Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie obrazowania immunofluorescencyjnego intra vital ucha myszy z czerniakiem w celu zbadania dynamiki składników macierzy tkanki nowotworowej. Osiąga się to poprzez pierwsze zaszczepienie ucha myszy komórkami czerniaka GFP wykazującymi ekspresję B 16 F 10. Następnie wykonuje się operację ucha myszy w celu oddzielenia skóry ucha brzusznego od grzbietowego i odsłonięcia tkanki nowotworowej.

Następnie wykonuje się barwienie immunologiczne na odsłoniętej tkance ucha grzbietowego. Na koniec zwierzę jest przygotowywane do obrazowania intrażyciowego. Ostatecznie fluorescencyjna mikroskopia stereo lub mikroskopia wielofotonowa służy do pokazania lokalizacji i dynamicznego zachowania komórek nowotworowych i ich składników macierzy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami obrazowania na żywo jest to, że możemy obrazować dynamiczne interakcje komórek nowotworowych z komórkami związanymi ze zrębem, takimi jak komórki odpornościowe, ale w kontekście fibrylaru i siatki jak macierz zewnątrzkomórkowa. Tak więc ta metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii nowotworów, takich jak to, w jaki sposób komórki nowotworowe oddziałują ze swoim fizycznym mikrośrodowiskiem, co z kolei może dostarczyć ważnych informacji na temat postępu nowotworów. Część procedury zostanie zademonstrowana przez Vita Kki, starszego naukowca z naszego laboratorium Aby przygotować komórki nowotworowe do wstrzyknięcia, zacznij od hodowli komórek czerniaka B 16 F 10 GFP.

Po odwirowaniu komórek przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki einor i ponownie odwiruj, usuń cały supernatant z wyjątkiem cienkiej warstwy pożywki, która pozostaje tuż nad osadem, ponownie zawieś komórki w gęstą zawiesinę komórkową obok, aby załadować zawiesinę komórkową do objętości 10 mikrolitrów. Strzykawka Hamiltona. Zdejmij nasadkę końcówki z dołączonej igły o rozmiarze 33 i załaduj 20 mikrolitrów gnojowicy na wierzch komory końcówki.

Następnie pociągnąć tłok do tyłu, aż do momentu, gdy do strzykawki zostanie załadowanych pięć mikrolitrów gnojowicy. Po znieczuleniu myszy C 57 black six za pomocą znieczulenia iniekcyjnego, należy ogolić głowę myszy, usunąć włosy na głowie i wokół ucha, a następnie spłukać wodą. Za pomocą taśmy klejącej przymocuj bliższą krawędź ucha do czubka palca wskazującego.

Włóż igłę strzykawki Hamilton między grzbietową skórę właściwą a chrząstkę ucha myszy C 57 black six, penetrując ucho od bliższego do dalszego przez około dwa do trzech milimetrów. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową i powoli wycofać igłę ze skóry. Pozwól komórkom nowotworowym uformować lity guz w ciągu siedmiu do dziewięciu dni, używając mikroskopu fluorescencyjnego, aby śledzić wzrost guza.

Po użyciu mieszaniny nawilżonego tlenu i izofluoru do znieczulenia myszy, umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie uszczypnij palce u stóp. Aby potwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone. Nałóż maść okulistyczną na oczy i trzymaj mysz na poduszce grzewczej sterowanej termistorem doodbytniczym przez cały zabieg.

Następnie delikatnie umieść ucho nośne guza na stosie szklanych szkiełek. Następnie za pomocą małych pasków taśmy klejącej przymocuj przednią i tylną krawędź ucha do stosu za pomocą skalpela, przetnij brzuszną skórę ucha wzdłuż antyhelisy małżowiny usznej myszy. Usuń taśmy z ucha za pomocą zakrzywionej pęsety.

Delikatnie oderwij brzuszną skórę właściwą i chrząstkę z grzbietowej skóry właściwej. Użyj bufora dzwonka do przepłukania ucha w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Nałóż pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko cząsteczkom macierzy zewnątrzkomórkowej w buforze blokującym do odsłoniętego ucha i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.

Inkubować przez 15 minut przed użyciem około pięciu mililitrów buforu dzwonka do dwukrotnego przemycia ucha. Zastosować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe lub paciorkowca Aden w buforze blokującym. Nałóż szkiełko nakrywkowe i inkubuj przez 15 minut przed dwukrotnym myciem Tak jak poprzednio, złóż otwarty obszar skóry do EM mencia conki i użyj sterylnych chusteczek, aby wysuszyć zewnętrzną, nieotwartą skórę właściwą ucha.

Umieść ucho na stosie szkiełek podstawowych i nałóż 0,5 mikrolitra kleju chirurgicznego na przednią i tylną krawędź grzbietową, aby unieruchomić je na krótkotrwałe obrazowanie trwające dwie godziny lub krócej. Na unieruchomione ucho dodać świeżo przygotowany, sterylny bufor sorbatowy i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Następnie użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z dwiema soczewkami, aby zobrazować ucho.

Do długotrwałego obrazowania. Umieść wylot igły przymocowanej do zbiornika zawierającego dzwonek sorbinianowy pod szkiełkiem nakrywkowym w odległości około 0.5 centymetra od ucha. Użyj pompy perystaltycznej z prędkością jednego mikrolitra na minutę, aby stale dostarczać bufor do komory.

Otwórz oprogramowanie do akwizycji. Dostosuj intensywność fluorescencji wzmocnienia, powiększenie i czas naświetlania obrazu, kilka pól zawierających komórki nowotworowe, a także barwione białka macierzy zewnątrzkomórkowej, aby przeprowadzić obrazowanie intra vital za pomocą mikroskopii wielofotonowej ze smarem silikonowym. Zaczynając od podstawy ucha.

Zbuduj okrągłą ścianę o średnicy około dwóch centymetrów i wysokości od dwóch do trzech milimetrów wokół ucha. Wypełnij okrąg dzwonkiem sorbatowym. Umieść mysz na stoliku na poduszce grzewczej, ustawionej na 37 stopni Celsjusza i skonfiguruj ustawienia mikroskopu zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano na tym rysunku, wiele struktur można rozróżnić na podstawie ich morfologii po barwieniu immunologicznym. W przypadku składników błony podstawnej, takich jak kolagen czwarty lub prolean, co najważniejsze, białka strukturalne, których normalnie nie można wykryć przez SHG. Klasyczna metoda wykrywania matrycowego może być wizualizowana.

Na przykład stwierdziliśmy, że dziesiątki i C odkładają się w różnych miejscach zrębu guza z włókien kolagenowych, które rozwijają się w mikrośrodowisku guza, mogą prowadzić do rozszerzania się lub kurczenia macierzy guza, aw konsekwencji do przebudowy naczyń guza, podobnie jak gojenie się ran. Tutaj pokazujemy, że możemy wykonać mikroskopię poklatkową z dwoma fotonami, jednocześnie obrazując znakowane immunologicznie teny i matrycę C z minimalnym wybielaniem zdjęć czwórek fluorowych, nawet przy dużej gęstości fotonów do mikroskopii fotonowej. W tym filmie komórki nowotworowe, które zostały nałożone na odsłoniętą skórę właściwą, wstępnie wybarwione na kolagen, cztery przylegały do tkanki i w grupach zaczęły migrować zbiorczo wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych i miejsc tłuszczowych.

Po opanowaniu cała procedura otwierania ucha i barwienia immunologicznego trwa dwie godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać barwienie immunologiczne w celu zbadania interakcji macierzy komórkowej w nowotworach za pomocą fluorescencji epi lub mikroskopii dwufotonowej.