Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy
17 kwietnia 2014
Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie iniekcji komórek obumierających lub DNA do embrionalnych serc myszy. W celu zbadania tkanki tłuszczowej lub miejscowego manipulowania ekspresją genów, dokonuje się tego poprzez najpierw wypreparowanie zarodków ciężarnej myszy i odsłonięcie embrionalnego serca. Następnie barwnik DNA lub komórki są wstrzykiwane do docelowego obszaru zainteresowania w sercu.
Następnie, po inkubacji zarodka, serce jest usuwane i umieszczane w hodowli. Na koniec los wstrzykniętych lub znakowanych komórek określa się za pomocą mikroskopii. Ostatecznie los wstrzykniętych, znakowanych lub genetycznie zmodyfikowanych komórek jest monitorowany za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii świetlnej i epifluorescencyjnej, ujawniając funkcjonalne znaczenie określonych genów i komórek podczas rozwoju serca.
Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak transgeneza u myszy, jest to, że możemy lokalnie i dokładnie wstrzykiwać komórki laboratoryjne lub genetycznie modyfikować in vivo. Pozwala to na badanie tych komórek w odpowiednim środowisku. Tę procedurę zademonstrujemy ja i Emily aar, doktorantka z laboratorium.
Po przygotowaniu sprzętu, odczynników i roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy pobrać zarodki E 9,5 i E 10,5 od ciężarnej myszy poddanej eutanazji, najpierw używając 70% etanolu do sterylizacji klatki piersiowej, wykonać brzuszne nacięcie linii środkowej, aby otworzyć brzuch i odzyskać róg macicy przed przeniesieniem go do PBS o temperaturze pokojowej. Po dwóch dodatkowych myciach w PBS przenieś go na wypełnioną silikonem szalkę Petriego. W przypadku podłoża M 16 użyj szpilek przeciw owadom, aby przypiąć róg macicy do warstwy silikonu tak, aby unaczyniona strona macicy znajdowała się pod spodem.
Następnie za pomocą cienkich kleszczyków przeciąć powierzchnię macicy i przykryć orzech liściasty na głębokości jednego milimetra pod powierzchnią. Rozłóż ścianki decidua i delikatnie wyjmij zarodek w woreczku z żółtkiem. Przechowywać go w M 16, pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem komórek w celu przeprowadzenia wstrzyknięć.
Najpierw użyj strzykawki Hamiltona, aby napełnić szklaną pipetę od tyłu DNA lub komórkami i potrząśnij pipetą, aby usunąć pęcherzyki. Na końcówce umieścić pipetę na uchwycie do mikroiniekcji i ustawić wtryskiwacz zgodnie z poniższymi ustawieniami. Następnie przypnij zarodek do silikonowego dna przez worek z żółtkiem, nie dotykając właściwego zarodka.
Następnie zidentyfikuj obszar serca i otwórz worek tuż nad tym obszarem. Dodaj cztery szpilki wokół zarodka, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas wstrzykiwania komórek. Używając mikromanipulatora ustawionego na tryb ręczny, powoli ustaw końcówkę pipety pod kątem 45 stopni nad osierdziem, tuż nad obszarem serca, który ma być wstrzyknięty.
Przesunąć pipetę w obszar zainteresowania, uruchomić wstrzyknięcie i wyjąć pipetę tak szybko, jak to możliwe. Upewnij się, że serce bije prawidłowo po wstrzyknięciu DNA lub komórki Korzystając z protokołu iniekcji opisanego w tym filmie, aby zbadać przejście nabłonka do mezenchymy i E 9.5 VC, explan VC został wstrzyknięty z S-H-R-N-A, który obniża poziom białka wymaganego do śródbłonkowego przejścia mezenchymalnego komórek wsierdzia. Zarodkowi kontrolnemu wstrzyknięto pusty wektor szkieletowy, podobnie komórki przedzastawkowe śródbłonka pochodzące z komórek HUES wyrażające GFP pod kontrolą promotora SOX 9 wstrzyknięto do A VC przy E 10,5, a następnie 48 godzin eksplantowanej hodowli serca.
Komórki te nabywają markery EMT, takie jak periostyna, podobnie jak endogenne komórki wsierdzia. Zademonstrowane tutaj podejścia ex vivo są stosunkowo łatwe, ale ograniczone do maksymalnej krótkoterminowej obserwacji trwającej od 48 do 72 godzin. Jednak procedura iniekcji pod kontrolą USG opisana w protokole tekstowym zapewnia technicznie trudniejsze podejście, ale z opcją długiej, nawet poporodowej obserwacji w macicy.
Pokazano tutaj wstrzykiwanie in utero barwnika lub wektorów wirusowych w celu znakowania komórek w określonych regionach serca. Dzięki tej metodzie można uzyskać specyficzne znakowanie komórek nasierdzia za pomocą barwników fluorescencyjnych lub wirusa, a metodę można rozszerzyć o komórki lub alternatywne zastrzyki. Postępując zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić metodę, taką jak hodowla mszaków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak długoterminowy wpływ genu, cząsteczki lub długi odczyt listy, taki jak morfogeneza tkanki po jej rozwoju.
Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii rozwojowej serca i genetyki. Pozwala nam to na eksplorację świata nowych genów, a także na badanie losu komórek ludzkich we właściwym kontekście embrionalnym. Jest to bardzo przydatne, gdy linia myszy transgenicznych nie jest dostępna.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metody wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek do zarodkowych serc myszy w celu monitorowania losu komórek i fenotypu. Techniki te mogą być stosowane od 9,5 dnia zarodkowego (E) i późniejszych etapów rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Tło
- Zrozumienie losu komórek i ekspresji genów jest kluczowe w rozwoju serca.
- Zarodkowe modele myszy dostarczają informacji na temat procesów komórkowych.
- Techniki wstrzykiwania umożliwiają ukierunkowane manipulowanie komórkami i genami.
- Techniki monitorowania obejmują mikroskopię do szczegółowej analizy.
Cel badania
- Zbadanie losu wstrzykniętych komórek i ich zmian fenotypu.
- Ukierunkowana manipulacja ekspresją genów w zarodkowych sercach.
- Zgłębienie rozwoju serca i funkcji genów.
Stosowane metody
- Rozebranie zarodków od ciężarnych myszy.
- Odsłonięcie zarodkowych serc do ukierunkowanych wstrzyknięć.
- Wstrzykiwanie DNA, barwników lub komórek do określonych regionów serca.
- Inkubacja i hodowla serc po wstrzyknięciu.
Główne wyniki
- Ustanowiono skuteczne techniki wstrzykiwania dla różnych substancji.
- Los komórek był skutecznie monitorowany za pomocą mikroskopii.
- Ujawniono funkcjonalne znaczenie określonych genów w trakcie rozwoju.
- Zdobyto wgląd w rolę wszczepowanych i endogennych komórek.
Wnioski
- Metody zapewniają ramy dla badań nad rozwojem serca.
- Techniki wstrzykiwania mogą być dostosowane do różnych potrzeb eksperymentalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zgłębić funkcje genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct cell labeling and microinjection into embryonic mouse hearts enables precise fate mapping and functional interrogation of stem cell derivatives in a physiologically relevant context. This approach addresses the translational gap between in vitro differentiation outcomes and in vivo developmental potential, supporting higher predictive confidence in early cardiac target validation. The method is strategically positioned for de-risking candidate cell therapies and gene function studies in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of stem cell-derived progenitors in a native embryonic environment for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing localized gene manipulation and lineage tracing in developing cardiac tissue.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene and cell function during organogenesis.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for validating cell labeling and tracking reagents in a complex, physiologically relevant system.
- Enables reproducible delivery of dyes, viral vectors, or shRNAs to defined cardiac regions for quantitative readouts.
- Supports assay standardization for cell fate and migration analysis using advanced microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling long-term in utero tracking of cell fate and gene function.
- Bridges discovery and preclinical validation by supporting continuity from ex vivo to in utero developmental studies.
- De-risks translational advancement by providing evidence of cell integration and phenotypic acquisition in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection and labeling workflow integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development for cardiac research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of gene and cell function in cardiac development.
- Screening: Enables reproducible, region-specific delivery of experimental agents for quantitative fate mapping.
- Analytics: Provides high-resolution microscopy-based readouts for comparative analysis of cell fate and gene expression.
- Translational Research: Facilitates long-term in utero studies to assess developmental and functional outcomes of candidate interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to other organs and developmental contexts for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell fate and gene function studies by leveraging physiologically relevant models.
- Operational Value: Standardizes microinjection and labeling protocols for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust in vivo validation data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based and genetic interventions for cardiac development programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, microinjection, and advanced microscopy techniques.
- Demands access to specialized instrumentation such as micromanipulators and ultrasound-guided injection systems for in utero studies.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, injection, and imaging protocols for reproducible outcomes.
- Adaptation to other organ systems may require protocol optimization and validation.
- Short-term ex vivo culture limits follow-up duration, while in utero approaches increase technical complexity.
