Name: Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Naucz się jednoczesnego pomiaru pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej z sondami HPTS i SNF F1. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wewnątrzkomórkowego pH.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Gilles'owi Dupuis za krytyczną lekturę manuskryptu. 
Finansowanie
Ta praca była wspierana przez Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D jest członkiem Centre de Recherche en Santé (FRSQ) finansowanego przez Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

1. Przygotowanie roztworów do kalibracji pH komórkowego
<ol>
	<li>Dodać następujące związki do pięciu oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml, aby przygotować 5 roztworów, które zostaną użyte do kalibracji:
	<ul>
		<li>NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g w 10 ml H20)</li>
		<li>KCl (6,75 ml z 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g w 10 ml H20)</li>
		<li>Glukoza (1 ml 1 M D-glukozy) ( 1 M D-glukoza = 1,80 g w 10 ml H20)</li>
		<li>MgS04 (0,05 ml 1 MMgSO4) (1 MMgSO4 = 1,20 g w 10 ml H20)</li>
		<li>20 mM HEPES: (1 ml 1 M, HEPES) (1 M HEPES: = 2,38 g w 10 ml H20)</li>
		<li>CaCl2 (0,05 ml 1M CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g w 10 ml H20) 
		Przygotować wszystkie roztwory w podwójnie destylowanymH2O(ddH2O).</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Uzupełnić każdy roztwór 35 ml ddH2O i mieszać mieszadłem magnetycznym aż do uzyskania roztworu.</li>
	<li>Dostosuj pH każdego roztworu za pomocą 1 N KOH lub 1 N HCl, aby uzyskać wartości pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 i 7,5. Następnie dostosuj objętość wodą dejonizowaną do końcowej objętości 50 ml.</li>
	<li>Odmierz 5 mg nigerycyny i dodaj ją do 670 μl absolutnego EtOH, aby przygotować 10 mM roztworu podstawowego nigerycyny. 
	Uwaga: nigerycyna jest wysoce toksyczna i należy obchodzić się z nią bardzo ostrożnie (rękawice, okulary ochronne i maska). Mieszać roztwór przez odwrócenie, aż nigerycyna całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Dodać 0,05 ml 10 mM nigerycyny (końcowe stężenie 10 μM) do każdego roztworu kalibracyjnego. Nigerycyna jest jonoforem, który zwiększa przepuszczalność błony komórkowej i powoduje równowagę wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego pH w obecności depolaryzującego stężenia zewnątrzkomórkowego K+.</li>
	<li>Roztwory kalibracyjne mogą być przechowywane do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, komórki nasienne w szalkach hodowlanych o wymiarach 35 mm x 10 mm w 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. Użyj ilości komórek potrzebnej do zapewnienia około 50% zbieżności po 24 godz. 
	UWAGA: W naszych eksperymentach używamy linii komórkowej HT-1080 i płytki 1 x 105 komórek na naczynie hodowlane.</li>
	<li>Określ liczbę szalek hodowlanych potrzebnych do eksperymentu i ułóż na talerzu 5 dodatkowych szalek hodowlanych, które zostaną użyte do kalibracji.</li>
	<li>Umieścić szalki hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na co najmniej 24 godziny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sond wykrywających pH
<ol>
	<li>Przygotować 1M roztwór podstawowy fluorescencyjnej sondy pH kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego, soli trisodowej (HPTS/piranina) w ddH20. Roztwór ten musi być przechowywany w temperaturze pokojowej i chroniony przed światłem.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mM octanu estru 5-(i-6)-karboksylowo-seminaftorodafluorowego acetoksymetylu (C-SNARF-1 AM; zwanego dalej SNARF-1), rozpuszczając 1 mg SNARF-1 w 1,76 ml DMSO. Dokładnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Roztwór SNARF-1 należy przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.</li>
</ol>
4. Etykietowanie komórek
<ol>
	<li>Szesnaście godzin przed obrazowaniem żywych komórek dodać 2 μl roztworu podstawowego 1M HPTS (stężenie końcowe 1 mM) do każdej szalki hodowlanej zawierającej 2 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Włóż naczynia hodowlane do inkubatora. Sonda HPTS jest nieprzepuszczalna dla komórek, dlatego do znakowania organelli sonda musi być wchłonięta przez pinocytozę. Ten warunek wymaga, aby inkubacje komórek z HPTS były przeprowadzane w pożywce hodowlanej uzupełnionej surowicą.</li>
	<li>Po inkubacji z HPTS przemyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS i dodawać 2 ml pożywki bez surowicy przez co najmniej 2 godziny. Inkubację z SNARF-1 należy przeprowadzić w pożywce bez surowicy, ponieważ surowica może uniemożliwić wychwyt sondy.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 mM roztworu podstawowego SNARF-1 w celu uzyskania końcowego stężenia 5 μM i pozostawić komórki do inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C, w słabym świetle. Stężenie C-SNARF-1 i czas inkubacji mogą się różnić w zależności od typu komórki.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwukrotnie w sterylnym PBS i dodać 2 ml pożywki bez surowicy.</li>
</ol>
5. Dodanie modulatorów pH
<ol>
	<li>Aby ocenić, czy metoda może wykryć zmiany pH w komórkach, można zastosować różne odczynniki, które modulują pH wewnątrzkomórkowe:
	<ul>
		<li>Bafilomycyna A1, swoisty inhibitor V-ATPazy5</li>
		<li>Wymiennik Na+/H+ izoforma 1 (NHE-1)6</li>
		<li>NH4Cl, słaba zasada, która zwiększa wewnątrzkomórkowe pH7</li>
	</ul>
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe wyżej wymienionych odczynników:
		<ul>
			<li>Bafilomycyna A1: dodać 10 μg bafilomycyny A1 do 160 μl DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy 100 μM</li>
			<li>EIPA: dodać 25 mg EIPA do 1,67 ml metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mM</li>
			<li>NH4Cl: rozpuścić 0,53 g chlorku amonu w 10 ml ddH2O, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.</li>
		</ul>
		 
		Uwaga: Wszystkie roztwory podstawowe muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C, z wyjątkiem bafilomycyny A1, która musi być przechowywana w temperaturze -20 °C i chroniona przed światłem.</li>
		<li>W oddzielnych naczyniach hodowlanych dodaj jeden z odczynników, jak opisano poniżej:
		<ul>
			<li>2 μl 100 μM bafilomycyny A1 (stężenie końcowe 100 nM)</li>
			<li>1 μl 50 mM EIPA (stężenie końcowe 25 μM)</li>
			<li>40 μl 1M NH4Cl (stężenie końcowe 20 mM)</li>
		</ul>
		</li>
		<li>Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do akwizycji obrazu.</li>
</ol>
6. Specyfikacja mikroskopu do obrazowania żywych komórek i ustawień akwizycji
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie żywych komórek za pomocą obiektywu 40X zamontowanego na spektralnym odwróconym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik XY, komorę, w której mieszczą się naczynia hodowlane ze szklanym dnem w inkubatorze o kontrolowanym poziomie środowiskowym (temperatura, wilgotność, CO2 ) inkubatorze.</li>
	<li>Zastosowany tu instrument konfokalny (Olympus FV1000) wyposażony jest w:
	<ul>
		<li>Laser diodowy 405 nm</li>
		<li>Laser argonowy o mocy 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)</li>
		<li>Laser helowo-neonowy (543 nm)</li>
		<li>Obiektyw fluorytowy 10X, NA0.4</li>
		<li>Obiektyw LUCPLFLN 40X, NA0.60</li>
		<li>Obiektyw olejowy PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4</li>
		<li>Lustro dichroiczne DM 405/458/488/543</li>
		<li>Filtry dichroiczne SDM 560 i SDM 640</li>
		<li>Filtr barierowy BA655-755</li>
		<li>Rozdzielacz wiązki BS20/80</li>
		<li>Oprogramowanie do analizy danych do akwizycji i analizy obrazu,</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Po ogrzaniu inkubatora do temperatury 37 °C i ustawieniu mikroskopu, umieścić naczynie hodowlane uprzednio inkubowane z HPTS i SNARF-1 w komorze obrazowania stopnia konfokalnego.</li>
	<li>Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania dostosuj ustawienia pobierania oprogramowania Rysunek 1.
	<ul>
		<li>Skonfiguruj dwa zestawy kanałów wirtualnych.</li>
		<li>Rozpocząć pierwszą fazę, która odpowiada wzbudzeniu HPTS przy 405 nm i odbiorowi emisji przy 505 - 525 nm oraz wzbudzeniu SNARF-1 przy 543 nm i odbiorowi emisji przy 570 - 600 nm.</li>
		<li>Rozpocząć drugą fazę, która odpowiada wzbudzeniu HPTS przy 458 nm i odbiorowi emisji przy 505 - 525 nm oraz wzbudzeniu SNARF-1 przy 543 nm i odbiorowi emisji przy 640 - 650 nm.</li>
		<li>Przysłona konfokalna jest domyślnie ustawiona na 175 μm, a optymalna przysłona musi być ustawiona ręcznie na 300 μm.</li>
		<li>Zrób zdjęcie, układając szeregowe poziome sekcje optyczne (800 x 800 pikseli) o grubości 0,4 μm.</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
UWAGA: Obiektyw 40X jest przydatny do obserwacji kilku komórek jednocześnie i dobrze sprawdza się przy oglądaniu organelli. Jednak rozdzielczość przestrzenną i intensywność sygnału można lepiej osiągnąć przy użyciu obiektywu olejowego 60X. Ponadto nie ma przesłuchów wzbudzenia ani emisji między tymi dwoma barwnikami.
7. Kalibracja sond wykrywających pH
<ol>
	<li>Przed kalibracją należy usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego uprzednio inkubowanego z HPTS i SNARF-1, przemyć dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie dodać 2 ml jednego z pięciu roztworów kalibracyjnych.</li>
	<li>Umieść naczynie hodowlane w komorze stopnia konfokalnego.</li>
	<li>Przejdź do akwizycji obrazu poklatkowego zgodnie z następującymi ustawieniami:
	<ol>
		<li>Ustaw liczbę obrazów i czasy trwania interwałów dla eksperymentu. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy 1-minutowego interwału między obrazami do 30 minut.</li>
		<li>Zaprogramuj migawkę tak, aby zamykała się między rejestracją każdego obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz intensywność fluorescencji na minutę w arkuszu kalkulacyjnym i określ czas, w którym intensywność fluorescencji jest stała. Wewnątrzkomórkowe pH jest zwykle stabilne po 15 - 20 minutach.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 7.1 do 7.4, używając nowej płytki hodowlanej dla każdego pozostałego roztworu kalibracyjnego.</li>
</ol>
8. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Po wykonaniu kalibracji pobierz dane próbki z 4-5 losowo wybranych pól zawierających 15-20 komórek na pole. Dla każdego pola uzyskuje się dwa obrazy: jeden dla znakowania HPTS (pęcherzyki), a drugi dla znakowania SNARF-1 (cytozol).</li>
	<li>Fluorescencja tła (obszar zewnątrzkomórkowy) jest cyfrowo odejmowana od obrazów fluorescencyjnych obu sond. Oznaczone pęcherzyki i cytozol z odpowiednich zapisanych obrazów są wybierane za pomocą maski binarnej. Dla każdej sondy wykrywającej pH intensywność fluorescencji jest mierzona w skali numerycznej (skala szarości 0-4,095). Obliczana jest średnia intensywność dla wszystkich pikseli w organelli lub cytoplazmie, a wartości są wykorzystywane do obliczania współczynników fluorescencji.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Na rynku dostępne są różne pakiety oprogramowania do analizy danych. tj. oprogramowanie Fluoview.</li>
	<li>W arkuszu kalkulacyjnym zapisz wartości i oblicz współczynniki fluorescencji w następujący sposób: w przypadku HPTS R = (F458 nm/F405 nm), a w przypadku SNARF-1 R = (F644 nm/F584 nm).</li>
	<li>Wykreślaj dane za pomocą naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów, takiego jak GraphPad Prism. Wykres powinien przedstawiać współczynniki fluorescencji (oś Y) w funkcji pH (oś X). Dopasowanie krzywej uzyskuje się za pomocą regresji nieliniowej.</li>
	<li>Zebrać intensywności fluorescencji próbek zgodnie z opisem w kroku 8.2 i obliczyć współczynniki fluorescencji. Użyj krzywych kalibracyjnych, aby przekształcić proporcje w wartości pH.</li>
</ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ilościowy pomiar pH w obrazowaniu żywych komórek różnych przedziałów komórkowych jest potrzebny do dokładnego pomiaru zmian pH w odpowiedziach komórek na wyzwania zewnętrzne. Jednak jedną z głównych przeszkód, które pozostają, jest łatwe i specyficzne celowanie w przedziały komórkowe. W związku z tym kilka badań podkreśliło zastosowanie HPTS jako wewnątrzkomórkowego wskaźnika pH wprowadzanego do komórek za pomocą elektroporacji lub mikroiniekcji8-10. Techniki te mają poważne wady, a mianowicie elektroporacja p...

<table><tbody><tr><td>Roztwory do kalibracji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza (dekstroza)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Działa toksycznie przez drogi oddechowe lub w kontakcie ze skórą</td></tr><tr><td colspan="4">Chronić przed światłem w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane &puste; 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr> sondy <tr><td>wykrywające</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Kwas 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowy (HPTS)</td><td>Technologie życia</td><td>H-348</td><td>Przechowywać z dala od światła w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>5-(i-6)-karboksynowy SNARF&reg;-1, ester acetoksymetylowy, octan</td><td>Technologie życia</td><td>C-1271</td><td>Przechowywać z dala od światła i wilgoci w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Dimetylosutlenek (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>szkodliwy</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY N/D</td><td>Doprowadzić do 1 l</td></tr><tr><td>Autoklawu i doprowadzić pH do 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Woda deoinizowana</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>Doprowadzić do 5 l</td></tr><tr><td>modulatory</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Bafilomycyna A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-etylo-N-izopropylo)amiloryd (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesny pomiar ph w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Wewnątrzkomórkowe pH jest ściśle regulowane i odnotowano różnice w pH między cytoplazmą a organellami1. Regulacja pH komórkowego ma kluczowe znaczenie dla homeostatycznej kontroli procesów fizjologicznych, które obejmują: syntezę białek, DNA i RNA, transport pęcherzykowy, wzrost komórek i podział komórek. Zmiany w komórkowej homeostazie pH mogą prowadzić do szkodliwych zmian funkcjonalnych i sprzyjać postępowi różnych chorób2. Dostępne są różne metody pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH w cytoplazmie i organellach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodę jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i organellarnego za pomocą mikroskopii konfokalnej na żywych komórkach3. Cel ten osiąga się dzięki zastosowaniu dwóch barwników ratiometrycznych wykrywających pH, które posiadają selektywny podział przedziałów komórkowych. Na przykład SNARF-1 jest podzielony na przedziały wewnątrz cytoplazmy, podczas gdy HPTS jest podzielony na przedziały wewnątrz organelli endosomalnych / lizosomalnych. Chociaż HPTS jest powszechnie stosowany jako cytoplazmatyczny wskaźnik pH, barwnik ten może specyficznie oznaczać pęcherzyki wzdłuż szlaku endosomalno-lizosomalnego po wchłonięciu przez pinocytozę3,4. Za pomocą tych sond wykrywających pH można jednocześnie mierzyć pH w przedziałach endocytarnych i cytoplazmatycznych. Optymalna długość fali wzbudzenia HPTS różni się w zależności od pH, podczas gdy w przypadku SNARF-1 zmienia się optymalna długość fali emisji. Po załadowaniu SNARF-1 i HPTS komórki są hodowane w różnych roztworach skalibrowanych pod kątem pH w celu skonstruowania krzywej wzorca pH dla każdej sondy. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na eliminację artefaktów i szumów tła. Ze względu na właściwości spektralne HPTS, sonda ta lepiej nadaje się do pomiaru łagodnie kwaśnego przedziału endosomalnego lub do wykazania alkalizacji organelli endosomalnych / lizosomalnych. Metoda ta upraszcza analizę danych, poprawia dokładność pomiarów pH i może być wykorzystana do odpowiedzi na podstawowe pytania związane z modulacją pH podczas reakcji komórek na wyzwania zewnętrzne.

Do jednoczesnego pomiaru pH w przedziałach wewnątrzkomórkowych oraz endosomalnych/lizosomalnych wykorzystano ratiometryczne fluorescencyjne sondy pH SNARF-1 oraz HPTS. Sonda SNARF-1 ogranicza się do przedziału cytozolowego, natomiast HPTS umożliwia ratiometryczny pomiar pH w przedziale endosomalnym/lizosomalnym. Inkubacja komórek z HPTS przez 16 h pozwala na jego selektywną lokalizację w endosomach/lizosomach4. Typowy przykład fluorescencji zarejestrowanej z komórek HT-1080 obciążonych sondami pH przedstawiono...

Dostępnych jest kilka metod pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH cytoplazmatycznego i organellarnego. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodologię jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i pęcherzykowego za pomocą obrazowania ratiometrycznego żywych komórek.

Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest jednoczesny pomiar pH w pęcherzykach i cytozolu w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Osiąga się to poprzez wstępną inkubację komórek z sondami do pomiaru pH, HPTS i SNF F1, które znakują odpowiednio przedziały endosomalne i lizosomalne oraz cytozol. Następnie komórki umieszcza się w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi pod mikroskopem konfokalnym, a oprogramowanie konfiguruje się tak, aby mierzyć fluorescencję sond w komorze.Komórki inkubuje się z roztworami o różnych, skalibrowanych wartościach pH. Krzywą wzorcową pH wyznacza się za pomocą regresji nieliniowej. Dla obu sond określa się równania wykładnicze, które są następnie wykorzystywane do przeliczenia intensywności fluorescencji próbek na wartości pH.Metoda ta pozwala na oznaczenie pH pęcherzykowego i cytosolowego w próbkach po różnych zabiegach i może umożliwić badanie regulacji pH wewnątrzkomórkowego podczas procesów biologicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami pomiaru pH wewnątrzkomórkowego jest fakt, że nasza metoda umożliwia pomiar dynamiki pH wewnątrzkomórkowego w żywych komórkach przy jednoczesnym wyeliminowaniu artefaktów i szumów tła podczas obrazowania. Procedurę zademonstruje fess lucier, doktorant, który opracował tę metodę. Do kalibracji pH komórkowego konieczne jest przygotowanie serii pięciu 50 mililitrowych roztworów o pH od 5.5 do 7.5 w odstępach co 0.5.Dodawać kroplami wodorotlenek potasu lub kwas solny w celu ustawienia wartości pH. Następnie do każdego roztworu o skalibrowanym pH dodać 0,05 ml rycyny IOR. Przy stężeniu 10 mM, dla końcowego stężenia 10 µM, rycyna zwiększy przepuszczalność błony komórkowej w obecności depolaryzujących stężeń potasu zewnątrzkomórkowego; w komorze z laminarem wysiać komórki w 35 mm szalkach hodowlanych w 2 ml pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyki, dążąc do uzyskania 50% konfluencji po 24 h inkubacji w 37 °C.Po zasianiu wszystkich wymaganych płytek do eksperymentu, zasiej dodatkowe pięć płytek do kalibracji. Inkubuj te płytki przez 24 godziny, następnie kolejne 24 godziny oraz przez 16 godzin przed obrazowaniem. Następnego ranka, około trzech godzin przed badaniem, dodaj dwa mikrolitry znacznika organelli HPTS o stężeniu 1 M, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM HPTS w roztworze.Przed obrazowaniem należy usunąć HPTS, wykonując dwa płukania buforem PBS. Następnie należy dodać dwa mililitry medium bezsurowiczego i inkubować komórki przez co najmniej dwie kolejne godziny.Tuż przed obrazowaniem inkubuj komórki z 5 µM snf, dodając 10 µL 1 mM snf, zgodnie z okresem inkubacji SNF. Przemyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj 2 mL medium beztłuszczowego (bezsurowiczego), a następnie przystąp do obrazowania komórek.Obrazowanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu spektralnego odwróconego skanującego mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w zmotoryzowany stół oraz komorę inkubacyjną. W przypadku użycia plastikowych szalek Petrien najodpowiedniejszy jest obiektyw 40x. Oprogramowanie należy skonfigurować dla dwóch zestawów kanałów wirtualnych, dostosowując długość fali wzbudzenia oraz długości fal emisji.W przypadku HPTS oraz SNF otwór konfokalny jest domyślnie ustawiony na 175 µm, a optymalna wartość otworu musi zostać ręcznie ustawiona na 300 µm. Po rozgrzaniu komory do 37 °C należy rozpocząć kalibrację, dwukrotnie przemyć płytkę z komórkami za pomocą PBS, a następnie wymienić medium na pierwszy roztwór kalibracyjny. Następnie należy umieścić komórki w komorze i skalibrować oba barwniki wrażliwe na pH, wykonując do 30 obrazów time-lapse w odstępach jednominutowych.Każdy stos obrazów można zbierać z grubością 0,4 mikrona i rozdzielczością 800 pikseli kwadratowych. Pomiędzy obrazami migawka musi być zaprogramowana tak, aby pozostawała zamknięta. Należy monitorować intensywność fluorescencji w każdej minucie; zazwyczaj stabilizuje się ona po około 20 minutach.Po ustabilizowaniu fluorescencji należy wykonać zdjęcia czterech lub pięciu pól zawierających od 15 do 20 komórek oraz obie sondy. Obrazy te służą do obliczeń krzywej. Proces ten należy powtórzyć dla każdego roztworu kalibracyjnego.Następnie należy przystąpić do obrazowania płytek z warunkami eksperymentalnymi, które nie wymagają przemywania. Podczas analizy każdego obrazu w pierwszej kolejności należy cyfrowo odjąć tło fluorescencji pozakomórkowej. Następnie, korzystając z maski binarnej, należy wyznaczyć znakowane pęcherzyki oraz cytosol z zapisanych obrazów. W przypadku każdej sondy do pomiaru pH intensywność fluorescencji jest mierzona w skali od 0 do 4 095.Oblicz średnią intensywność dla wszystkich pikseli w organelli lub cytoplazmie. Wykorzystując te wartości, oblicz stosunki fluorescencji dla HPTS oraz dla snf. Dla krzywych kalibracyjnych nanieś na wykres stosunki fluorescencji uzyskane dla każdego roztworu kalibracyjnego w funkcji pH; dopasowanie krzywej kalibracyjnej należy przeprowadzić przy użyciu równania wykładniczego.Na koniec należy wykorzystać krzywe kalibracyjne do przekształcenia stosunków w wartości pH, aby w ten sposób uzyskać wartości pH cytozolu i organelli w żywych komórkach w warunkach eksperymentalnych. Uzyskano jednoznaczne dowody na to, że HPTS znakuje zarówno przedziały endosomalne, jak i lizosomalne, poprzez barwienie współistniejące z transferryną sprzężoną z Alexa 5 46 w celu znakowania endosomów lub z fluorescencyjną sondą lizotropową LysoTracker.Obrazy time-lapse w głębokiej czerwieni zbierano dla każdej sondy zgodnie z opisem w HT 10 80 komórek. Przetestowano pięć roztworów kalibracyjnych w celu oceny stabilności fluorescencji po 15 minutach w roztworach, takich jak roztwory o pH 6 i pH 7,5. Na krzywej kalibracyjnej dla danego pH dane reprezentują stosunek intensywności fluorescencji przy 558 do 405 nanometrów dla HPTS lub 644 do 584 nanometrów dla SNF 1. Obie krzywe dopasowano do równania wykładniczego.Wydajność metody w żywych komórkach HT 10 80 oceniono przy użyciu chlorku amonu, słabej zasady zwiększającej wewnątrzkomórkowe pH. Zasada ta podniosła pH zarówno w cytosolu, jak i w pęcherzykach. Metodę oceniono również przy użyciu B myciny, A one, inhibitora va a TPAs bamy, A one, która wywołała alkalizację zarówno w przedziałach endosomalnych, jak i lizosomalnych, ale nie zmieniła pH cytosolu.Na koniec przetestowano EIPA, inhibitor NHE1. Powodował on zakwaszenie cytozolu do pH 6,62, lecz do tej pory nie wpływał na pH.Badania nad homeostazą pH wewnątrzkomórkowego były ograniczone zarówno przez szybkie zmiany pH zachodzące w komórkach, jak i brak narzędzi do badania pH wewnątrz komórek. Opisujemy dzisiaj prostą, krok po kroku realizowaną metodę jednoczesnego pomiaru pH cytozolu i endosomów w pojedynczych żywych komórkach. Jest to szczególnie istotne dla badania homeostazy pH w komórkach, w których mutacje lub leki mogą wpływać na napływ i odpływ protonów w obrębie przedziałów endosomalnych.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednoczesne pomiary pH w endocytarnych i cytozolowych przedziałach w żywych komórkach z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej

Wideo pokazuje jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zmian potencjału błonowego w komórkach śródbłonka mysich odcinków tętnic mózgowych. Izolowany śródbłonek jest ładowany fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia i traktowany lekiem, który indukuje wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia, powodując zmianę potencjału błony. Fluorescencja wskaźnika umożliwia pomiar poziomu wapnia, a elektroda rejestrująca jest wprowadzana do ogniwa w celu pomiaru zmian potencjału błony.

Jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w śródbłonku mózgu myszy

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Naucz się jednoczesnego pomiaru pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej z sondami HPTS i SNF F1. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wewnątrzkomórkowego pH.

Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów