Name: Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Odkryj metodę długoterminowego przyżyciowego obrazowania immunofluorescencyjnego składników macierzy pozakomórkowej w tkance nowotworowej myszy z melanomem. Technika ta wykorzystuje mikroskopię dwufotonową do wizualizacji dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Jeremy'emu C. M. Teo i S. Ryanowi Oliverowi za ich wkład oraz Jolancie Kilarskiej za pomoc w przetwarzaniu obrazów. Dziękujemy głównej placówce BIOP w EPFL za wsparcie w zakresie mikroskopii dwufotonowej
Ta praca była częściowo wspierana przez granty Europejskiej Komisji ds. Badań Naukowych (DC-Lymph, 206653-2), Europejskiego Projektu Ramowego 7 (AngioScaff), Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (31-135756) oraz Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH)/Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH (NHLBI) (RO1 HL096539). Dodatkowo fundusze z Nagrody Roberta Wennera (Szwajcarska Liga Walki z Rakiem) pozwoliły na zakup stereomikroskopu Leica użytego w tym badaniu. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach były ściśle zgodne ze szwajcarską ustawą o ochronie zwierząt, rozporządzeniem o ochronie zwierząt i rozporządzeniem o eksperymentach na zwierzętach. Potwierdzamy, że nasz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC), o nazwie Commission de Surveillance de l'État de Vaud (numer zezwolenia: 2687), specjalnie zatwierdził to badanie.
1. Inokulacja guza ucha
<ol>
	<li>Hodowla komórek czerniaka B16-F10-GFP na 10 cm szalce Petriego przy użyciu pożywki DMEM + 10% FBS.</li>
	<li>Gdy komórki są w 80-90% zlewne, umyj je PBS i odłącz przez trypsynizację. Wirować kuwety w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu Ringera i przenieść go do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Odwiruj ponownie i usuń cały supernatant z wyjątkiem cienkiej warstwy podłoża, która pozostaje tuż nad osadem. Ponownie zawieś komórki, aby uzyskać gęstą zawiesinę komórek.</li>
	<li>Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy/dorbene [medetomidyny] (75 mg/kg-1mg/kg) i potwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, wykonując delikatne szczypanie palca. Stężenie izofluranu należy zwiększać stopniowo o 0,1% w przypadku zaobserwowania ruchów (np. wycofania łapy). Trzymaj mysz na poduszce grzewczej sterowanej termistorem doodbytniczym (37 °C) przez cały zabieg i chroń jej oczy odpowiednią maścią okulistyczną.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę Hamilton (igła 33 g, objętość strzykawki 10 ml). Zdejmij nasadkę końcówki z igłą i załaduj 20 μl zawiesiny komórkowej na wierzch komory końcówki. Odciągnąć tłok, aż 5 ml gnojowicy znajdzie się w strzykawce. Usuń nadmiar gnojowicy z komory końcówki i zamknij nasadkę końcówki.</li>
	<li>Za pomocą taśmy klejącej przymocuj bliższą krawędź ucha do czubka palca wskazującego. Pod kątem 45° powoli wprowadzić igłę strzykawki Hamilton między grzbietową skórę właściwą a chrząstkę. Po wejściu do środka wniknij do ucha od bliższego do dystalnego na około 2-3 mm. 
	Uwaga: Procedura wstrzykiwania komórek powinna być wykonywana przez przeszkolonego i certyfikowanego technika. Ponadto proces ten należy wykonywać powoli i w kolejności: najpierw igłę należy przyłożyć poziomo do skóry ucha i powoli wprowadzać do skóry właściwej ucha. Raz i tylko wtedy, gdy końcówka igły znajdzie się w skórze, należy nacisnąć tłok. Naciśnięcie tłoka zainicjuje inokulację komórek w skórze. W mało prawdopodobnym przypadku, gdy igła przechodzi przez dwie warstwy skóry właściwej ucha, warstwę chrząstki i dostanie się w skórę osoby przeprowadzającej eksperyment, ból zadawany palcowi eksperymentatora powinien być traktowany jako niepokojący sygnał i powodować natychmiastowe wycofanie igły ze skóry doświadczającego. W takim przypadku nie należy naciskać tłoka, a skórę należy sterylizować alkoholem. Alternatywnie do stabilizacji ucha można użyć przedmiotu nieożywionego zamiast palca.</li>
	<li>Wstrzyknąć 3 μl zawiesiny komórkowej i powoli wycofać igłę z ucha. Pozwól komórkom nowotworowym utworzyć lity guz w ciągu 7-9 dni i śledź wzrost guza za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Alternatywnie, aby śledzić wczesne etapy interakcji komórek nowotworowych z macierzą tkankową, nałóż 50 μl 100 000 komórek nowotworowych zawieszonych w roztworze Ringera na odsłoniętą i zabarwioną skórę właściwą ucha (po kroku 3.3).</li>
</ol>
2. Chirurgia ucha
<ol>
	<li>Trzy dni przed eksperymentem ogol głowę myszy, wygładź włosy wokół głowy i ucha (10-15 sekund) i spłucz wodą.</li>
	<li>Znieczulij mysz mieszaniną nawilżonego tlenu i izofluranu (3-4% indukcji, 1-2% konserwacji) i potwierdź, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, wykonując delikatne szczypanie palca. Stężenie izofluranu należy zwiększać stopniowo o 0,1% w przypadku zaobserwowania ruchów (np. wycofania łapy). Trzymaj mysz na poduszce grzewczej sterowanej termistorem doodbytniczym (37 °C) przez cały zabieg i chroń jej oczy odpowiednią maścią okulistyczną.</li>
	<li>Zbuduj platformę wykonaną z 8 szkiełek histologicznych ze szkła klejonego. Obróć mysz na plecy i delikatnie umieść ucho z guzem na stosie szklanych szkiełek. Użyj małych pasków taśmy klejącej, aby przymocować przednią i tylną krawędź ucha do stosu.</li>
	<li>Przetnij brzuszną skórę ucha wzdłuż antyhelisy małżowiny usznej myszy za pomocą skalpela. Za pomocą zakrzywionej pęsety delikatnie oderwij brzuszną skórę właściwą i chrząstkę z grzbietowej skóry właściwej, w której zaszczepiono guz. Ściągnij brzuszną skórę i chrząstkę za pomocą zakrzywionych kleszczy, odsłaniając grzbietową skórę właściwą. UWAGA: Jeśli główne naczynia w uchu zostaną przecięte lub krążenie krwi nie powróci do normalnego przepływu w ciągu 15 minut, ucho nie może być używane do obrazowania. Zawsze utrzymuj otwartą skórę ucha mokrą, używając bufora Ringera i chroń wilgoć za pomocą szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>W przypadku uporczywego krwawienia z naczyń nowotworowych, należy zatamować krwawienie, dodając 100 μl trombiny (5 U/ml) do buforu Ringera (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM mleczanu sodu) na górze ucha na 5 minut.</li>
	<li>Umyj ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera i usuń nadmiar płynu sterylnymi chusteczkami. Natychmiast przejdź do następnego kroku (w żadnym momencie nie pozwól, aby otwarte ucho wyschło!).</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne
Użyj buforu Ringera uzupełnionego ludzką surowicą (1:10), mysim poliklonalnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko ludzkiej IgG (1:50) i 125 IU/ml (2,5 mg/ml) aprotyniną (bufor blokujący) dla wszystkich etapów barwienia. Aprotynina hamuje plazminę sprzyjającą krzepnięciu, aby ograniczyć początkowe krwawienie, które może wystąpić po operacji.
<ol>
	<li>Złóż część ucha z otwartą skórą właściwą do małżowin usznych i osusz zewnętrzną, nieotwartą skórę właściwą ucha sterylnymi chusteczkami. Unieruchomić ucho na stosie szkiełka podstawowego, nakładając 0,5 μl kleju chirurgicznego na przednią i tylną krawędź grzbietową. Następnie delikatnie spłaszcz grzbietową skórę właściwą ucha na szkle.</li>
	<li>Do odsłoniętego ucha należy zastosować przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko cząsteczkom macierzy zewnątrzkomórkowej o stężeniu 10 μg/ml w całkowitej objętości 100 μl buforu blokującego. Zakryj ucho szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec wyschnięciu roztworu barwiącego na krawędziach uszu. Inkubować przez 15 minut. Przemyć ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera.</li>
	<li>Zastosować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe lub koniugaty streptawidyny (fluorofory o wysokiej długości fali wzbudzenia, takie jak 594 nm lub 647 nm, są korzystne dla obrazowania przyżyciowego) w stężeniu 10 μg/ml w całkowitej objętości 100 μl buforu blokującego do odsłoniętego ucha. Przykryj ucho szkiełkiem nakrywkowym i inkubuj przez 15 minut. Przemyć ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera.</li>
</ol>
4. Interakcja krwiopochodnych aktywowanych splenocytów z komórkami nowotworowymi in situ
<ol>
	<li>7 dni po zaszczepieniu czerniaka GFP-B16-F10 na tylnej skórze myszy kongenicznej, należy poddać zwierzę eutanazji i pobrać śledzionę. Wyizoluj splenocyty z mechanicznym rozerwaniem śledziony przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Oznaczyć splenocyty przez 8 minut w temperaturze 37 °C czerwonym barwnikiem cytoplazmy komórek CMTPX (1 μM w PBS), przemyć 4 razy w 15 ml w temperaturze 4 °C i natychmiast wstrzyknąć 200 μl wolnej pożywki surowicy do żyły ogonowej myszy, której uszy zostały zaszczepione B16-F10-GFP 7 dni wcześniej.</li>
</ol>
5. Obrazowanie przyżyciowe za pomocą mikroskopu stereoskopowego
<ol>
	<li>W przypadku obrazowania krótkotrwałego (do 2 godzin) na unieruchomione ucho dodać świeżo przygotowany sterylny bufor askorbinianowo-Ringera zawierający 140 mM askorbinianu sodu, 10 mM HEPES, 4 mM KCl i 5 mM CaCl2, przy pH 7,5 (końcowa osmolarność buforu askorbinianu-Ringera 320 mOsM). Zakryj ucho szkiełkiem nakrywkowym i rozpocznij obrazowanie za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego z soczewką 2X.</li>
	<li>W przypadku długotrwałego obrazowania (ponad 2 godziny) należy umieścić wylot igły (podłączonej do zbiornika zawierającego bufor Ascorbine-Ringer) pod szkiełkiem nakrywkowym, w odległości około 0,5 cm od ucha. Użyć pompy perystaltycznej o prędkości 1 μl/min, aby stale dostarczać bufor askorbinianowo-Ringera do komory pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zmień obiektyw 1X (odległość robocza 6 cm) na obiektyw 2X (odległość robocza 2 cm). Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skonfiguruj ustawienia stereoskopu fluorescencyjnego. W ustawieniach aparatu wybierz 12 bitów jako głębię kolorów obrazu i dostosuj zakres wartości skali szarości kamery od 0% (minimum) do 5,1% (maksimum) i ustaw korekcję gamma na 2.
	<ol>
		<li>Ustaw wzmocnienie akwizycji na 1 (minimum), intensywność fluorescencji na 1,000 (maksimum), powiększenie ustawione na 280X-320X i dostosuj czas ekspozycji, unikając prześwietlenia lub niedoświetlenia (czas ekspozycji powinien być krótszy niż 1 sekunda). W zależności od liczby pól obrazowania (zwykle od 10 do 20) odstęp czasu dla cyklu akwizycji powinien wynosić od 1 do 2 minut. Skrócenie czasu może powodować bielenie i fototoksyczność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz kilka pól, które zawierają komórki nowotworowe, a także barwione białka ECM (takie jak na rysunku 3). Korzystając ze zmotoryzowanego stolika, uzyskuj obrazy odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (takich jak GFP i fluorofor 647 na rysunku 3) w czasie (np. co 2 minuty).</li>
	<li>Po eksperymencie poddaj mysz eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dla zwierząt. W takim przypadku, pod koniec eksperymentu, należy poddać znieczuloną mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie wykrwawienie (perfuzja wewnątrzsercowa).</li>
</ol>
6. Obrazowanie przyżyciowe za pomocą mikroskopu wielofotonowego
<ol>
	<li>Za pomocą smaru silikonowego zbuduj wokół ucha okrągłą ściankę o średnicy około 2 cm i wysokości 2-3 mm, zaczynając od podstawy ucha. Upewnij się, że nie ma żadnych nieszczelności. Wypełnij okrąg buforem askorbinianowo-Ringera.</li>
	<li>Umieść mysz na scenie i podłącz poduszkę grzewczą (37 °C).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skonfiguruj ustawienia mikroskopu wielofotonowego.</li>
	<li>Wybierz maksymalnie cztery różne pola, które zawierają komórki nowotworowe i barwione białka ECM (takie jak na rysunku 3). W tym przykładzie dostrój laser Ti-Saphire do 850 nm dla sygnału GFP, a następnie pojedynczego fotonu 647 do barwienia fluoroforem 647 i wizualizuj fibrylarne kolageny za pomocą SHG. Uzyskanie obrazów odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (takich jak GFP i fluorofor 647 na rysunku 3) oraz generowania drugiej harmonicznej w czasie, np. co 2 minuty, przy zanurzeniu w wodzie HCX APO 20X z soczewką 1,00 NA i odległością roboczą 2 mm.</li>
	<li>Po eksperymencie należy poddać znieczuloną mysz eutanazji ze zwichnięciem szyjki macicy, a następnie wykrwawieniu (perfuzja wewnątrzsercowa).</li>
</ol>

<ol><li>Martinez-Corral, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphatic+vessels+in+development%2C+wound+healing%2C+inflammation%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci. , (2012).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+neovascularization+assay+for+screening+regulators+of+angiogenesis+and+assessing+their+effects+on+pre-existing+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels.</a> Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).</li>
<li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Immunofluorescence+for+Visualizing+the+Microcirculatory+and+Immune+Microenvironments+in+the+Mouse+Ear+Dermis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo%2C+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li>
<li>Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+elasticity+of+the+fibronectin+matrix+in+living+cell+culture+visualized+by+fibronectin-green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).</li>
<li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Tal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+mobilization+from+the+skin+requires+docking+to+immobilized+CCL21+on+lymphatic+endothelium+and+intralymphatic+crawling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling.</a> J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).</li>
<li>Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoos%2C+A+%22Encyclopedia+of+Life+Sciences%22">Encyclopedia of Life Sciences</a>. , John Wiley & Sons. 1-14 (2005).</li>
<li>Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. 15, 657-664 (2009).</li>
<li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+GFP%2C+CFP+and+collagen+in+tumors+in+vivo+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy.</a> BMC Biotechnol. 5 (1), 14(2005).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+step+in+metastasis%3A+In+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).</li>
<li>Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+amoeboid+cancer+cell+motility+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo.</a> J. Microsc. 231, 441-445 (2008).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li>
<li>Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+high-speed+intravital+multiphoton+laser+scanning+microscopy+of+microvasculature%2C+lymphatics%2C+and+leukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions.</a> Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).</li>
<li>Giampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+dendritic+cell+guidance+by+haptotactic+chemokine+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.</a> Science. 339, 328-332 (2013).</li>
<li>Midwood, K. S., Orend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tenascin-C+in+tissue+injury+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+communication+and+signaling%22%5BJournal%5D)">The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis.</a> Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer. 340-341 (2006).</li>
<li>Sund, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+derived+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma derived biomarkers in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li>
<li>Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Angiogenesis%3A+Perspectives+from+Antiangiogenic+Tumor+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies.</a> Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).</li>
<li>Patterson, G. H., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+in+two-photon+excitation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Photobleaching in two-photon excitation microscopy.</a> Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).</li>
<li>Jakobsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+trans+potentiates+VEGFR-mediated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis.</a> Dev Cell. 10, 625-634 (2006).</li>
<li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+regeneration+kinetics+of+lymphatic-specific+photodynamic+therapy+in+the+mouse+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis.</a> Angiogenesis. , (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie
W tym artykule przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii przyżyciowej, które umożliwia wysoką rozdzielczość i dynamiczną wizualizację różnych składników mikrośrodowiska tkankowego, w tym białek fibrylarnych i białek macierzy przypominających siatkę. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z obecnymi technikami obrazowania przyżyciowego: (i) Obrazowanie fluorescencyjne przyżyciowe było stosowane w badaniach mikrokrążenia, np. do śledzenia wycieku substancji rozpuszczonej z krwi lub do układu limfatycznego, ale nie było łączone z barwieniem immunologicznym. (ii) Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy reporterowych pozwala na obrazowanie określonych typów komórek, ale wymaga ich dostępności (lub znacznego wysiłku w celu stworzenia nowych) i ogranicza liczbę oddziałujących typów komórek, które można badać. (iii) Macierz zewnątrzkomórkowa może być obrazowana in vivo przy użyciu generacji drugiej harmonicznej, ale ta technika może wykryć tylko kolageny włókniste, pozostawiając dużą liczbę ważnych składników zewnątrzkomórkowych, takich jak błony podstawne, fibronektyny, tenascyny, czynniki wzrostu, chemokiny i glikozaminoglikany tkankowe poza zasięgiem obecnych badań. Nasza metoda przezwycięża te ograniczenia i pozwala na włączenie standardowych technik obrazowania i dalsze łączenie ich z barwieniem immunologicznym dla innych typów komórek, struktur tkankowych, złogów czynników wzrostu wiążących siarczan heparyny (np. VEGF26) i chemokin (CCL215,18i ryc. 2D) lub białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym śledzeniu przepływów krwi i/lub limfy.
Ograniczenia
Obrazowanie epifluorescencyjne przyżyciowego IF ogranicza się do cienkich płatów skórnych, pozbawionych grubej tkanki podskórnej (tkanki tłuszczowej). Chociaż stwierdziliśmy, że skóra właściwa ucha grzbietowego jest optymalna do stosunkowo nieszkodliwego chirurgicznego odsłaniania skóry ucha, epifluorescencja z techniką IF przyżyteczną nie ogranicza się do skóry właściwej ucha i może być potencjalnie stosowana np . do odsłoniętej skóry palców u nóg lub skóry grzbietu nowonarodzonej myszy. Szybkie barwienie przeciwciał (15 minut) w immunofluorescencji IF nie jest zależne od biernej dyfuzji, ale wymaga funkcjonalnego drenażu limfatycznego i przepływu płynu śródmiąższowego, stąd nie można zaobserwować barwienia, jeśli naczynia limfatyczne są niedrożne27. W związku z tym naczynia limfatyczne barwią się silniej niż nieszczelne naczynia krwionośne (uszkodzone naczynia, tętniczki)5. Rozdzielenie płatów skórnych ucha grzbietowego i brzusznego jest łagodnym zabiegiem chirurgicznym, ale powoduje uszkodzenie niektórych naczyń włosowatych i śmierć komórek różnych komórek tkankowych. Może to stanowić problem, gdy trzeba zbadać całkowicie nienaruszoną tkankę, np . patrząc na łagodny wpływ leków na przeżycie komórek. Również stosowanie antyoksydantu, który służy ochronie skóry przed fototoksycznością i fotowybielaniem, wyklucza stosowanie techniki immunofluorescencji przyżyciowej do badania np . stresu oksydacyjnego tkanek lub biologii tlenku azotu.
Wreszcie, zaślepienie makrofagów rezydujących w tkankach kompleksami immunologicznymi może aktywować te komórki i wpływać np . na badanie odpowiedzi immunologicznej tkanek i aktywacji komórek dendrytycznych.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Aby zbadać stres oksydacyjny tkanek lub biologię tlenku azotu, askorbinian musi zostać zastąpiony innymi pożywkami kompatybilnymi z tkankami, które nie zakłócają wyników eksperymentu. Podobnie, należy unikać blokowania receptorów Fc na komórkach odpornościowych skóry, jeśli celem badania jest funkcja i aktywacja odpowiedzi immunologicznej tkanek oraz aktywacja i migracja komórek dendrytycznych. Można to osiągnąć za pomocą przeciwciała drugorzędowego z rozszczepionym fragmentem Fc (fragmenty przeciwciała F(ab)2) lub za pomocą przeciwciała biotynylowanego i fluorescencyjnej streptawidyny jako odczynników wykrywających.
Przyszłe zastosowania
Przedstawiamy nowatorską i unikalną technikę przyżyciowego IF do obrazowania niefibrylarnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej w przeszczepialnych nowotworach skóry w połączeniu z wykrywanymi przez SHG fibrylarnymi i dojrzałymi kolagenami przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Jedną z zalet stosowania mikroskopii wielofotonowej (lub konfokalnej) w porównaniu z obrazowaniem epifluorescencyjnym jest możliwość z-stackingu, a co za tym idzie przestrzennej kolokalizacji zdarzeń zachodzących w obrębie macierzy zewnątrzkomórkowej, np. wewnątrznaczynienia guza do naczynia limfatycznego lub krwionośnego, co w przypadku standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej można wywnioskować jedynie ze zmian morfologicznych inwazyjnej komórki. Ta technika ma znacznie szerszy potencjał. Na przykład użyliśmy przyżyciowego IF do zbadania mechanizmu niedrożności limfy za pomocą limfatycznej terapii fotodynamicznej27. Dodatkowe potencjalne zastosowania tej metody obejmują m.in. badanie odporności skóry podczas stanu zapalnego, mechanizmu odrzucania przeszczepu czy metod wzrostu krwi i naczyń limfatycznych w okresie nowotworzenia.
Krytyczne etapy procedury
Najważniejszym krokiem, który ma kluczowe implikacje dla utrzymania fizjologicznego środowiska tkankowego, jest chirurgiczne oddzielenie brzusznej skóry i chrząstki od grzbietowej skóry właściwej. Przecięcie lub zamknięcie głównej tętnicy lub żyły doprowadzi do nadmiernego krwawienia i miejscowego niedotlenienia tkanek, co wpłynie na odpowiedź komórkową na leczenie i ruch komórek8. Unieruchomienie ucha za pomocą kleju chirurgicznego powinno być wykonywane ostrożnie, ponieważ rozlanie kleju na odsłoniętą tkankę spowoduje trwałe uszkodzenie tkanki poprzez niedrożność naczyń krwionośnych. Temperatura myszy musi być kontrolowana i utrzymywana na poziomie 37 °C. Dodatkowo do znieczulenia izofluranem należy użyć nawilżonego tlenu, aby oczy i płuca pozostały odpowiednio nawilżone podczas eksperymentu. Ponadto askorbinian sodu musi być przygotowany na świeżo, a jego pH sprawdzone przed użyciem.
Podsumowując, ta immunofluorescencja przyżyciowa łączy lokalne, w czasie rzeczywistym pomiary funkcji fizjologicznych z obrazowaniem molekularnym złożonych zdarzeń komórkowych w skórze myszy. Co więcej, metoda ta ma ogromny potencjał, ponieważ może być łatwo zastosowana np . do badania porozwojowych mechanizmów angiogenezy krwi i limfy lub do wizualizacji wczesnych faz infekcji skóry różnymi czynnikami chorobotwórczymi. Dzięki swojej elastyczności i wysokiemu potencjałowi przepustowości, ta technika przyżyciowe może znacząco przyczynić się do rozwoju wielu dziedzin biologii.

Intravital obrazowanie procesów zapalnych, przerzutowych i przebudowy macierzy było ważnym obszarem badań i zmotywowało do stworzenia licznych transgenicznych modeli myszy reporterowych, które wyrażają białka fluorescencyjne1,2. Ze względu na nieostre sygnały fluorescencyjne, które obniżają jakość obrazu i ograniczają przenikanie światła przez tkankę, obrazowanie grubych tkanek jest możliwe tylko za pomocą konfokalnej lub wielofotonowej mikroskopii skaningowej3. Zastosowanie szybszej, tańszej i bardziej złożonej mikroskopii epifluorescencyjnej jest możliwe tylko w przypadku tkanek prawie dwuwymiarowych, takich jak błona kosmówkowo-omocznikowa kurczaka4 lub skóra właściwa ucha myszy5. Większość systemów obrazowania wykorzystuje transgeniczne myszy wykazujące ekspresję różnych białek fluorescencyjnych w sposób specyficzny dla typu komórki. Mimo że białka te oferują słabą fototoksyczność, indukują odpowiedź immunologiczną6. Ponadto trudno jest przełączać się między określonymi podtypami komórek lub oznaczać ich stan podstawowy lub aktywowany, ponieważ taka zmiana wymaga przygotowania nowego modelu genetycznego. Ponadto, ponieważ ekspresja białek fluorescencyjnych jest na ogół ograniczona do przedziału wewnątrzkomórkowego, zwykle nie jest możliwe obrazowanie struktur zewnątrzkomórkowych, takich jak białka błony podstawnej lub złogi chemokiny tkankowej7. Zamiast tego, pośrednie znakowanie przeciwciałami przeciwko antygenom zewnątrzkomórkowym zapewnia elastyczność dla praktycznie każdego typu komórki lub składnika specyficznego dla macierzy8,9. Jednak główną wadą tego podejścia do znakowania jest immunotoksyczność, w której pośredniczą kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało, które mogą wywoływać zależną od układu dopełniacza toksyczność komórkową i fagocytozę komórek i struktur zewnątrzkomórkowych10.
Macierz zewnątrzkomórkowa mikrośrodowiska guza, ale także normalnej tkanki podczas stanu zapalnego lub gojenia się ran, ulega znacznej przebudowie. Usztywnienie zrębu mikrośrodowiska guza może sprzyjać wzrostowi i inwazji guza z powodu mechanizmów sygnalizacyjnych wywołanych stresem i powodować przebudowę naczyń krwionośnych i limfatycznych11. Jednak obrazowanie na żywo białek macierzy jest ograniczone do kolagenów fibrylarnych, które można wykryć za pomocą generacji drugiej harmonicznej za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Niedawno opublikowaliśmy nowatorską metodę obrazowania przyżyciowego, która minimalizuje ryzyko foto- i immunologicznego uszkodzenia obrazowanych komórek i struktur tkankowych5. W porównaniu z uznanymi technikami obrazowania, w których pojedyncza runda ciągłej wizualizacji przyżyciowej trwa od 30 minut do 2 godzin12-17, nasza technika immunofluorescencji przyżyciowej (IF) pozwoliła na 12-godzinne (długoterminowe 8) obrazowanie. Należy zauważyć, że czas obrazowania jest ograniczony do 12 godzin ze względu na limity określone w naszym protokole dla zwierząt, ale nie ma technicznych przeciwwskazań, że nie można go przedłużyć, jeśli kontrolowane są krytyczne parametry zdrowotne zwierzęcia, takie jak ciśnienie krwi i tętno8. Ponadto, dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego stereomikroskopu fluorescencyjnego, byliśmy w stanie zebrać obrazy z wielu pól podczas jednego eksperymentu i zaobserwować rzadkie procesy immunologiczne i remodelingowe, które zachodziły w fizjologicznym kontekście skóry wspieranej przez funkcjonalne naczynia krwionośne i limfatyczne. Ze względu na to, że soczewka stereoskopowa ma stosunkowo dużą, bo 2 cm, odległość roboczą i w przeciwieństwie do optyki mikroskopu dwufotonowego nie wymaga zanurzenia w parującej wodzie, obrazowanie długoterminowe wykonano tylko pod stereoskopowym fluorescencyjnym mikroskopem. Intravital IF umożliwił znakowanie immunologiczne i wykrycie dowolnego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej normalnej skóry. Konstrukcja tej techniki opiera się na innowacyjnej koncepcji stosowania barwienia immunologicznego dla żywych komórek i elementów macierzy tkankowej na chirurgicznie odsłoniętej skórze właściwej myszy bez powodowania szkodliwych skutków immunotoksycznych5. Sam zabieg chirurgiczny jest bezpieczny dla układu naczyniowego skóry właściwej, ponieważ polega wyłącznie na oddzieleniu dwóch warstw skóry w uchu, które są niezależnie unerwione, autonomicznie zasilane krwią i odprowadzane przez oddzielne krążenia limfatyczne. Nasza eksperymentalna konfiguracja umożliwia obrazowanie szeregu ważnych zdarzeń patofizjologicznych przez co najmniej 12 godzin, w tym transportu leukocytów między naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi oraz procesów gojenia się ran. W pierwotnej publikacji porównaliśmy naszą technikę z najnowocześniejszymi standardami w różnych dziedzinach obrazowania przyżyciowego. W związku z tym zaobserwowaliśmy wynaczynienie naczyń krwionośnych i zdarzenia wewnątrznaczynienia limfatycznego przez różne typy leukocytów, w tym unikalną wizualizację komórek odpornościowych wchodzących do zbierania zamiast oczekiwanych początkowych naczyń limfatycznych15. Ponadto, uzupełniając obserwacje przeprowadzone przez inne grupy9,18, stwierdziliśmy, że in vivo CCL21 jest zdolny do tworzenia silnych, nieciągłych złogów podczas pobierania, ale tylko rzadko na początkowych naczyniach limfatycznych.
Tutaj opisujemy zmodyfikowaną technikę IF przyżyciowej, która może być połączona z mikroskopią dwufotonową w celu wykrycia sieci kolagenów fibrylarnych za pomocą generacji drugiej harmonicznej (SHG). Pokazujemy, że metoda ta może być również stosowana do obrazowania inwazji komórek rakowych w kontekście dynamicznego mikrośrodowiska guza, które obejmuje cząsteczki macierzy, takie jak tenascyna C, które są w dużej mierze niezbadane przez obecne techniki obrazowania19. Stwierdziliśmy, że fibrylarna macierz guza, wykryta za pomocą drugiej generacji harmonicznej, zajmuje inne miejsca w mikrośrodowisku guza niż nowo zdeponowana matryca złożona z tenascyny C. Ponadto opisujemy przykłady przebudowy naczyń krwionośnych spowodowanych miejscowym skurczem macierzy, długoterminowe (12 godzin) obrazowanie interakcji komórek T z komórkami nowotworowymi oraz migrację komórek nowotworowych wzdłuż kolagenu IV błony podstawnej. Takie zdarzenia mogą być obrazowane przy jednoczesnym rejestrowaniu lokalnych parametrów fizjologicznych, takich jak przepuszczalność naczyń krwionośnych i drenaż limfatyczny.

<table><tbody><tr><td>Myszy Szczep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C myszy (8-12 tygodni) Charles</td> <td>River</td><td></td> Orleans<td>, Francja</td></tr><tr><td>Myszy C57 / Bl6 (8-12 tygodni)</td> <td>Harlan</td><td></td><td>Carshalton</td></tr><tr><td>UK Cell Line&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16 F10 Czerniak wykazujący ekspresję OVA-GFP&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Utrzymanie znieczulenia&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran&nbsp;</td><td>Minrad Inc.</td><td>2222</td><td>Minrad Inc., Buffalo, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Nawilżany system dostarczania&nbsp;</td><td>Rothhacher GmBH</td><td></td><td>Berne, Szwajcaria&nbsp;</td></tr><tr><td>System kontroli temperatury DC&nbsp;</td><td>FHC Inc</td><td></td><td>Bowdoin, MA</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny z zmotoryzowanym stolikiem.</td><td>M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>Obiektyw 1X (powiększenie systemu liniowego od 7,5X do 160X)</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>Obiektyw 2X (powiększenie systemu liniowego od 15,6X do 320X)</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>Kamera DFC 350 FX sterowana przez oprogramowanie LAS AF&nbsp;</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>Mikroskopia wielofotonowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA SP5, dwufotonowy mnożnik, zmotoryzowany stolik&nbsp;</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>HCX APO 20X/1.2 immersyjny olejek&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kameleon Ultra Laser&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor Ringera (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM mleczan sodu)</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>445968</td><td>Sempach, Niemcy</td></tr><tr><td>Aprotynina&nbsp;</td><td>Elastyna</td><td>AP92</td><td>Owensville, MO</td></tr><tr><td>Trombina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td>Taufkirchen, Niemcy&nbsp;</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140-50G</td><td>Taufkirchen, Niemcy&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysia surowica podniesiona przeciwko ludzkim IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34834</td><td>Cambridge, Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Kolagen IV&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB6581</td><td>Cambridge, Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Perlacan&nbsp;</td><td>RnD</td><td>ab79465</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>Tenascin C&nbsp;</td><td>RnD</td><td>AF3358</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>Podoplanin</td><td>RnD</td><td>AF3244</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>LYVE-1&nbsp;</td><td>Reliatech</td><td>103-PA50</td><td>Wolfenb&uuml; ttel, Niemcy</td></tr><tr><td>CCL21</td><td>RnD</td><td>AF457</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>Streptawidyna Błękit Pacyficzny&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11222</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11223</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Osioł Anti Goat 594&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21113</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>Osioł Anti Rabbit 594&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr><tr><td>CMTPX CellTracker</td><td>Lifetechnologies</td><td>C34552</td><td>Carlsbad, Kalifornia</td></tr><tr><td>Histokryl (klej chirurgiczny)</td><td>Braun Aesculap</td><td>1050060</td><td>Tuttlingen, Niemcy</td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>E15-843</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS</td><td>Gibco Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>25300062</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, Nowy Jork</td></tr></tbody></table>

długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Oprócz tego, że jest fizycznym rusztowaniem do utrzymania morfologii tkanek, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest aktywnie zaangażowana w regulację funkcji komórek i tkanek podczas rozwoju i homeostazy narządów. Odbywa się to poprzez działanie za pośrednictwem biochemicznych, biomechanicznych i biofizycznych szlaków sygnałowych, takich jak uwalnianie bioaktywnych fragmentów białka ECM, regulacja napięcia tkanek i zapewnianie ścieżek migracji komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa mikrośrodowiska guza ulega znacznej przebudowie, charakteryzującej się degradacją, odkładaniem i organizacją białek macierzy fibrylarnej i niefibrylarnej. Usztywnienie zrębu mikrośrodowiska guza może sprzyjać wzrostowi i inwazji guza oraz powodować przebudowę naczyń krwionośnych i limfatycznych. Obrazowanie na żywo białek macierzy jednak do tej pory ograniczało się do kolagenów fibrylarnych, które można wykryć za pomocą generacji drugiej harmonicznej za pomocą mikroskopii wielofotonowej, pozostawiając większość składników matrycy w dużej mierze niewidoczną. Tutaj opisujemy procedury inokulacji guza w cienkiej skórze ucha grzbietowego, znakowanie immunologiczne białek macierzy zewnątrzkomórkowej i obrazowanie przyżyciowe odsłoniętej tkanki u żywych myszy przy użyciu epifluorescencji i mikroskopii dwufotonowej. Nasza metoda obrazowania przyżyciowego pozwala na bezpośrednie wykrycie zarówno fibrylarnych, jak i niefibrylarnych białek macierzy w kontekście rosnącego guza skórnego. Pokazujemy przykłady przebudowy naczyń spowodowanych miejscowym skurczem matrycy. Odkryliśmy również, że fibrylarna matryca guza wykryta za pomocą drugiej generacji harmonicznej różni się przestrzennie od nowo zdeponowanych składników matrycy, takich jak tenascyna C. Pokazaliśmy również długoterminowe (12 godzin) obrazowanie interakcji limfocytów T z komórkami nowotworowymi i migracji komórek nowotworowych wzdłuż kolagenu IV błony podstawnej. Podsumowując, metoda ta w unikalny sposób pozwala na jednoczesne wykrywanie komórek nowotworowych, ich fizycznego mikrośrodowiska i endogennej odpowiedzi immunologicznej tkanek w czasie, co może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw progresji guza i ostatecznego sukcesu lub oporności na terapię.

Do tej pory immunobarwienia w żywej tkance nie stosowano powszechnie ze względu na powstawanie kompleksów immunologicznych, co prowadziło do wysokiego tła barwienia i immunotoksyczności20. Problem ten rozwiązano poprzez wstępne blokowanie receptorów Fcγ na makrofagach tkankowych, co w efekcie „oślepia” te komórki na późniejsze intensywne immunobarwienie pośrednie. Ponieważ znakowanie odbywało się poza komórkami, fototoksyczność i blaknięcie fluoroforów można było kontrolować poprzez zanurzenie tkanki w naturalnym buforowanym antyoksydancie, izoosmotycznym kwasie askorbinowym (Rys. 1A). Od czasu naszego pierwotnego opisu tej metody5 udoskonaliliśmy technikę przeciwdziałania blaknięciu i fototoksyczności w taki sposób, że fotowyblaknięcie można obecnie nie tylko ograniczać, ale całkowicie zapobiegać mu (Rys. 1B). Osiąga się to poprzez zanurzenie ucha w dużej objętości antyoksydantu (100 μl) wewnątrz komory, w której ucho jest unieruchomione. Należy zauważyć, że 300 sekund stałego czasu obrazowania odpowiada 10 godzinom obrazowania w przypadku gromadzenia zdjęć przez 500 msec co jedną minutę (średnie ustawienia obrazowania).
<img alt="Obrazy mikroskopowe przedstawiające barwienie komórek; wykres analizy barwnika fluorescencyjnego porównujący roztwór Ringera z askorbinianem." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Fotowyblaknięcie i fototoksyczność zostały zatrzymane poprzez zastąpienie chlorków askorbinianem w buforze Ringera i zanurzenie naświetlonego ucha w 100 μl tej objętości roztworu. (A) Tkankę zabarwiono najpierw biotynilowanym przeciwciałem przeciwko kolagenowi IV, składnikowi błony podstawnej. Barwienie wykryto później za pomocą streptawidyny-647 (kolor czerwony), a następnie obrazowano w sposób ciągły przez 300 sekund w zwykłym buforze Ringera (panel górny) lub buforze Ringera z askorbinianem (panel dolny). Należy zauważyć, że 300 sekund ciągłego obrazowania odpowiada 10 godzinom obrazowania, gdy zdjęcia są zbierane przez 500 msec w każdej minucie (standardowe ustawienia obrazowania). 25% najjaśniejszych wartości intensywności pikseli zaznaczono kolorem zielonym. (B) Ilościowa ocena spadku immunofluorescencji (50% w roztworze Ringera vs 0% w roztworze Ringera z askorbinianem). Wartości znormalizowano do początkowej fluorescencji. Obrazy zebrano przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego. Pasek skali w A, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Badanie oddziaływań między przerzutowymi komórkami nowotworowymi a zstępem nowotworu jest kluczowe dla zrozumienia procesu migracji komórek nowotworowych oraz odporności przeciwnowotworowej. Wynika to z faktu, że stroma związana z nowotworem stanowi do 90% masy guza i aktywnie reguluje jego wzrost oraz szerzenie się przerzutów21. Brakuje jednak mechanistycznego wglądu w to, w jaki sposób macierz napędza migrację komórek nowotworowych w kierunku naczyń limfatycznych lub krwionośnych 22. Jest to częściowo spowodowane tym, że obrazowanie intravitalne białek macierzy ogranicza się do wizualizacji dojrzałych włókien kolagenów włóknistych przy użyciu generowania drugiej harmonicznej w mikroskopii dwufotonowej23. Dlatego zaadaptowaliśmy naszą metodę wizualizacji mikrośrodowiska tkankowego, obejmującą naczynia krwionośne i limfatyczne, perycyty, nerwy, mięśnie i adipocyty, tak aby uwzględniała bezpośrednią wizualizację składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Wiele struktur można rozróżnić na podstawie ich morfologii po immunostynowaniu składników błony podstawnej, takich jak kolagen IV lub perlekan (Rys. 2A), jednak bezpośrednie barwienie na specyficzne markery powierzchni komórek, np. Lyve1 (Rys. 2B i C) oraz podoplaninę (Rys. 2C), pozwala dodatkowo odróżnić początkowe naczynia limfatyczne kapilarne (Lyve1+) od naczyń limfatycznych zbiorczych (Lyve1-). Barwienie na związane z macierzą CCL21 w skórze ujawniło złogi tej chemokiny na błonie podstawnej naczyń limfatycznych zbiorczych, zidentyfikowanych poprzez barwienie na perlekan, proteoglikan siarczanu heparanu (Rys. 2D).
<img alt="Obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej przedstawiające ekspresję białek perlekanu i Lyve1 w komórkach tkankowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykłady barwienia żywych tkanek w normalnych uszach myszy. (A) Barwienie na perlekan, składnik błony podstawnej, ukazuje wszystkie naczynia krwionośne i limfatyczne, nerwy, włókna mięśniowe oraz adipocyty. (B) Barwienie na Lyve1 znakuje początkową sieć kapilar limfatycznych. (C) Podwójne barwienie na Lyve1 oraz podoplaninę, marker ogólnolimfatyczny, ukazuje sieci naczyń limfatycznych początkowych i zbiorczych. Grzbietową skórę właściwą ucha można obrazować przy użyciu klasycznej mikroskopii epifluorescencyjnej (bez sekcjonowania optycznego), ponieważ w skórze właściwej ucha znajduje się niewielka liczba adipocytów, które w przeciwnym razie zasłoniłyby pole obrazowania. (D) Barwienie na CCL21 (zielone) na błonie podstawnej naczyń limfatycznych barwionej na perlekan (czerwone). Obrazy wykonane za pomocą stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Paski skali w A i B: 1 mm; w C: 100 μm oraz w D: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Co najważniejsze, możliwe jest wizualizowanie białek strukturalnych, których zwykle nie można wykryć za pomocą SHG, klasycznej metody detekcji macierzy23. Na przykład ustalono, że tenascyna C (Rys. 3A), białko macierzy ekspresowane podczas tumorigenazy, gojenia ran i stanu zapalnego19, jest osadzana w innych miejscach zrębu guza niż kolageny włókniste (Rys. 3B). Ta heterogeniczność macierzy może wpływać na dystrybucję komórek nowotworowych i przerzutowanie (Rys. 3C).
<img alt="Obraz mikroskopowy tenascyny C i SHG, analiza białek i struktur, połączone wyniki fluorescencji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Grzbietowa skóra małżowiny usznej może być obrazowana na żywo przy użyciu mikroskopii wielofotonowej. Pojedyncze pole guza B16-F10. Stroma guza została znakowana przeciwciałem przeciwko tenascynie C, a barwienie wykryto za pomocą przeciwciała osiołkowego anty-koziego-594. Immunofluorescencję sieci tenascyny C (czerwony) pokazano w A, a kolageny włókniste wykryte za pomocą generowania drugiej harmonicznej (SHG) w B. Te dwie sieci są nałożone na komórki nowotworowe (cyjan) w C (obraz połączony). Nowa macierz nowotworowa znakowana tenascyną C nie pokrywa się z kolagenami włóknistymi wykrytymi za pomocą SHG (zielony). Obraz składający się z 44 czterokrotnie uśrednionych przekrojów z osi z z krokiem z 1.0 μm został pozyskany w 16-bitowym trybie głębi kolorów. Obrazy zebrane za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Pasek skali, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Po immunoznakowaniu różnych komponentów macierzy nowotworowej (np. tenascyny C i kolagenu IV) zidentyfikowano ograniczone i gwałtowne zdarzenia kierunkowej przebudowy macierzy nowotworowej (Wideo 1). Siły powstające w mikrośrodowisku nowotworu mogą prowadzić do ekspansji lub kontrakcji macierzy nowotworowej, a w konsekwencji do przebudowy i wydłużenia naczyń krwionośnych nowotworu w stopniu podobnym do tego, który wykazaliśmy wcześniej w przypadku gojących się ran11,24.
Wideo 1. Ekspansja macierzy nowotworowej znakowanej kolagenem IV (czerwony) i tenascyną C (cyjan) wydłuża naczynia krwionośne (strzałka) i biernie przemieszcza trzy komórki nowotworowe (zielony). Zlokalizowany skurcz macierzy nowotworowej bogatej w tenascynę C przemieszcza naczynie krwionośne (poziomo zorientowana struktura czerwona) o około 100 μm w ciągu 12 godzin obrazowania. Obrazy zarejestrowane przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Wykorzystanie mikroskopii wielofotonowej z znakowaniem fluoroforami jest problematyczne, ponieważ strumień fotonów stosowany w tych eksperymentach szybko powoduje blaknięcie barwników fluorescencyjnych, które nie są chronione przed utlenianiem25. Tutaj pokazujemy, że możemy przeprowadzić dwufotonową mikroskopię time-lapse, jednocześnie obrazując immunoznakowaną macierz tenascyny C przy minimalnym fotoblaknięciu fluoroforów, nawet w dwufotonowej mikroskopii o wysokiej gęstości fotonów (Video 2).
Wideo 2. Niskopoziomowe fotoblaknięcie immunofluorescencji tenascyny C (czerwony) podczas mikroskopii dwufotonowej. Obrazowano komórki nowotworowe B16-F10-GFP (cyjan) w otwartej małżownicy ucha 9 dni po inokulacji. Sygnał fluorescencyjny był chroniony poprzez aplikację buforu Ringer’a z askorbinianem na obrazowaną tkankę. Generowanie drugiej harmonicznej (zielony) nie pokrywa się z nową macierzą reprezentowaną przez tenascynę C. Wykonano obraz z 16-bitową głębią kolorów, obejmujący 11 średnio czterokrotnie uśrednionych przekrojów z z-step 1,9 μm w czasie 15 min. Obrazy zbierano co 1 minutę i 5 sekund w 6 wybranych płaszczyznach z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Obrazowano również oddziaływania komórek odpornościowych z przerzutowymi komórkami nowotworowymi. Splenocyty znakowane CMTPX od myszy z nowotworem przeniknęły przez ściany naczyń krwionośnych związanych z guzem 8 godzin po przetoczeniu dożylnym, naciekły macierz nowotworową i aktywnie oddziaływały z komórkami nowotworowymi, tworząc trwałe kontakty międzykomórkowe (Wideo 2). Struktury kolagenu IV znakowane fluoroforem-647 były odporne na fotoblaknięcie podczas 12 godzin obrazowania.
Wideo 3. Interakcja splenocytów znakowanych CMTPX z myszy z nowotworem (B16-F10) z pojedynczymi komórkami nowotworowymi (GFP- B16-F10). Splenocyty przetoczono dożylnie po barwieniu tkanek na kolagen IV. Kolagen IV – zielony (647), splenocyty – czerwone (CMTPX), B16-F10 – cyjanowy (GFP). Obrazy zarejestrowano za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego. Czas trwania wideo: 12 godzin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.</a>
Świeżo wyizolowane komórki nowotworowe nałożono na odsłoniętą skórę ucha, uprzednio zbarwioną na kolagen IV. Zaobserwowano, że po przylegnięciu do tkanki niektóre grupy komórek rozpoczęły zbiorową migrację wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych oraz adipocytów.
Wideo 4. Komórki nowotworowe migrują wzdłuż błon podstawnych. Normalna skóra ucha barwiona na kolagen IV (647, czerwony) została pokryta świeżo pasażowanymi komórkami B16-F10-GFP i obrazowano przez 5 godzin. Niektóre komórki nowotworowe, które przylgnęły do tkanki, rozpoczęły migrację zbiorową wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych i adipocytów. Obrazy zarejestrowano przy użyciu stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Czas trwania wideo: 5 godzin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Ponadto, ponieważ skóra właściwa ucha jest w zasadzie dwuwymiarowa, mogliśmy z łatwością zebrać duże ilości danych, stosując szybką stereomikroskopię fluorescencyjną zamiast wolniejszej i droższej mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej. Można jednak zastosować dowolną z wymienionych metod mikroskopii skaningowej w naszych preparatach do intravitalnej immunofluorescencji (Rys. 3, Video 1).

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie obrazowania immunofluorescencyjnego in vivo ucha myszy z czerniakiem w celu zbadania dynamiki składników macierzy tkanki nowotworowej. Osiąga się to poprzez uprzednie inokulację ucha myszy komórkami czerniaka B 16 F 10 wykazującymi ekspresję GFP. Następnie przeprowadzany jest zabieg chirurgiczny ucha myszy w celu oddzielenia brzusznej od grzbietowej skóry ucha i odsłonięcia tkanki nowotworowej.Następnie wykonuje się barwienie immunocytochemiczne odsłoniętej tkanki grzbietowej części ucha. Na koniec zwierzę jest przygotowywane do obrazowania intravitalnego. Ostatecznie wykorzystuje się stereomikroskopię fluorescencyjną lub mikroskopię wielofotonową, aby wykazać lokalizację i dynamiczne zachowanie komórek nowotworowych oraz komponentów ich macierzy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami obrazowania na żywo jest możliwość obrazowania dynamicznych oddziaływań komórek nowotworowych z komórkami związanymi ze zrębem, takimi jak komórki odpornościowe, lecz w kontekście włóknistej i siateczkowatej macierzy zewnątrzkomórkowej. W związku z tym metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, np. w jaki sposób komórki nowotworowe oddziałują ze swoim fizycznym mikrośrodowiskiem, co z kolei może dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów progresji nowotworów. Część procedury zostanie zaprezentowana przez Vitę Kki, starszego naukowca w naszym laboratorium. Aby przygotować komórki nowotworowe do iniekcji, należy rozpocząć od hodowli komórek czerniaka B 16 F 10 GFP.Po odwirowaniu komórek przenieść je do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować, usunąć cały nadsącz z wyjątkiem cienkiej warstwy medium pozostającej bezpośrednio nad osadem, a następnie resuspendować komórki, tworząc gęstą zawiesinę komórkową, aby móc nabrać 10 µl zawiesiny do strzykawki Hamiltona. Zdjąć nasadkę z dołączonej igły o rozmiarze 33 G i nanieść 20 µl zawiesiny na górę komory końcówki.Następnie odciągnij tłok, aż do strzykawki zostanie pobrane 5 µL zawiesiny. Po znieczuleniu myszy szczepu C 57 black six za pomocą znieczulenia wstrzykiwanego, ogol głowę myszy, usuń włosy z głowy i okolic ucha, a następnie wypłucz wodą. Za pomocą taśmy klejącej przymocuj proksymalną krawędź ucha do opuszki palca wskazującego.Wprowadź igłę strzykawki Hamiltona pomiędzy skórę grzbietową a chrząstkę ucha myszy C 57 black six, przebijając ucho w kierunku od strony proksymalnej do dystalnej na głębokość około dwóch do trzech milimetrów. Wstrzyknij zawiesinę komórek, a następnie powoli wycofaj igłę ze skóry. Pozostaw komórki nowotworowe do uformowania litego guza w ciągu siedmiu do dziewięciu dni, monitorując jego wzrost za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Po znieczuleniu myszy mieszaniną nawilżonego tlenu i izofluranu, umieść zwierzę na podgrzewaczu ustawionym na 37 °C i wykonaj delikatne uszczypnięcie w palec u nogi, aby potwierdzić, że zwierzę jest dostatecznie znieczulone. Nałóż maść oftalmiczną na oczy i przez cały czas trwania procedury utrzymuj mysz na podgrzewaczu sterowanym przez termistor rektalny.Następnie ostrożnie połóż ucho z guzami na stosie szkiełek przedmiotowych. Za pomocą małych pasków taśmy klejącej przymocuj przednią i tylną krawędź ucha do stosu, a następnie używając skalpela, rozetnij skórę brzuszną ucha wzdłuż przeciwścianki małżowiny usznej myszy. Usuń taśmy z ucha za pomocą zakrzywionej pęsety.Delikatnie oddziel skórę brzuszną oraz chrząstkę od skóry grzbietowej. Użyj buforu Ringera do przemycia ucha w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Na odsłonięte ucho nanieś przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko cząsteczkom macierzy zewnątrzkomórkowej w buforze blokującym, a następnie przykryj całość szkiełkiem podstawowym.Inkubować przez 15 minut, a następnie użyć około pięciu mililitrów buforu Ringera, aby dwukrotnie przemyć ucho. Nanieść odpowiednie przeciwciała wtórne lub strep Aden w buforze blokującym. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 15 minut, a następnie przemyć dwukrotnie w ten sam sposób co wcześniej. Złożyć otwarty obszar skóry do EM mencia conki i użyć sterylnych chusteczek, aby osuszyć zewnętrzną, nieotwartą skórę ucha.Umieść ucho na stosie szkiełek przedmiotowych i nałóż 0,5 µL kleju chirurgicznego na przednią i tylną krawędź grzbietową, aby unieruchomić je na krótki czas obrazowania, wynoszący dwie godziny lub mniej. Dodaj świeżo przygotowany sterylny bufor Ringera z azotanem sodu na wierzch unieruchomionego ucha i nałóż szkiełko nakrywkowe. Następnie użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z dwoma obiektywami do obrazowania ucha.Do obrazowania długoterminowego. Umieść wylot igły podłączonej do zbiornika z roztworem Ringera z sorbanem pod szkiełkiem nakrywkowym, w odległości około 0,5 centymetra od ucha. Użyj pompy perystaltycznej z prędkością 1 µl/min, aby stale dostarczać bufor do komory.Otwórz oprogramowanie do akwizycji. Dostosuj wzmocnienie intensywności fluorescencji, powiększenie oraz czas naświetlania obrazu, wybierając kilka pól zawierających komórki nowotworowe, a także zabarwione białka macierzy zewnątrzkomórkowej, aby przeprowadzić obrazowanie intravitalne z wykorzystaniem mikroskopii wielofotonowej z użyciem smaru silikonowego. Rozpocznij od podstawy ucha.Wokół ucha należy zbudować okrągłą ściankę o średnicy około dwóch centymetrów i wysokości od dwóch do trzech milimetrów. Okrąg należy wypełnić roztworem Ringera z sorbiatem. Myszy należy umieścić na stole mikroskopu na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C, a następnie skonfigurować ustawienia mikroskopu zgodnie z protokołem tekstowym.Jak pokazano na tej rycinie, na podstawie morfologii po barwieniu immunologicznym można wyróżnić wiele struktur. Dotyczy to zwłaszcza składników błony podstawnej, takich jak kolagen IV lub prolean, a przede wszystkim białek strukturalnych, których normalnie nie można wykryć za pomocą SHG. Można zwizualizować klasyczną metodę detekcji macierzy.Na przykład stwierdziliśmy, że tenascyna C jest deponowana w różnych lokalizacjach zrębu guza niż kolageny włókniste; siły rozwijające się w mikrośrodowisku nowotworowym mogą prowadzić do ekspansji lub kontrakcji macierzy guza, a w konsekwencji do przebudowy naczyń krwionośnych guza, podobnie jak w procesie gojenia ran. Tutaj pokazujemy, że możemy przeprowadzić dwufotonową mikroskopię time-lapse, jednocześnie obrazując immunoznakowaną macierz tenascyny C z minimalnym fotowyblakaniem fluoroforów, nawet przy wysokiej gęstości fotonów w mikroskopii dwufotonowej. Na tym filmie komórki nowotworowe, które nałożono na odsłoniętą skórę właściwą uprzednio zabarwioną na kolagen IV, przylgnęły do tkanki i w grupach zaczęły migrować zbiorowo wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych i obszarów tłuszczowych.Po opanowaniu całej procedury, otwarcie ucha i barwienie immunocytochemiczne zajmują dwie godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania intravitalnego barwienia immunocytochemicznego w celu badania oddziaływań między komórkami a macierzą w nowotworach z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Długoterminowe obrazowanie immunofluorescencyjne komponentów macierzy tkankowej in vivo za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i dwufotonowej

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo.  Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Odkryj metodę długoterminowego przyżyciowego obrazowania immunofluorescencyjnego składników macierzy pozakomórkowej w tkance nowotworowej myszy z melanomem. Technika ta wykorzystuje mikroskopię dwufotonową do wizualizacji dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową (Wideo) | JoVE Journal

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Przeglądaj więcej filmów