Name: Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj techniki barwienia histochemicznego drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana. Metoda obejmuje zatopienie łodyg, skrawanie i różnicowe barwienie tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Sabinowi Russellowi za pomoc w edycji. Prace te były częścią Wspólnego Instytutu Bioenergii DOE (http://www.jbei.org) wspieranego przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych, na mocy umowy DE-AC02-05CH11231 między Lawrence Berkeley National Laboratory a Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych.

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Sekcje macierzyste A. thaliana są szeroko stosowane do badania organizacji komórek w wtórnej ścianie komórkowej oraz do jakościowego badania różnic między roślinami typu dzikiego a transgenicznymi. Powszechnie stosowanymi technikami cięcia próbek są bezpośrednie cięcie ręczne; lub gdy próbki są osadzone w agarozie lub utrwalaczu, cięcie można wykonać za pomocą wibratomu lub mikrotomu. W przeciwieństwie do cięcia ręcznego, dwie ostatnie pozwalają zmniejszyć ryzyko uzyskania niedokładnych różnic między próbkami, k...

Roślinna ściana komórkowa zawiera mnóstwo informacji w różnych składnikach: ligninie, celulozie, hemicelulozach (ksylana, glukuronoksylanu, ksyllukanu, arabinoksylanu, mieszanym glukan lub glukomannanu) i pektynie. Techniki histologiczne dostarczają ważnych wskazówek wizualnych w badaniu różnic w wtórnych ścianach komórkowych na poziomie organizacyjnym i komórkowym. Opracowano różne techniki histologiczne, które można znaleźć w literaturze, ale techniki te mogą być trudne i czasochłonne dla początkujących, ponieważ bardzo szczegółowe protokoły z prostymi instrukcjami wizualnymi są rzadko, jeśli w ogóle, dostępne. Celem tego badania jest dostarczenie prostych wskazówek dotyczących technik barwienia histologicznego w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów.
Cięcie tkanki macierzystej jest pierwszym krokiem w wizualizacji ścian komórkowych i kształtów komórek. Chociaż ręcznie wycinane sekcje są niedrogie i zajmują mniej czasu na przygotowanie, użycie wibratomu zapewnia spójność i daje wysokiej jakości obrazy. Użycie wibratomu pozwala na uzyskanie lepszej jakości danych poprzez generowanie równych odcinków o tej samej grubości, co pomaga uzyskać ostre obrazy i znacznie zmniejsza ryzyko powstania niedokładnych różnic między próbkami, które byłyby po prostu spowodowane złym przygotowaniem próbki. Używanie żywic do utrwalania świeżych próbek może być wyzwaniem dla początkujących i może być czasochłonne nawet dla ekspertów, gdy analiza musi być wykonana szybko. Ponadto niemożliwe staje się zmierzenie jakiejkolwiek aktywności biologicznej próbki, gdy została ona osadzona w żywicy. Jedna prosta technika, która wykorzystuje agarozę i domową pleśń, jest pomocna w osadzaniu tkanek łodygi, a także może być wykorzystywana w innych zastosowaniach wymagających sekcji tkanek miękkich. W porównaniu z zatapianiem próbek w żywicy, metoda ta ma tę zaletę, że utrzymuje tkanki przy życiu i ogranicza manipulację próbką. Cięcie tkanek za pomocą wibratomu jest bardzo precyzyjne i pozwala na uzyskanie jednorodnych skrawków, które w zależności od celu badania można następnie zastosować z kilkoma różnymi technikami barwienia.
Najprostsze metody wizualizacji ligniny i innych aromatów wykorzystują światło ultrafioletowe (UV). Wzbudzanie cząsteczek aromatycznych za pomocą światła UV jest starą techniką, ale nadal jest to jedno z najszybszych podejść do wizualizacji ligniny. Jednak wizualizacja UV w rzeczywistości nie jest idealna do wykrywania ligniny, ponieważ światło UV pobudza inne aromaty. Lignina składa się głównie z trzech elementów budulcowych, monolignoli (alkoholi hydroksycynamonylowych: alkohol oniferylowy, alkohol sinapylowy i alkohol p-kumarylowy)1-3. Barwienie floroglucynolem może dostarczyć wskazówek co do stopnia obecności aldehydów cynamonowych w ksylemie, błonniku i tkankach tchawicy4. Floglucynol jest dobrym wskaźnikiem ogólnych aldehydów cynamonowych i może odróżniać aldehydy cynamonowe od innych aromatów. Monomery alkoholu sinapylowego można wykryć i rozróżnić za pomocą barwnika Mäule. Błękit toluidynowy O jest barwnikiem polichromatycznym i dlatego ma zdolność barwienia różnych elementów ściany komórkowej na różne kolory5,6. Podstawowym zastosowaniem błękitu toluidynowego O jest wykrywanie pektyny i ligniny5,6. Zaletą stosowania błękitu toluidynowego O jest to, że wiele elementów ściany komórkowej można uwidocznić w jednym kroku. Zarówno calcofluor white, jak i congo red są łatwe w obróbce i mogą być używane do wizualizacji celulozy. Biel kalkofluorowa barwi celulozę, modzel i inne niepodstawione lub słabo podstawione β-glukany6-9, podczas gdy czerwień kongo barwi bezpośrednio β-(1→4)-glukany, a zwłaszcza celulozę10,11. Celem tego badania jest dostarczenie prostych wskazówek dotyczących stosowania wyżej wymienionych technik barwienia w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów z łodyg A. thaliana.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Numer CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Floroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihydroksybenzen [Numer CAS: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Numer CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Numer CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Chlorek blutenu, chlorek tolonu [numer CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Nadmanganian potasu</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>Numer CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Numer CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Kongo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>3,3'-[[1,1'-bifenylo]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno-1-sulfonian) [numer CAS 573-58-0]</td></tr> <tr><td>Rozjaśniacz fluorescencyjny 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>Kwas 4,4'-bis[[4-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-6-anilino-1,3,5-triazyno-2-ylo]amino]stilben-2,2'-disulfonowy [numer CAS 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Wibrujące ostrze mikrotom VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>Amerykańska firma zajmująca się maszynkami do golenia</td><td>Pozycja # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Ostrze o podwójnej krawędzi ze stali nierdzewnej (Personna Super)</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z nakrętką (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Rękawica</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Rękawica do ochrony gorącej dłoni</td></tr><tr><td>Klej tkankowy</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Przechowuj pod adresem 4 & deg; C lub 20 &deg; C na 3 miesiące lub dłużej przechowywania</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Błyskawiczny klej tkankowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera z chipem CCD bez migawki mechanicznej&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera kolorowa&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Oprogramowanie kamery RTV <td></td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph wersja 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie analizy&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Okulary nakrywkowe są odporne na korozję oraz jednolicie grube i płaskie. Grubość nr 1 wynosi od 0,13 do 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka matowe, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Opakowanie Alcan</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Kostka filtracyjna</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>Filtr używany do analizy czerwieni Kongo o paśmie przepustowym 560/40.</td></tr></tbody></table>

barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej arabidopsis thaliana

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana jest organizmem modelowym powszechnie używanym do zrozumienia i manipulowania różnymi procesami komórkowymi u roślin, i był szeroko stosowany w badaniach nad wtórnym tworzeniem ścian komórkowych. Wtórne odkładanie się ściany komórkowej następuje po ułożeniu pierwotnej ściany komórkowej, proces przeprowadzany wyłącznie przez wyspecjalizowane komórki, takie jak te tworzące naczynia krwionośne i tkanki włókniste. Większość drugorzędowych ścian komórkowych składa się z celulozy (40–50%), hemicelulozy (25–30%) i ligniny (20–30%). Wyizolowano kilka mutacji wpływających na wtórną biosyntezę ściany komórkowej, a odpowiadające im mutanty mogą, ale nie muszą, wykazywać oczywiste zmiany składu biochemicznego lub fenotypy wizualne, ponieważ mutacje te mogą być maskowane przez reakcje kompensacyjne. Procedury barwienia były historycznie stosowane w celu pokazania różnic na podstawie komórkowej. Metody te są wyłącznie wizualnymi środkami analizy; Niemniej jednak ich rola w szybkiej i krytycznej analizie ma ogromne znaczenie. Czerwień kongijska i biel kalkofluorowa są barwnikami używanymi do wykrywania polisacharydów, podczas gdy Mäule i floroglucynol są powszechnie używane do określania różnic w ligninie, a błękit toluidynowy O jest używany do różnicowego barwienia polisacharydów i ligniny. Pozornie proste techniki cięcia, barwienia i obrazowania mogą być wyzwaniem dla początkujących. Począwszy od przygotowania próbki przy użyciu modelu A. thaliana, badanie to szczegółowo opisuje protokoły różnych metodologii barwienia, które można łatwo wdrożyć do obserwacji organizacji komórek i tkanek w wtórnych ścianach komórkowych roślin.

Zatopienie i krojenie łodyg: 
Zastosowanie wykonanej własnoręcznie plastikowej formy do zatapiania łodyg w 7% agarozie okazało się szybkie i łatwe (Rysunek 1). Dwie części (A i B; Rysunek 1) systemu z fiolkami ułatwiają szybkie uwalnianie łodygi zatopionej w agarozie, ponieważ agaroza nie przykleja się do obojętnych części fiolek, co pozwala zachować system w czystości. Fiolki mogą być wielokrotnie wykorzystywane przez lata. Wygoda przechowywania zatopionej łodygi ułatwia również kole...

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie barwienia histochemicznego elementów wtórnej ściany komórkowej ANA Arabidopsis. W tym celu najpierw łodygę rośliny zatapia się w żywicy aros. Następnie zatopioną w aros łodygę wyjmuje się z formy i przenosi na krążki do preparatów, które są następnie cięte w poprzeczne przekroje łodygi przy użyciu wibratomu.Następnie preparaty poddaje się różnym procedurom barwienia histochemicznego. Ostatecznie, za pomocą mikroskopii wykazuje się zróżnicowane zmiany w elementach wtórnej ściany komórkowej uzyskane dzięki barwieniu histochemicznemu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ściany komórkowej, takie jak zmiany w tkankach plamistych w łodygach roślin.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ proste, lecz kluczowe kroki opisane w niniejszych protokołach nie były wcześniej szczegółowo udokumentowane ani przedstawione w przystępny sposób. Na początek należy przygotować domowej roboty formę do zatapiania łodyg, wykorzystując plastikowe probówki. Najpierw za pomocą żyletki należy odciąć stożkowate dno probówki do mikrowirówki z nakrętką o pojemności 2 mL.Ten element określany jest jako część A, z otworem w nakrętce probówki wykonanym za pomocą igły strzykawki, nieco większym niż średnica osadzanego trzpienia. Następnie odciąć pół centymetra dna probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 mililitra. Element ten będzie określany jako część B. Wprowadzić odcięty fragment probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 mililitra do wcześniej przygotowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mililitrów.Uszczelnij obie części za pomocą paraformy. Za pomocą żyletki wytnij fragment łodygi z obszaru zainteresowania, a następnie rozpuść 7% roztwór aros w kuchence mikrofalowej przy niskiej mocy. Gdy roztopiony aros ostygnie do około 50 °C, powoli pipetuj pięć mililitrów agros do wcześniej przygotowanej plastikowej formy, aby wypełnić fiolkę.Po schłodzeniu aros przez 30 do 60 sekund, aż stanie się półstały, należy umieścić trzpień w fiolce wypełnionej aeros. Następnie należy założyć perforowaną zakrętkę w taki sposób, aby końcówka trzpienia została przez nią unieruchomiona. Fiolkę pozostawia się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsius za 10 do 30 minut, aż do całkowitego stężenia.Usuń formę, delikatnie wysuwając ją z probówki. Otwórz parafilm i kciukiem lekko naciśnij dno części B formy, aby przenieść utwardzony aros z części A na szkiełko mikroskopowe. Wykonaj przekrój.Przecięto łodygę osadzoną w obręczy na trzy mniej więcej równe części o długości 1,2 centymetra. Część łodygi znajdującą się poza obręczą została wycięta i odrzucona. Należy upewnić się, że krążek z preparatem jest czysty i całkowicie suchy.Użyj miękkich ręczników papierowych, aby usunąć wilgoć z bloku aros zawierającego preparaty. Nanieś małą kroplę kleju tkankowego na dysk do preparatów. Szybko ustaw blok aros tak, aby preparaty znajdowały się prostopadle do płytki w przypadku przekrojów poprzecznych lub równolegle do płytki.W przypadku przekrojów podłużnych należy pozostawić klej do utrwalenia próbki na dysku do preparatów w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 do 30 minut. Ustal dysk z preparatem w kuwecie z buforem lub w bloku z wosku w taki sposób, aby przekroje były równoległe do ostrza brzytwy. Napełnij kuwetę z buforem wodą destylowaną w temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie zanurzone.Przetnij żyletkę na pół, a następnie przytnij końce wytrzymałymi nożyczkami tak, aby ostrze pozostało całkowicie płaskie. Przymocuj jedną połowę przeciętej żyletki do uchwytu noża. Ustaw kąt w uchwycie noża na 84 stopnie, prędkość na 0.90 mm/s oraz częstotliwość na 50 Hz.Przygotuj skrawki o grubości 100 micron, korzystając z trybu ciągłego. Podczas krojenia w kuwecie z buforem zbieraj skrawki za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Przenieś kilka skrawków do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów w celu barwienia fluorolem.Przenieś przekroje łodygi do probówki do mikrocentryfugi. Do probówki dodaj jeden mililitr roztworu fluorolu i natychmiast ją zakręć. Ponieważ kwas solny zawarty w barwniku fluoroglukanolu jest silnie korozyjny, delikatnie potrząśnij probówką, aby upewnić się, że wszystkie przekroje zostały zabarwione.Ostrożnie przenieś przekroje za pomocą odciętego końcówki pipety na szkiełko przedmiotowe. Przykryj przekroje szkiełkiem cover slip. Obserwuj przekroje w świetle przechodzącym.Roztwór wysycha w ciągu od pięciu do 10 minut, co powoduje degradację preparatów. W związku z tym obrazowanie musi zostać zakończone w tym przedziale czasowym. W przypadku niewłaściwego barwienia przenieś przekroje łodygi do probówki do mikrocentryfugi.Do probówki zawierającej przekroje należy dodać jeden mililitr 0,5% roztworu nadmanganianu potasu. Roztwór 0,5% nadmanganianu potasu należy delikatnie pipetować w górę i w dół, starając się nie naruszać przekrojów. Po dwuminutowej inkubacji i ponownym pipetowaniu należy pozostawić probówkę do mikrocentryfugi do momentu, aż wszystkie przekroje opadną na dno.Używając pipety o objętości 1 ml, pobierz 700 µL 0,5% roztworu nadmanganianu potasu, a następnie dodaj 700 µL wody destylowanej, aby wypłukać nadmanganian potasu. Powtórz tę czynność od trzech do czterech razy lub do momentu, aż roztwór wodny pozostanie przejrzysty. Po odlaniu wody szybko dodaj 1 ml 3% kwasu solnego, aż ciemnobrązowy kolor zniknie z przekrojów.Może to nastąpić w ciągu trzech do pięciu minut lub może wymagać dwóch płukań po pięć minut. Odpipetuj cały roztwór 3% kwasu solnego i natychmiast dodaj jeden mililitr stężonego roztworu wodorotlenku amonu. Przed obrazowaniem w świetle jasnego pola w celu oceny barwienia czerwienią Kongo, przenieś przekroje łodygi do probówki do mikrowirówki i dodaj jeden mililitr 0,5% roztworu czerwieni Kongo.Ostrożnie pipetuj 0,5% roztwór czerwieni kongowego w górę i w dół, nie naruszając przekrojów. Przed inkubacją i płukaniem przekrojów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, delikatnie przenieś preparaty za pomocą odciętej końcówki pipety na szkiełko przedmiotowe. Następnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.Obserwuj próbki pod mikroskopem. Przesuń preparat pod wzbudzenie światłem niebieskim, stosując filtr emisji 560 nanometrów dla barwienia calcior white. Przenieś przekroje łodygi do probówki do mikrowirówki i dodaj jeden mililitr 0,02% roztworu calcior white.Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół. Następnie inkubuj i przemywaj przekroje zgodnie ze szczegółowym protokołem tekstowym, a potem obserwuj je w świetle UV. W przypadku barwienia błękitem toluidyny przenieś przekroje łodygi do probówki do mikrowirówki.Następnie do probówki należy dodać jeden mililitr 0,02% roztworu błękitu toluidyny O i delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół. Następnie należy inkubować i płukać preparaty zgodnie z opisem w protokole tekstowym przed ich obserwacją w świetle jasnego pola. Szczegółowe informacje na temat ustawień mikroskopu i kamery do obrazowania, a także procedura obrazowania w ultrafiolecie i jasnym polu znajdują się w protokole tekstowym.Związki aromatyczne, w tym lignina w komórkach, mogą być wizualizowane dzięki ich autofluorescencji w świetle UV. Ksylem oraz włókna interf wykazywały autofluorescencję pod wpływem promieniowania UV, lecz nie zaobserwowano jej w rdzeniu, korze ani epidermie, ponieważ lignina i polimer aromatyczny są odkładane podczas wtórnego wzrostu komórek, podczas gdy barwnik fluorol reaguje z grupami końcowymi aldehydowymi ligniny, nadając jej różowy lub fuksjowy kolor, co jest widoczne pod wpływem promieniowania UV. Kolor fuksjowy jest widoczny w ksylemie i włóknach interf, ale nie występuje w rdzeniu, korze ani epidermie.Zazwyczaj intensywność barwienia koreluje z poziomem lignifikacji w sposób jakościowy. Barwienie MALS jest specyficzne w wykrywaniu jednostek ligniny ingal w ksylemie i włóknach interf. Czerwone zabarwienie wskazuje na obecność jednostek ligniny ingal w elementach ligniny.Zaobserwowano jednak intensywniejsze czerwone zabarwienie włókien w porównaniu z tkankami ksylemu, co sugeruje, że włókna zawierają wyższy poziom ligniny typu ingal, podczas gdy ksylem jest bardziej wzbogacony w jednostki ligniny typu gua. Przekroje łodygi barwione calcior white obserwowano w świetle UV, co wykazało zabarwienie epidermy, kory i rdzenia, ponieważ wszystkie te tkanki zawierały celulozę jako główny polimer polisacharydowy w swoich ścianach komórkowych. Przekroje barwione czerwienią Kongo obserwowano przy wzbudzeniu światłem niebieskim, co również doprowadziło do zabarwienia epidermy, kory i rdzenia.W przeciwieństwie do barwienia calciorem, czerwień Konga lepiej barwi polisacharydy w ksylemie i włóknach interfazowych i wydawała się mniej podatna na wpływ obecności ligniny. Odine Blue O jest klasyfikowany jako barwnik polichromatyczny, ponieważ daje wielokolorowy preparat. Odine Blue O jest barwnikiem kationowym, który wiąże się z grupami naładowanymi ujemnie i generuje różne kolory.Kiedy barwnik wiąże się z różnymi grupami jonowymi w komórce, barwienie błękitem stain blue O przekrojów poprzecznych łodyg ujawniło, że ksylem i włókna międzywiązki są zdrewniałe, ponieważ wykazują one kolor zielono-niebieski lub niebieski, co jest zgodne z wynikami analizy UV i fluoroglucanem. Wszystkie obserwacje barwienia w przeciwieństwie do tego, tkanki rdzenia, kory i epidermy wykazują kolor zielono-niebieski lub niebieski, ponieważ mimo że nie są zdrewniałe, zawierają w swoich ścianach komórkowych niektóre polimery pektynowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykonywać przekroje poprzeczne łodyg roślin oraz jak różnicowo barwić poszczególne tkanki ściany komórkowej roślin za pomocą różnych barwników histochemicznych.

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Histochemiczne barwienie elementów Arabidopsis thaliana wtórnej ściany komórkowej

W tym filmie opisujemy technikę barwienia Wiesnera do barwienia ligniny obecnej w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych. Ta technika barwienia pomaga uwidocznić zdrewniałe ściany komórkowe w łodygach Arabidopsis thaliana i pomaga określić ilościowo zdrewnienie w ścianach komórkowych różnych typów komórek.

Barwienie Wiesnera do wizualizacji ligniny: technika barwienia złogów ligniny obecnych w łodygach Arabidopsis thaliana

W tym filmie opisujemy technikę barwienia Maule do barwienia ligniny syringylowej obecnej w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych. Ta technika barwienia pomaga scharakteryzować rozkład ligniny we włóknach ksylemu i międzypęczkowych.

Barwienie ligniny: technika charakteryzowania dystrybucji ligniny w skrawkach łodyg Arabidopsis thaliana

W tym filmie demonstrujemy metodę barwienia czerwienią Kongo, aby uwidocznić osady celulozy w sekcjach łodygi Arabidopsis thaliana.

Barwienie czerwienią Kongo: technika wizualizacji osadów celulozy w sekcjach łodyg roślin

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego do lokalizacji białek arabinogalaktanu (AGP) i pektyn w tkankach roślinnych. Utrwalone i zatopione w żywicy skrawki tkanki roślinnej są barwione przeciwciałami pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi specyficznymi dla AGP i pektyny oraz barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym celulozę, aby ujawnić ich specyficzną tkankowo kolokalizację w ścianie komórkowej.

Immunolokalizacja białek i pektyn arabinogalaktanu w tkance roślinnej

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób materiał roślinny do immunolokalizacji białek i pektyn Arabinogalaktanu jest utrwalony, osadzony w hydrofilowej żywicy akrylowej, podzielony na sekcje i zamontowany na szkiełkach podstawowych. Pokazujemy, że epitopy związane ze ścianą komórkową zostaną wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał.

Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Poznaj techniki barwienia histochemicznego drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana. Metoda obejmuje zatopienie łodyg, skrawanie i różnicowe barwienie tkanek.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów