ustaw końcówkę pipety pod kątem 45 stopni nad osierdziem, tuż nad obszarem serca, który ma być wstrzyknięty.

Przesunąć pipetę w obszar zainteresowania, uruchomić wstrzyknięcie i wyjąć pipetę tak szybko, jak to możliwe. Upewnij się, że serce bije prawidłowo po wstrzyknięciu DNA lub komórki Korzystając z protokołu iniekcji opisanego w tym filmie, aby zbadać przejście nabłonka do mezenchymy i E 9.5 VC, explan VC został wstrzyknięty z S-H-R-N-A, który obniża poziom białka wymaganego do śródbłonkowego przejścia mezenchymalnego komórek wsierdzia. Zarodkowi kontrolnemu wstrzyknięto pusty wektor szkieletowy, podobnie komórki przedzastawkowe śródbłonka pochodzące z komórek HUES wyrażające GFP pod kontrolą promotora SOX 9 wstrzyknięto do A VC przy E 10,5, a następnie 48 godzin eksplantowanej hodowli serca.

Komórki te nabywają markery EMT, takie jak periostyna, podobnie jak endogenne komórki wsierdzia. Zademonstrowane tutaj podejścia ex vivo są stosunkowo łatwe, ale ograniczone do maksymalnej krótkoterminowej obserwacji trwającej od 48 do 72 godzin. Jednak procedura iniekcji pod kontrolą USG opisana w protokole tekstowym zapewnia technicznie trudniejsze podejście, ale z opcją długiej, nawet poporodowej obserwacji w macicy.

Pokazano tutaj wstrzykiwanie in utero barwnika lub wektorów wirusowych w celu znakowania komórek w określonych regionach serca. Dzięki tej metodzie można uzyskać specyficzne znakowanie komórek nasierdzia za pomocą barwników fluorescencyjnych lub wirusa, a metodę można rozszerzyć o komórki lub alternatywne zastrzyki. Postępując zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić metodę, taką jak hodowla mszaków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak długoterminowy wpływ genu, cząsteczki lub długi odczyt listy, taki jak morfogeneza tkanki po jej rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii rozwojowej serca i genetyki. Pozwala nam to na eksplorację świata nowych genów, a także na badanie losu komórek ludzkich we właściwym kontekście embrionalnym. Jest to bardzo przydatne, gdy linia myszy transgenicznych nie jest dostępna.