Name: Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę dotchawczego podawania LPS i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego do oceny odpowiedzi immunologicznej u myszy. Technika umożliwia precyzyjną analizę profilu cytokin i zmian histopatologicznych w płucach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują VA-MD Regional College of Veterinary Medicine za zapewnienie podstawowego i technicznego wsparcia dla tego projektu. Praca ta jest wspierana przez nagrodę NIH Career Development Award (K01DK092355).

Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania (IACUC) dla Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Dotchawicze (i.t.) Inokulacja LPS przy użyciu podawania ustno-gardłowego
<ol>
	<li>Upewnij się, że każde zwierzę jest jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą dziurkacza w uchu, kolczyka lub innej metody zatwierdzonej przez instytucję.</li>
	<li>Należy zapisać wyjściową masę ciała i temperaturę ciała dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Przygotuj zapas roboczy LPS. Każda mysz otrzyma dawkę 50 μl 1 mg/kg LPS w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zwierzęta poddane próbie leczenia otrzymają dawkę 50 μl 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią komorę do podania izofluranu przy użyciu następującej metody kroplowej. Wytyczne instytucjonalne różnią się w odniesieniu do stosowania izofluranu i innych środków znieczulających, a przed rozpoczęciem jakichkolwiek badań należy skontaktować się z Departamentem Opieki/Dobrostanu Zwierząt swojej instytucji, aby upewnić się, że wszystkie wytyczne są odpowiednio przestrzegane. Jeśli izofluran stosowany w kroplach nie jest opcją, dopuszczalne są inne środki znieczulające.
	<ol>
		<li>W odpowiedniej komorze bezpieczeństwa nanieść około 3 ml izofluranu na złożony chłonny ręcznik papierowy i umieścić na dnie zlewki o pojemności 500 ml.</li>
		<li>Umieść mały kawałek folii aluminiowej na ręczniku papierowym i przykryj zlewkę przezroczystą pokrywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj narzędzia i odczynniki, które będą używane podczas inokulacji it. Umieść gumową opaskę, która zabezpieczy głowę zwierzęcia na stanowisku do intubacji. Ta procedura będzie wymagała pary prostych kleszczy, pary kleszczy kątowych lub zakrzywionych oraz pipety p200 z końcówkami.</li>
	<li>Załadować 50 μl LPS do końcówki pipety i umieścić w łatwo dostępnym miejscu obok stanowiska do intubacji.</li>
	<li>Znieczulij mysz, umieszczając zwierzę w komorze izofluranu i przykrywając komorę przezroczystą pokrywą. Obserwuj wzorce oddychania zwierzęcia, które będą szybkie i płytkie, gdy po raz pierwszy umieścisz je w komorze. Zwierzę będzie odpowiednio znieczulone, gdy częstość oddechów zbliży się do 1 oddechu/2 sekundy, co zwykle osiąga się w ciągu 30 sekund od umieszczenia w komorze. Mysz powinna zostać znieczulona zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt przy użyciu metody kroplowej izofluranu.</li>
	<li>Wyjmij znieczuloną mysz z komory i zawieś zwierzę na stanowisku do intubacji za przednie siekacze. Upewnij się, że zwierzę jest bezpiecznie unieruchomione, a usta i język są dostępne.</li>
	<li>Delikatnie zabezpiecz język prostymi kleszkami. Chwyć język skośnymi kleszczami i delikatnie wyciągnij go z ust, aż poczujesz lekki opór. To działanie jest wystarczające, aby zablokować nagłośnię i uzyskać dostęp do tchawicy.</li>
	<li>Trzymając język w pozycji wyprostowanej, należy podać dawkę 50 μl LPS w tylną część gardła i natychmiast zakryć nozdrza zwierzęcia palcem w rękawiczce. LPS będzie widoczny w tylnej części gardła, dopóki mysz nie weźmie wdechu.</li>
	<li>Kontynuuj zakrywanie nozdrzy i trzymaj język wyprostowany przez dodatkowe 5-10 oddechów.</li>
	<li>Wyjmij mysz ze stanowiska do intubacji i umieść zwierzę z powrotem w nowej klatce, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Monitoruj markery zastępcze związane z postępem choroby. Masa ciała i temperatura ciała powinny być monitorowane co 4-8 godzin przez cały czas trwania badania. Podobnie oceń cechy behawioralne i objawy kliniczne związane ze zwiększoną zachorowalnością.</li>
	<li>Aby ocenić postęp choroby, należy zbierać myszy w określonych punktach czasowych po ekspozycji na LPS. Typowe punkty czasowe zbiorów po ekspozycji na LPS to 0, 6, 12, 18, 24 i 48 godzin. Aby ocenić powrót do zdrowia i przeżycie, oceniaj myszy przez 7 dni po inokulacji.</li>
</ol>
2. Kolekcja surowicy i płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)
<ol>
	<li>Poświęć mysz za pomocą metody zatwierdzonej przez instytucję.</li>
	<li>Połóż zwierzę na plecach i przymocuj je do deski do sekcji zwłok, najlepiej o wysokości 0,5 cala (1,27 cm).</li>
	<li>Zwilż całą mysz 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 G należy przeprowadzić nakłucie serca przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Powinno być możliwe pobranie 500-800 μl pełnej krwi od jednej myszy.</li>
	<li>Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść pełną krew do wstępnie oznaczonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. W celu pobrania surowicy pozwól krwi pełnej na koagulację przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Oprócz pobierania surowicy, procedura ta może być również zmodyfikowana poprzez włączenie antykoagulantu do probówki i strzykawki, przed pobraniem pełnej krwi, w celu zbadania krążących komórek odpornościowych.</li>
	<li>Wykonaj poziome nacięcie na całej długości jamy otrzewnej i pionowe nacięcie od jamy otrzewnej do dolnej szczęki myszy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć obie strony nacięcia i delikatnie odciągnij skórę od leżących poniżej jam otrzewnej i klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj duże nacięcie wzdłuż jamy otrzewnej od narządów płciowych do mostka, uważając, aby nie przeciąć przepony. Delikatnie przesuń jelita w jamie otrzewnej, aby umożliwić dostęp do jednej z nerek.</li>
	<li>Przeciąć żyłę nerkową prowadzącą do nerki, aby służyła jako punkt drenażu do perfuzji.</li>
	<li>Naciąć przeponę nożyczkami, uważając, aby ominąć płuca i serce, aby odsłonić lewą stronę serca.</li>
	<li>Ręcznie wykonać perfuzję serca za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 27 G i 1x roztworem PBS. Unikaj stosowania nadmiernej siły podczas perfuzji, aby upewnić się, że sól fizjologiczna nie zostanie wtłoczona do płuc. Pozostała krew powinna spłynąć z nacięcia żyły wrotnej.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć klatkę piersiową wzdłuż mostka za pomocą/nożyczek, uważając, aby nie przeciąć serca i płuc. Przypadkowe przecięcie płuc podczas tego zabiegu znacznie zmniejszy ilość pobranego BALF i spowoduje niemożność prawidłowego napompowania płuc utrwalaczem.</li>
	<li>Delikatnie odizoluj serce i płuca od klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Ostrożnie przeciąć każdą sekcję klatki piersiowej/nożyczkami jak najbliżej kręgosłupa i całkowicie usunąć obie sekcje.</li>
	<li>Oddziel gruczoły ślinowe za pomocą kleszczy lub usuń je nożyczkami, aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć mięśnie pokrywające tchawicę za pomocą nożyczek. Istotne jest, aby podczas tego procesu nie przecinać tchawicy.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek oddziel obojczyk od tchawicy.</li>
	<li>Delikatnie chwyć grasicę za pomocą kleszczy i odsuń tkankę od serca. Usuń grasicę za pomocą nożyczek, uważając, aby nie przeciąć serca lub płuc.</li>
	<li>Wykonaj małe poziome nacięcie w tchawicy 1-2 pierścienie poniżej krtani za pomocą nożyczek kątowych (kąt 45-90º, ostry/ostry). Nacięcie powinno być na tyle duże, aby mocno zabezpieczyć kaniulę.</li>
	<li>Włóż kaniulę tak, aby zwężający się koniec wystawał 2-3 pierścienie tchawicy poniżej nacięcia i zabezpiecz kaniulę na miejscu za pomocą jedwabnego szwu. Upewnij się, że szew przechodzi między tchawicą a przełykiem i jest mocno naciągnięty na kaniulę.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) i delikatnie włóż jego luer do kaniuli.</li>
	<li>Wykonując powolny, ale stały ruch, wstrzyknij ~900 μl do tchawicy, napełniając płuca, i natychmiast wycofaj HBSS. Umieść odzyskany BALF w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy, aby zebrać około 3 ml BALF do przyszłej analizy. Przechowywać BALF na lodzie lub w temperaturze 4 ºC, aż będzie gotowy do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do badania histopatologicznego
<ol>
	<li>Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml do podstawki do pompowania płuc. Zamontuj rurkę do luera, luer do kranu i kran do strzykawki. Upewnij się, że zawór odcinający jest w pozycji zamkniętej. Strzykawka o pojemności 10 ml będzie służyć jako zbiornik przepływu grawitacyjnego. Zbiornik powinien być przymocowany do stojaka do napełniania na wysokość 4,75 cala nad zwierzęciem, a górna część zbiornika powinna wystawać 10,5 cala nad zwierzęciem.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę neutralnym, buforowanym roztworem formaliny. Upewnić się, że strzykawka jest całkowicie wypełniona utrwalaczem.</li>
	<li>Umieść chłonny ręcznik pod otwartym końcem rurki i otwórz kurek, aby utrwalacz mógł wypełnić rurkę. Gdy utrwalacz zacznie wypływać z rurki, natychmiast zamknij kran i ponownie napełnij strzykawkę do góry utrwalaczem. Ważne jest, aby strzykawka była całkowicie napełniona, aby zapewnić odpowiedni nacisk do napompowania płuc.</li>
	<li>Delikatnie przełóż drugi kawałek nici szwu pod tchawicą, około 1-2 pierścienie tchawicy poniżej końca kaniuli.</li>
	<li>Zawiąż pojedynczy luźny węzeł w szwie, jednak nie naciągaj go mocno.</li>
	<li>Włóż rurkę ze stojaka do pompowania myszy do kaniuli.</li>
	<li>Otwórz kran i pozwól, aby płuca wypełniły się przez pompowanie grawitacyjne.</li>
	<li>Gdy płuca osiągną maksymalny poziom napompowania, mocno zaciągnij szew i zawiąż drugi węzeł.</li>
	<li>Zamknij zawór odcinający i wyjmij rurkę z kaniuli.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij kaniulę z tchawicy, chwytając szew kleszczami i przytrzymując kaniulę palcami. Mocno pociągnij szew w dół w kierunku klatki piersiowej, a kaniulę z powrotem w kierunku nosa myszy.</li>
	<li>Delikatnie chwyć tchawicę lub szwy kleszczami i odnieś tchawicę od jamy szyi.</li>
	<li>Odetnij tchawicę ogonową do zawiązanego szwu za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Gdy tchawica zostanie uwolniona od leżących pod nią tkanek, zacznij odciągać tchawicę od myszy. Delikatnie wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć tkankę łączną trzymającą płuca w jamie klatki piersiowej. Kontynuuj odciąganie tchawicy od ciała myszy i stosuj stałą siłę w górę, przecinając leżące poniżej połączenia. Uważaj, aby nie przeciąć płuc. Należy pamiętać, że w ten sposób serce powinno pozostać przyczepione do płuc</li>.
	<li>Po usunięciu płuc umieść je w 10 ml buforowanej formaliny.</li>
	<li>Usuń fragment ogona myszy w celu genotypowania.</li>
	<li>Zwłoki myszy należy usunąć zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
</ol>
4. Ocena cytokin
<ol>
	<li>Odwirować krew pełną, pobraną zgodnie z krokiem 2.5, w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w celu wyizolowania surowicy. Przenieść surowicę do wstępnie oznaczonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Oceń poziom cytokin w surowicy za pomocą testu ELISA lub innego podobnego testu. Rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:5 - 1:20 w odpowiednim buforze do rozcieńczania, w zależności od testu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczenia te należy oznaczyć empirycznie przed badaniem większości próbek.</li>
	<li>Ze względu na małą objętość pobranej surowicy należy zmniejszyć objętość próbki załadowanej na płytkę ELISA o połowę. Na przykład większość komercyjnych testów ELISA wykorzystuje 100 μl objętości wzorców i próbek. Aby zakonserwować próbki, załaduj 50 μl wzorców i rozcieńczoną surowicę do dołka.</li>
	<li>Odwirować BALF w chłodzonej wirówce stołowej o sile 200 x g przez 5 minut. Przenieść bezkomórkowy supernatant do dwóch wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Oceń cytokiny BALF za pomocą testu ELISA lub innego podobnego testu bez rozcieńczania.</li>
	<li>Niewykorzystane serum i BALF należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Barwienie różnicowe i ocena komórkowości BAL
<ol>
	<li>Po odwirowaniu BALF i całkowitym usunięciu HBSS należy poddać lizie granulowane krwinki czerwone za pomocą hipotonicznego roztworu soli fizjologicznej. Ponownie zawiesić komórki w 900 μl wody destylowanej. Natychmiast dodaj 100 μl 10x PBS.</li>
	<li>Każdą próbkę należy poddać indywidualnej lizie. Jeśli próbki zawierają nadmierną ilość czerwonych krwinek, komórki można granulować w wirówce stołowej o stężeniu 400 x g przez 5 minut, a protokół lizy czerwonych krwinek można powtórzyć.</li>
	<li>Oznaczyć całkowitą komórkowość BALF w 1 ml zawiesiny za pomocą hemacytometru w powiększeniu 10X lub 20X z barwieniem błękitem trypanowym. Oceń i przedstaw te dane jako komórki/ml.</li>
	<li>Przygotuj materiały do cytospinu i barwienia różnicowego. Etykietuj standardowe szkiełka mikroskopowe za pomocą ołówka lub pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Zabezpiecz szkiełka w wsporniku cytospinowym i lejku. Zamocuj zespół suwaka w wirniku cytospinowym.</li>
	<li>Cytospin 150 μl BALF w stężeniu 100 x g przez 5 min. Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża, aby skutecznie ocenić morfologię komórki, zmniejsz objętość odwirowaną na szkiełkach. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc.</li>
	<li>Różnicowe barwienie suwaków zgodnie z protokołami producenta. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Nałóż szkiełka nakrywkowe za pomocą Permount i oceń szkiełka za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw 20X i 40X.</li>
	<li>Zbierz pozostałe komórki do późniejszej analizy, takiej jak FACS, mikroskopia elektronowa, mikroskopia konfokalna, ekstrakcja RNA w celu oceny ekspresji genów i/lub ekstrakcja białka w przypadku western blot.</li>
</ol>
6. Ocena histopatologiczna
<ol>
	<li>Przygotuj płuca do oceny histopatologicznej. Po 24-48 godzinach utrwalenia formaliny, zorientować brzusznie całe napompowane płuca i zatopione w parafinie. Przetnij powstałe bloki, aby odsłonić główne przewodzące drogi oddechowe.</li>
	<li>Aby poprawić dokładność oceniania, ustaw płuca w tej samej pozycji i przytnij każdy blok, aby uzyskać maksymalną podłużną wizualizację głównej osiowej drogi oddechowej wewnątrzpłucnej. Od tego miejsca wytnij odcinki szeregowe o grubości 5 mikronów i zabarwij hematoksyliną i eozyną (H&E). Dodatkowe sekcje można wyciąć i przygotować do hybrydyzacji in situ przy użyciu standardowych protokołów.</li>
	<li>Oceń histopatologię za pomocą półilościowego systemu punktacji opartego na następujących parametrach zapalnych, które są oceniane w zakresie od 0 (brak) do 3 (ciężkie): naciek komórek jednojądrzastych i wielojądrzastych; przerost i uszkodzenie komórek nabłonka dróg oddechowych; wynaczynienie; mankiety okołonaczyniowe i okołooskrzelowe oraz procent płuc zaangażowanych w stan zapalny. Histopatologia płuc powinna być oceniana przez doświadczonego patologa.</li>
	<li>Uśrednij wszystkie wyniki parametrów, aby wygenerować całkowity wynik histopatologii lub użyj indywidualnych wyników do ilościowego określenia określonych aspektów postępu choroby. Przeprowadzaj całą punktację w sposób podwójnie ślepy, z recenzentami ślepymi zarówno na genotyp, jak i leczenie. Ten system punktacji został wcześniej opisany6,7,10.</li>
</ol>

<ol><li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li>
<li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+NPSR1%2FGPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li>
<li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li>
<li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28NALP3%2C+Cryopyrin%29+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation%2C+necrosis%2C+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li>
<li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li>
<li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Najbardziej krytyczne kroki do pomyślnej oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza w płucach myszy są następujące: 1) wybierz odpowiedni szczep myszy i płeć dla ocenianego modelu; 2) zoptymalizować dostarczanie PAMP do płuc; 3) prawidłowo zbierać i przetwarzać BALF; oraz 4) prawidłowe unieruchomienie i przygotowanie płuc do oceny histopatologicznej.
Wybór szczepu myszy jest ważnym czynnikiem w ocenie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Myszy C57Bl/6 są zwykle uważane za optymalne tło dla ...

Infekcje płuc związane z gatunkami bakterii chorobotwórczych są częstą przyczyną globalnej zachorowalności i śmiertelności. Określenie mechanizmów, które kierują odpowiedzią immunologiczną gospodarza na te patogeny, przyczyni się do opracowania nowych strategii zapobiegawczych i środków terapeutycznych, które złagodzą wpływ tych infekcji. Ogólnym celem opisanego tutaj protokołu jest zapewnienie użytkownikowi elastycznej metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie patogenem przy użyciu wzorca molekularnego związanego z patogenem (PAMP) jako substytutu żywych bakterii. Większość wcześniejszych badań oceniających wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na bakterie koncentrowała się na modelach otrzewnowej ze względu na względną łatwość wykonania. Chociaż modele te są bardzo przydatne i zaowocowały znacznymi postępami w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen i ogólnoustrojowego stanu zapalnego, dane wygenerowane z tych modeli nie zawsze są odpowiednie dla badań obejmujących układ oddechowy. W tym przypadku zaproponowano płucny model ostrego zapalenia płuc jako praktyczne i klinicznie istotne rozszerzenie klasycznych modeli iniekcji dootrzewnowej (i.p.). Proponowana technika pozwala na lokalną ocenę wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w układzie modelowym specyficznym dla danego narządu.
Opisane tutaj metody mają na celu zapewnienie prostej i solidnej techniki, która pozwoli użytkownikom ocenić odpowiedź immunologiczną gospodarza na LPS, który jest powszechnym PAMP. Metody opierają się na dotchawniczym (i.t.) wkraplaniu LPS, który indukuje silną wrodzoną odpowiedź immunologiczną w płucach myszy i naśladuje wiele cech patofizjologicznych obserwowanych u pacjentów cierpiących na infekcje dróg oddechowych i ostre uszkodzenie płuc1. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona użytkownikowi ocenić odpowiedź immunologiczną gospodarza bez czynników zakłócających i obaw o bezpieczeństwo związanych z prowadzeniem badań in vivo z użyciem żywych bakterii. Podobnie, opisana w tym protokole droga narażenia na i.t. w jamie ustnej i gardle ma znaczące zalety w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami, w tym podawaniem donosowym (i.n.) i chirurgicznym podawaniem i.t. Na przykład podawanie dożylnie w jamie ustnej i gardle pozwala na stosunkowo dokładne dawkowanie i odkładanie się w płucach w porównaniu z podawaniem dożylnie, które zwykle cierpi na zwiększoną zmienność odkładania się w płucach z powodu utraty środków w jamie nosowej i zatokach2-4. Droga podania i.t. omija te jamy i umożliwia bezpośredni dostęp do tchawicy i dróg oddechowych. Podobnie, chirurgiczne podejście informatyczne jest znacznie bardziej chorobliwą metodą podawania i wymaga intensywnego szkolenia. Opisane tutaj protokoły zawierają również opis powszechnych technik i markerów zastępczych stosowanych do oceny postępu stanu zapalnego i kończą się protokołem opisującym prawidłowe techniki przygotowania płuc do oceny histopatologicznej. Protokoły te koncentrują się na zminimalizowaniu liczby myszy wymaganych do każdego badania poprzez maksymalizację danych generowanych od każdego zwierzęcia.
Opisane protokoły są bardzo elastyczne i mogą być łatwo modyfikowane w celu oceny różnorodnych zakresów PAMP i związanych z uszkodzeniami wzorców molekularnych (DAMPs). Ponadto, z kilkoma dodatkowymi modyfikacjami, protokoły te mogą być również stosowane w badaniach oceniających postęp alergicznej choroby dróg oddechowych lub interakcje gospodarz-patogen z żywymi bakteriami, wirusami lub grzybami5-10.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Kompaktowa</td> waga do <td>000664</td><td></td></tr> Jackson <tr><td></td><td>Laboratory Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>Termometr doodbytniczy dla małych zwierząt</td><td>Sonda</td> doodbytnicza Braintree <td>Scientific TH 5</td><td></td></tr><tr><td>dla gryzoni</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do uszu</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd z E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>podawanie dotchachelu i stanowisko do napełniania płuc</td><td>ICAP Manufacturing</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stanowisko do intubacji gryzoni</td><td>Braintree Scientific</td><td>Nożyczki RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>(/ostre)</td><td>Kleszcze Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>(proste)</td><td>Kleszcze Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>(45&ordm;, zakrzywione)</td><td>Nożyczki Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>(/)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (200 &mikro; l Pojemność)</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5 cala Igła</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Kaniule tchawicy 1,2 mm z adapterem Luer</td><td>Aparat Harvard</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt</td><td>Solution Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Pleciony jedwabny szew chirurgiczny</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy łączników Luer do rurki</td><td>Aparat Harvard</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kranów Luer</td><td>Aparat Harvard</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon formula E-3603 Rurki laboratoryjne</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-1&beta; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-6 OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>Mysz TNF-&alpha; Zestaw OptEIA ELISA BD</td><td>Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do hemocytometru</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific SV3008401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do lejków cytologicznych</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Lejki cytologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Karty filtracyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific A78300003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diff Zestaw do szybkiego barwienia</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>47733150 Średni montaż Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie dotchawczego podawania pamp w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na patogeny jest złożonym procesem biologicznym. Większość badań in vivo klasycznie stosowanych do charakteryzowania interakcji gospodarz-patogen wykorzystuje dootrzewnowe wstrzyknięcia wybranych bakterii lub wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP) u myszy. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnych ilości danych związanych z patobiologią chorób zakaźnych, modele iniekcji dootrzewnowej nie zawsze są odpowiednie do badań interakcji gospodarz-patogen w płucach. Wykorzystując model ostrego zapalenia płuc u myszy, możliwe jest przeprowadzenie analizy w wysokiej rozdzielczości wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza przy użyciu lipopolisacharydu (LPS). W tym miejscu opisujemy metody podawania LPS za pomocą niechirurgicznego podawania dotchawiczego jamy ustnej i gardła, monitorujemy parametry kliniczne związane z patogenezą choroby oraz wykorzystujemy płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego do oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Opisane techniki mają szerokie zastosowanie w badaniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na różnorodny zakres PAMP i patogenów. Podobnie, z niewielkimi modyfikacjami, techniki te mogą być również stosowane w badaniach oceniających alergiczne zapalenie dróg oddechowych oraz w zastosowaniach farmakologicznych.

Ściany komórkowe bakterii gram-ujemnych składają się z LPS, który występuje w środowisku w dużych ilościach. Inhalacja LPS u wrażliwych grup ludzi nasila reaktywność dróg oddechowych i jest zdolna wywołać silną odpowiedź immunologiczną11. LPS jest również powszechnie stosowanym PAMP w modelach mysich w celu wywołania silnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W opisanym tutaj protokole myszy otrzymały dawkę i.t. LPS wyizolowanego z E. coli (serotyp 0111:B4) za pomocą orofaringalnej administracji i.t. W modelac...

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie zastosowania orofaringalnego podania endotoksyny LPS drogą wewnątrzczewną oraz płukania pęcherzykowo-oskrzelowego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw inokulację myszy LPS-em za pomocą podania orofaringalnego. W drugim kroku wprowadzana jest kaniula tchawicza, a następnie przez kaniulę pobierany jest płyn z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego w celu oceny miejscowej odpowiedzi zapalnej.W ostatnim kroku płuca są wypełniane formaliną w celu oceny histopatologicznej. Ostatecznie można przeanalizować profil cytokin w jelitach oraz histopatologię płuc, aby ocenić odpowiedź immunologiczną gospodarza na LPS. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak podawanie donosowe i chirurgiczne podawanie dotchawicze, jest fakt, że jest ona stosunkowo prosta w wykonaniu i pozwala na dokładne dawkowanie oraz osadzanie substancji w płucach.W pierwszej kolejności podaj LPS w sposób intratrachealny. Zabezpiecz zanurkowaną mysz w znieczuleniu. Stań przy jej przednich siekaczach, upewniając się, że zwierzę jest stabilnie unieruchomione, a pysk i język są dostęp

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie doustnej i dotchawiczej podaży PAMP oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych do oceny odpowiedzi odpornościowej organizmu u myszy

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Poznaj metodę dotchawczego podawania LPS i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego do oceny odpowiedzi immunologicznej u myszy. Technika umożliwia precyzyjną analizę profilu cytokin i zmian histopatologicznych w płucach.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Przeglądaj więcej filmów