Name: NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj metodę BEST do automatycznej izolacji tetrad drożdży z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Technika ta umożliwia szybkie generowanie tysięcy rekombinowanych potomstw z zachowaniem informacji o pochodzeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH/NHGRI Genome Scholar/ Faculty Transition Award (K22 HG002908) dla A.M.D. oraz strategiczne partnerstwo między Instytutem Biologii Systemów a Uniwersytetem Luksemburskim. Prośby o szczepy lub plazmidy należy kierować do Aimée Dudley (aimee.dudley@gmail.com).

1. Konstrukcja i charakterystyka szczepów
<ol>
	<li>Stwórz heterozygotyczny szczep diploidalny do wykorzystania w krzyżówce poprzez kojarzenie szczepów haploidalnych i selekcję diploidów2 lub wykorzystując naturalnie występujący szczep heterozygotyczny. Szczepy nie powinny posiadać GFP.</li>
	<li>Potwierdź, że szczep nie jest w stanie rosnąć na podłożu YPD2 + 200 µg/ml G418.</li>
	<li>Potwierdź, że szczep jest zdolny do sporulacji. Metoda BEST jest kompatybilna z krzyżówkami o niskiej wydajności sporulacji, jednak niska częstotliwość sporulacji wydłuża czas sortowania FACS.
	<ol>
		<li>Przygotuj kulturę nocną (O/N) szczepu w 5 ml YPD i hoduj z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Przemyj 0,5 ml kultury nocnej trzykrotnie za pomocą PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Odwirowuj przemyte komórki, usuń nadsącz i resuspenduj w 2 ml pożywki do sporulacji7.</li>
		<li>Wytząsaj komórki w RT i codziennie sprawdzaj tworzenie tetrad za pomocą mikroskopu świetlnego w kontraście fazowym z obiektywem 40X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oszacuj żywotność zarodników krzyżówki poprzez konwencjonalną dyssekcję2,3 niewielkiej liczby (~20) tetrad. Żywotność zarodników w krzyżówkach między różnymi tłem szczepowymi jest bardzo zróżnicowana i nieprzewidywalna. Jednakże oczekiwania a priori dotyczące żywotności zarodników mogą służyć do oceny wydajności eksperymentu BEST przed czasochłonnymi i kosztownymi etapami zabezpieczania i genotypowania szczepów. Dlatego ten krok jest wysoce zalecany.</li>
</ol>
2. Transformacja diploidów biblioteką plazmidów z kodami kreskowymi
<ol>
	<li>Wprowadź plasmid z kodem kreskowym pCL2_BC do heterozygotycznego szczepu diploidalnego, stosując protokół transformacji opisany przez Gietza i Woodsa8 z następującymi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Po inkubacji komórek z mieszaniną transformacyjną w temperaturze 30 °C przez 20 min, dodaj DMSO do stężenia 8% objętości mieszaniny transformacyjnej. Stwierdzono, że dodatek DMSO zwiększa wydajność transformacji w niektórych liniach szczepów9.</li>
		<li>Po etapie szoku termicznego odwirowaj komórki krótką centrifugacją, odlej mieszaninę transformacyjną i delikatnie przemyj komórki w YPD. Następnie zawieś komórki ponownie w 1 ml YPD i pozostaw je do regeneracji w RT przez 3 hr bez wstrząsania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyselekcjonuj transformanty, wysiewając je na płytki agarowe YPD + G418 (200 µg/ml). Aby zapewnić zróżnicowaną pulę kodów kreskowych plazmidów, zbierz dużą liczbę kolonii, np. z 5 płytek zawierających ok. 2 500 kolonii na płytkę.</li>
	<li>Gdy kolonie staną się widoczne (po 2-3 dniach wzrostu w 30 °C), połącz transformanty, ostrożnie zeskrobując je z płytki do ciekłego YPD + G418 (200 µg/ml) + 15% glicerolu. Zawiesinę komórkową wymieszaj w wortexie, przenieś do fiolki do krioようにpreserwacji i zamroź w temperaturze -80° C. Przygotuj oddzielny mrożony stok dla każdej płytki. Mrożone stoki te posłużą jako szczepy wyjściowe do kroku 3.1 i mogą zostać wykorzystane w późniejszym terminie do generowania kolejnych tetrad, jeśli będzie to wymagane.</li>
</ol>
3. Sporulacja biblioteki transformowanych komórek w celu otrzymania zakodowanych kreszowo tetrad
<ol>
	<li>Rewiwyzować komórki z mrożonych zapasów przygotowanych w punkcie 2.3 poprzez inkubację przez noc (O/N) w 5 ml pożywki YPD + G418 (200 µg/ml) w temperaturze 30 °C przy mieszaniu.</li>
	<li>Przemyć komórki z kultur inkubowanych przez noc 3x w PBS (pH 7.4), a następnie zawiesić komórki w medium do sporulacji7 z dodatkiem 200 µg/ml G418.</li>
	<li>Mieszać kultury sporulacyjne w temperaturze pokojowej (RT) i codziennie monitorować postępy sporulacji, aż do momentu zaprzestania tworzenia się nowych tetrad.</li>
	<li>Gdy kultura będzie zawierać dobrze uformowane tetrady i stosunkowo mało dyad, należy zaprzestać mieszania i pozostawić kultury w temperaturze pokojowej przez co najmniej 7 dni. Choć niektóre krzyżówki mogą nadawać się do trawienia i rozbicia na płytce natychmiast po uformowaniu się tetrad (ocenianym zgodnie z opisem w punkcie 7.3), dodatkowa inkubacja (7-10 dni w naszych eksperymentach) jest niezbędna dla innych krzyżówek. W związku z tym ten krok jest wysoce zalecany.</li>
</ol>
4. Wyznaczanie bram FACS dla sortowania tetrad
Fuzja SPS2-GFP wyrażana podczas mejozy na plazmidzie pCL2_BC pozwala na wykrywanie i izolowanie tetrad w kulturze sporulacyjnej za pomocą fluorescencji. Poniższy protokół został opracowany dla systemu FACSAria II.
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej przedstawiający wykresy FSC-H, SSC-H, GFP-A; rozkład częstości." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Bramkowanie FACS.  Do wyizolowania tetrad wykorzystuje się serię czterech sekwencyjnych bramek. Bramki przedstawione na (A) i (B) pomagają zredukować liczbę aglomeratów. Zdarzenia fluorescencyjne są wybierane za pomocą bramki w (C). Histogram w (D) wykazuje dwa piki. Zdarzenia w lewym piku to przede wszystkim tetrady (obraz wstawiony po lewej), a zdarzenia w prawym piku to zazwyczaj tetrady z przyczepionym pączkiem (obraz wstawiony po prawej). Do tego histogramu zastosowano końcową bramkę w celu wybrania zdarzeń, które są w przeważającej mierze tetradami (czerwone słupki). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Ludlow, et al1.
<ol>
	<li>Załaduj kulturę z zarodnikami do sortera FACS i ustaw dwa bramki rozproszenia przedniego (forward scatter) oraz bocznego (side scatter), aby wykluczyć zanieczyszczenia, aglomeraty komórek oraz zdarzenia wielokomórkowe w jednej kropli (Rycina 2A i 2B).</li>
	<li>Powinna pojawić się populacja komórek fluorescencyjnych, która przy użyciu konstruktu reporterowego SPS2-GFP obejmuje dyady i tetrady10. Ustaw bramkę GFP względem FSC, aby uwzględnić te zdarzenia fluorescencyjne (Rycina 2C).</li>
	<li>W zależności od tła szczepu może być konieczne zastosowanie dodatkowej bramki w celu usunięcia aglomeratów zawierających tetrady i inne komórki. Jeśli jest to wymagane, sprawdź histogram FSC dla zdarzeń fluorescencyjnych i określ bramkę obejmującą zdarzenia o niższym FSC (Rycina 2D, zdarzenia wyselekcjonowane zaznaczono na czerwono).</li>
	<li>Zweryfikuj efektywność schematu bramkowania, sortując ok. 1 500 tetrad na szkiełko mikroskopowe i obliczając proporcję tetrad do obiektów niebędących tetradami za pomocą mikroskopu fazokontrastowego przy powiększeniu 400X. Procent tetrad można dokładnie oszacować, licząc jedynie ok. 200 posortowanych zdarzeń, jednak sortowanie ok. 1 500 skraca czas poszukiwania komórek na szkiełku. Alternatywnie, stosunek tetrad do obiektów niebędących tetradami można ocenić podczas kroku 4.5.</li>
	<li>Okresowo sprawdzaj, czy sorter prawidłowo raportuje liczbę zdarzeń, sortując 25 tetrad na szkiełko mikroskopowe i badając komórki zawarte w kropli za pomocą mikroskopu fazokontrastowego przy powiększeniu 400X. W kropli powinno znajdować się 25 tetrad. Powtórz czynność 3-4x, aby ocenić wariancję urządzenia FACS.</li>
</ol>
5. Sortowanie tetrad na płytkę agarową
<img alt="Zautomatyzowana jednostka nanoszenia komórek z szalką Petriego; układ płytki 96-dołkowej do analizy hodowli komórkowych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Umieszczenie szalki z agarem w sorterze FACS. Aby posortować tetrady do małej kropli roztworu zymolazy umieszczonej na środku standardowej (okrągłej) szalki z agarem, najpierw na stole sortera komórkowego umieszcza się standardową (prostokątną, 100 mm) płytkę 96-dołkową, a następnie programuje sorter tak, aby nanosił tetrady do konkretnego dołka (w tym przypadku D5). Następnie okrągłą szalkę z agarem kładzie się na płytce 96-dołkowej i wyrównuje tak, aby kropla zymolazy znajdowała się dokładnie nad wskazanym dołkiem.
<ol>
	<li>Podgrzewaj odpowiednią liczbę płytek YPD + G418 (200 µg/ml) przez co najmniej 1,5 hr w inkubatorze o temperaturze 37 °C umieszczonym w pobliżu sortera FACS.</li>
	<li>Kluczową cechą protokołu sortowania jest możliwość precyzyjnego skierowania tetrad sortowanych metodą FACS w konkretne miejsce na płytce agarowej zawierającej kroplę roztworu zymolyase. Aby to osiągnąć, umieść płytkę „orientacyjną” z 96 dołkami na automatycznej jednostce depozycji komórek (ACDU) sortera. Przygotuj układ sortowania, który pozwoli na posortowanie 25 tetrad do jednego dołka w formacie 96-dołkowym. Wybierz dołek w pobliżu środka płytki, np. dołek D5. Rysunek 3 przedstawia szalkę Petriego i płytkę 96-dołkową umieszczone w sorterze komórek. Sortowanie 25 tetrad na płytkę pozwala na uzyskanie dobrze oddzielonych kolonii.</li>
	<li>Przenieś stos 10 płytek agarowych z inkubatora 37 °C do sortera.</li>
	<li>Weź jedną płytkę agarową i nanieś pipetą 25 μl roztworu zymolyase (1 mg/ml w 0,7 M sorbitolu) na agar w pobliżu środka płytki. Następnie umieść płytkę na orientacyjnej płytce 96-dołkowej, wyrównując kroplę zymolyase nad docelowym dołkiem z kroku 5.2, np. dołkiem D5.</li>
	<li>Rozpocznij sortowanie i zdeponuj 25 tetrad w środku kropli zymolyase na płytce agarowej. Następnie wyjmij i przykryj płytkę.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 5.4 i 5.5, aż 25 tetrad zostanie posortowanych do kropli zymolyase na każdej płytce w stosie.</li>
	<li>Przenieś stos płytek zawierających tetrady z powrotem do inkubatora 37 °C.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 5.3 do 5.7, aż wszystkie płytki będą zawierały tetrady.</li>
</ol>
6. Separacja zarodników
<ol>
	<li>Inkubować każdy stos płytek agarowych zawierających tetrady w temperaturze 37 °C przez 1,5 hr.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora, dodać 15-25 sterylnych szklanych kulek o średnicy 3 mm na płytkę i wstrząsać płytkami w stosie (lub w dwóch stosach po 5 płytek) przez 3-5 min. Najlepszą separację zarodników uzyskuje się, przesuwając płytki sztywno z boku na bok lub od przodu do tyłu. Nie należy przesuwać płytek w sposób, który powodowałby „wirowanie” kulek wokół zewnętrznej krawędzi płytki. Po zakończeniu pozostawić kulki na płytkach.</li>
	<li>Umieścić stos płytek z kulkami stroną aktywną do góry w inkubatorze w temperaturze 30 °C. Wyjąć kolejny stos płytek z inkubatora w temperaturze 37 °C i powtórzyć krok 6.2.</li>
	<li>Inkubować płytki O/N w temperaturze 30 °C.</li>
</ol>
7. Zbieranie kolonii
<ol>
	<li>Po inkubacji przez noc (O/N) w temperaturze 30 °C na płytkach powinny powstać małe kolonie. Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora, uważając, aby nie poruszyć szklanych kulek.</li>
	<li>Usuń szklane kulki, ostrożnie i szybko odwracając płytki nad głębokim pojemnikiem. Pojemnik powinien być wystarczająco głęboki, aby przechwycić kulki i zapobiec ich odbijaniu się i uderzaniu w płytkę z agarem. Delikatne opukiwanie dna płytki podczas odwracania może pomóc w usunięciu kulek przyklejonych do powierzchni. Kulki te można ponownie wykorzystać po dokładnym umyciu z detergentem, starannym wypłukaniu wodą dejonizowaną i sterylizacji w autoklawie.</li>
	<li>Policz liczbę kolonii na każdej płytce i na podstawie tej liczby oszacuj wydajność separacji i odzyskiwania zarodników. Na przykład 25 tetrad na płytce w przypadku krzyżówek o żywotności bliskiej 100% mogłoby dać łącznie 100 kolonii na płytce.</li>
	<li>Z płytek z odpowiednią liczbą kolonii (&gt;65 dla krzyżówek o wysokiej żywotności) przenieś komórki z każdej kolonii do osobnej studzienki płytki 96-dołkowej zawierającej płynne podłoże YPD + G418. Zapisz również, które studzienki zawierają kolonie z tej samej płytki agarowej; informacje te posłużą do wsparcia oprogramowania do przydzielania tetrad.</li>
	<li>Wykorzystaj płynne kultury na płytkach 96-dołkowych do zaszczepienia kultur do genotypowania oraz do przechowywania szczepów jako zamrożone stożki glicerolowe. Szczegółowe informacje na temat sekwencjonowania RAD-tag oraz analizy sekwencji znajdują się w pracy Ludlow et al1.</li>
</ol>

<ol><li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+tetrad+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li>
<li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRose%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+A+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).</li>
<li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+two+types+of+spore+germination%2C+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Trav.+Lab.+Carlsberg+Ser.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li>
<li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspore+bridges%3A+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li>
<li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li>
<li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li>
<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele obszarów badań genetycznych, począwszy od mapowania złożonychcech11 , a skończywszy na badaniu mechanizmów leżących u podstaw rekombinacjiDNA12, wymaga niezwykle dużej liczby potomstwa i dużych ilości sekwencjonowania DNA. Techniki, które łączą moc konwencjonalnych podejść ze zdolnością do wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA, mają potencjał, aby umożliwić badania, które wcześniej były trudne do wykonania. Chociaż kilka wysokoprzepustowych metod genetyki drożdży zostało skutecznie zastosowanych do konkretnych problemów, każda z nich ma ograniczenia, które nie są w stanie osiągnąć szerokiego zastosowania konwencjonalnej analizy tetradowej. Projekt BEST jest odpowiedzią na te wyzwania, stosując wysokoprzepustowe podejście łączące preparację tetrad i genotypowanie potomstwa krzyżówek drożdży. W połączeniu z multipleksowanym sekwencjonowaniem znaczników RAD, BEST oferuje niedrogi sposób zbierania informacji o genotypie dla każdego szczepu potomstwa, przy jednoczesnym zachowaniu powiązań tetrad za pomocą unikalnych kodów kreskowych tetrad. Spośród wszystkich obecnie stosowanych metod wysokoprzepustowych, BEST najwierniej podsumowuje informacje dostarczone przez ręcznie wypreparowaną krzyżówkę drożdży.
BEST ma dwie kluczowe cechy. Pierwszym z nich jest zastosowanie FACS do szybkiej izolacji tetrad z dala od niezarodnikowanych komórek w hodowli (kroki protokołu 5-6). Zdolność do izolowania tysięcy zdarzeń fluorescencyjnych (tetrad) daje BEST największy wzrost przepustowości. Ta automatyzacja zapewnia jeszcze większą przewagę nad ręcznym preparowaniem w przypadku krzyżówek o niskiej wydajności zarodnikowania, ze względu na wydłużony czas potrzebny na wizualną identyfikację rzadkich zdarzeń. Drugą kluczową cechą jest użycie wysoce złożonego molekularnego kodu kreskowego (Protokół Krok 2), który jest przesyłany do każdego siostrzanego zarodnika tetrady. Ponieważ te kody kreskowe mogą być używane do obliczeniowej rekonstrukcji tetradowych relacji między zarodnikami, które zostały losowo rozmieszczone na płytce agarowej, potrzeba ręcznego układania komórek w uporządkowanej siatce jest złagodzona. Wreszcie, ponieważ molekularny kod kreskowy i gen reporterowy GFP specyficzny dla zarodnikowania są fizycznie połączone (na tym samym plazmidzie), tylko tetrady, które zachowały molekularny kod kreskowy, są wybierane przez sortowanie FACS.
Istnieją dwie kwestie, które regulują czas inkubacji kultur w pożywce zarodnikowej. Po pierwsze, ponieważ reporter specyficzny dla zarodnikowania (SPS2-GFP) ulega ekspresji we wczesnym okresie mejozy, sam GFP nie odróżnia kompletnych tetrad 4-zarodnikowych od komórek, które nie ukończyły mejozy (tj. diady). Podczas gdy dodatkowe bramkowanie FACS może zmniejszyć liczbę fluorescencyjnych, niekompletnych tetrad, najłatwiejszym sposobem na zmniejszenie tych niepożądanych zdarzeń jest po prostu monitorowanie kultury zarodnikowej (Krok 3.3) i kontynuowanie, gdy nowe tetrady przestaną się tworzyć. W naszych eksperymentach częstotliwość sortowania diad wynosi mniej niż 1%. Po drugie, w przypadku niektórych krzyżówek dodatkowy czas spędzony w pożywce zarodnikowej w temperaturze pokojowej bez mieszania (Krok 3.4) znacznie poprawia oddzielanie tetrad przez szklane kulki podczas posiewu ((Protokół Krok 6). W rzeczywistości ten krok jest absolutnie konieczny do przerwania niektórych krzyży.
Podobnie jak wszystkie metody o wysokiej przepustowości, BEST jest "głośniejszy" niż odpowiadające mu konwencjonalne podejście. Niewielkie zmniejszenie skuteczności BEST w porównaniu z konwencjonalną sekcją tetrad może wynikać z połączenia kilku czynników. Jednym z czynników jest zwiększona utrata skądinąd żywotnych zarodników, która może wynikać z przylegania do szklanych kulek podczas rozprzestrzeniania się lub zwiększonej śmierci zarodników z powodu naprężeń mechanicznych procesu. Drugim czynnikiem może być zwykła utrata plazmidu podczas mejozy. Trzecim czynnikiem może być efektywny spadek liczby kolonii nadających się do użytku wynikający z kolonii o mieszanych genotypach, szacowanych na ~5% kolonii w naszych pilotażowych krzyżówkach1. Jest prawdopodobne, że te kolonie reprezentują niepowodzenia w separacji siostrzanych zarodników. Ponieważ szybkie sortowanie fluorescencyjne i separacja zarodników pozwalają na zbieranie ogromnych ilości tetrad, BEST jest dobrze przygotowany do przezwyciężenia spadków wydajności na tę skalę. Podczas gdy przyszłe iteracje BEST mogą zwiększyć wydajność zbliżoną do wydajności ręcznej sekcji, być może bardziej prawdopodobne jest, że obecna wykładnicza trajektoria zdolności sekwencjonowania DNA szybko skompensuje ten poziom użytecznej utraty szczepu. Niezależnie od tego, możliwość przeprowadzenia analizy tetradowej w skali, do której można zastosować BEST, umożliwi badania, które są obecnie niewykonalne metodami ręcznymi.

Mapowanie genów w mejozie, powszechnie znane jako analiza tetrad, zajmuje centralne miejsce w genetyce drożdży. W skrócie, dwa szczepy haploidalne, z których każdy zawiera jedną kopię każdego chromosomu, są krzyżowane w celu utworzenia heterozygotycznego szczepu diploidalnego z dwiema kopiami każdego chromosomu, po jednej od każdego rodzica. Głodzenie komórek diploidalnych w odniesieniu do azotu indukuje mejozę (sporulację), podczas której chromosomy ulegają replikacji, reorganizacji i dzielą się na cztery komórki haploidalne (zarodniki lub segreganty) z nowymi kombinacjami alleli od każdego z rodziców. Cztery zarodniki powstałe z jednej mejozy można wyizolować za pomocą manualnego procesu zwanego sekcją tetrad.
Konwencjonalna dyssekcja tetrad2,3, która zmieniła się stosunkowo niewiele od czasu oryginalnej publikacji z 1937 roku4, ma trzy cele. Po pierwsze, komórki, które przeszły mejozę (tetrady), muszą zostać odizolowane od tła komórek wegetatywnych. W konwencjonalnej analizie realizuje to badacz, który za pomocą mikroskopu wizualnie identyfikuje tetrady na płytce z agarem i używa mikromanipulatora, aby przenieść tetradę na wolny od komórek obszar płytki. Następnie cztery przetrwalniki w tetradzie muszą zostać fizycznie rozdzielone, aby zapobiec kojeniu między przetrwalnikami. Przetrwalniki w obrębie tetrady są utrzymywane razem zarówno przez askus, będący pozostałością ściany komórkowej pierwotnej komórki diploidalnej, jak i zestaw mostków międzyprzetrwalnikowych5. W konwencjonalnej analizie tetrad askus jest usuwany poprzez trawienie enzymatyczne, a badacz używa mikromanipulatora do przerwania mostków międzyprzetrwalnikowych i rozdzielenia przetrwalników. Na koniec poszczególne przetrwalniki są rozmieszczone w układzie siatki, który zachowuje relacje między nimi, i.e. wszystkie potomstwo w rzędzie czterech są przetrwalnikami siostrzanymi z tej samej pierwotnej tetrady. Doświadczony badacz drożdży może ukończyć proces dyssekcji 10 tetrad (ogólnie przyjęta minimalna liczba na jeden krzyż) w około 15 min.
Opracowaliśmy nową wysokoprzepustową metodę genotypowania tetrad, którą nazwaliśmy Barcode Enabled Sequencing of Tetrads (BEST)1. Metoda BEST rozszerza obecne techniki w zakresie genetyki wysokoprzepustowej, umożliwiając generowanie i genotypowanie ogromnej liczby potomstwa, które jest izolowane, genotypowane i utrzymywane jako osobne jednostki w sposób pozwalający na odzyskanie relacji siostrzanych zarodników dla wszystkich czterech produktów mejozy. Jest to realizowane za pomocą trzech głównych strategii (Rysunek 1). Pierwszą jest wprowadzenie konstruktu reporterowego, który znakuje białkiem GFP komórki, które przeszły mejozę, umożliwiając ich izolację za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Drugą jest wprowadzenie wysoce złożonego kodu kreskowego DNA (ciągu 15 losowych nukleotydów) w formie przekazywanej wszystkim czterem zarodnikom tetrady, który może zostać odczytany poprzez sekwencjonowanie DNA potomstwa rekombinantowego, co pozwala zidentyfikować zarodniki siostrzane z tej samej tetrady. Trzecim etapem jest genotypowanie; BEST jest kompatybilna z wieloma platformami genotypowania, które rejestrują zarówno zestaw markerów genomowych, jak i specyficzny dla tetrady kod kreskowy. Stosujemy metodę sekwencjonowania tagów DNA związanych z miejscami restrykcyjnymi (RAD-seq)6, która kieruje sekwencjonowanie genomu do specyficznych miejsc restrykcyjnych1, przechwytując w ten sposób stałe 2-3% genomu szczepów potomnych oraz kod kreskowy przenoszony przez plazmid. Odzyskanie relacji tetrad wraz z empirycznie uzyskanymi danymi z genotypowania krzyżówki pozwala na dokładne wnioskowanie o brakujących informacjach, w tym o statusie markerów o niskim pokryciu sekwencjonowania oraz pełnym genotypie osobników nieżywotnych (a zatem nie do odzyskania). W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie tej metody u najczęściej używanego mikroorganizmu w mapowaniu mejotycznym, drożdży S. cerevisiae. Jednakże, przy niewielkich modyfikacjach odczynników specyficznych dla organizmu, np. zastosowaniu innych białek specyficznych dla sporulacji połączonych z GFP, metoda ta powinna być łatwo przeniesiona na inne mikroorganizmy, w tym na organizmy, w których mapowanie mejotyczne jest znacznie bardziej pracochłonne lub obecnie niewykonalne.
<img alt="Schemat transformacji plazmidów z kodami kreskowymi, sporulacji, tworzenia kolonii i wysokoprzepustowego genotypowania." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Metoda BEST. (A) Plazmid pCL2_BC jest plazmidem 2-mikronowym z fuzją GFP specyficzną dla sporulacji, opornością na G418 oraz losowym kodem kreskowym o długości 15 nukleotydów. Konstrukcja biblioteki plazmidów została opisana przez Ludlow et al1. (B) Pula plazmidów z kodami kreskowymi jest transformowana do szczepu diploidalnego pochodzącego z krzyżówki. (C) Transformanty są następnie hodowane na pożywce selekcyjnej, a około 10 000 przetransformowanych kolonii jest łączonych i poddawanych sporulacji. Podczas mejozy każda przetrwalnik tetrady dziedziczy kopię plazmidu z kodem kreskowym. (D) Tetrady są oddzielane od niesporulowanych komórek za pomocą FACS i zbierane na płytkach agarowych, gdzie są trawione i rozbijane, aby umożliwić każdemu przetrwalnikowi utworzenie kolonii. (E) Kolonie są następnie przenoszone do płytek 96-dołkowych, fenotypowane i genotypowane. Podczas genotypowania odczytywany jest kod kreskowy plazmidu, który służy do identyfikacji czterech członków każdej tetrady. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Ludlow et al1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (jednostka na specjalne zamówienie)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Inne sortery komórek powinny działać w tej procedurze. Kluczowymi czynnikami są: (1) laserowy/detekcyjny system dla używanego reportera fluorescencyjnego (w naszym przypadku laser o długości fali 488 nm do wzbudzania EGFP), (2) zdolność do sortowania pojedynczych zdarzeń, (3) możliwość sortowania na szkiełkach mikroskopowych w celu oceny jakości sortowania oraz (4) zdolność do sortowania na szalkach Petriego</td></tr><tr><td>Automated Cell Deposition Unit (dla FACSAria II)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155 (jeśli został zakupiony oddzielnie od instrumentu FACSAria)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Biobusiness</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Naukowy</td><td></td><td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td></tr></tbody></table>

najlepsze: sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Analiza tetrady jest cennym narzędziem do genetyki drożdży, ale pracochłonny ręczny charakter procesu utrudnia jej zastosowanie na dużą skalę. Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych (BEST)1 zastępuje ręczne procesy izolowania, przerywania i rozdzielania tetrad. BEST izoluje tetrady za pomocą specyficznego dla zarodnikowania białka fuzyjnego GFP, które umożliwia aktywowane fluorescencją sortowanie komórek tetrad bezpośrednio na płytkach agarowych, gdzie worek jest trawiony enzymatycznie, a zarodniki są rozbijane i losowo układane przez powlekanie kulkami szklanymi. Koloniom haploidalnym przypisuje się następnie relacje zarodników siostrzanych, tj. informacje o tym, które zarodniki pochodzą z tej samej tetrady, za pomocą molekularnych kodów kreskowych odczytywanych podczas genotypowania. Usuwając wąskie gardło ręcznej sekcji, w ciągu kilku minut można wyizolować setki, a nawet tysiące tetrad. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis procedur doświadczalnych wymaganych do uzyskania najlepszego wyniku u drożdży Saccharomyces cerevisiae, począwszy od heterozygotycznego szczepu diploidalnego, poprzez izolację kolonii pochodzących z haploidalnego potomstwa mejotycznego.

Metoda BEST może znacznie zwiększyć szybkość izolacji zarodników z tetrad. Jako przykład wydajności tej metody, jeden badacz przeprowadził sortowanie FACS i separację zarodników (kroki od 5.1 do 6.3) dla 149 płytek agarowych w ciągu 3 hr1. Odpowiedni uzysk (około 3 725 tetrad) wymagałby ponad 90 hr manualnej dyssekcji. Jednakże, podobnie jak w przypadku wielu metod wysokoprzepustowych, obecna wersja tej metody wykazuje pewną utratę wydajności w porównaniu z dyssekcją manualną. Strata ta przejawia się w zmniejszonej liczbie odzyskanych kolonii w stosunku do oczekiwań obliczonych na podstawie żywotności zarodników krzyżówki, określonej poprzez dyssekcję manualną (krok 1.4). Zakładając, że przyczyny utraty zarodników (Omówienie) wpływają na zarodniki w sposób losowy, można oszacować, ile odzyskanych kolonii będzie należało do tetrad, z których odzyskano 1, 2, 3 lub 4 zarodniki (Rysunek 4).
<img alt="Wykres odzysku kolonii zarodników; frakcja vs. procent odzysku; analiza danych wielozarodnikowych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Symulacja wydajności metody na poziomie tetrad. Brak możliwości pomyślnego odzyskania zarodników (w formie kolonii) może wynikać z ich nieżywotności, przylegania zarodników do szklanych kulek, niepowodzenia w oddzieleniu zarodników od siebie itp. Rozkład dwumianowy został wykorzystany do obliczenia oczekiwanej frakcji tetrad (z co najmniej jednym pomyślnie odzyskanym zarodnikiem) wytwarzających 4, 3, 2 lub 1 kolonię na podstawie proporcji wszystkich pomyślnie odzyskanych zarodników. Wykres ten może służyć jako orientacyjny przewodnik po liczbie szczepów, które ostatecznie zostaną zgrupowane w tetrady 3- lub 4-zarodnikowe. Wraz ze wzrostem liczby kolonii na płytce rośnie liczba odzyskanych kompletnych tetrad.
W opisanym powyżej eksperymencie 25 tetrad z krzyżówki o żywotności zarodników bliskiej 100% (ustalonej poprzez ręczną dyssekcję)1 wysiano na 149 płytki z agarem. W tym eksperymencie maksymalna liczba kolonii zaobserwowana na jednej płytce wyniosła 80, co wskazuje, że 20 zarodników nie utworzyło osobnych kolonii. Średnia liczba kolonii na płytce wyniosła 62. Kolonie z 61 płytek zawierających 65 lub więcej kolonii zostały zebrane i poddane sekwencjonowaniu. Z 3 700 szczepów, które przeszły kontrolę jakości sekwencjonowania, 72% można było obliczeniowo przypisać do tetrad 3- lub 4-zarodnikowych.

Sekwencjonowanie tetrad z włączonym kodem kreskowym (BEST) zastępuje ręczne procesy izolacji, zakłócania i rozdzielania tetrad. BEST izoluje tetrady poprzez aktywowane fluorescencją sortowanie komórek na płytkach agarowych, oddziela zarodniki przez mieszanie szklanymi kulkami i określa, które losowo ułożone kolonie pochodzą z tej samej oryginalnej tetrady za pomocą molekularnych kodów kreskowych.

NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie licznej populacji potomstwa rekombinowanego z krzyżówki drożdży w sposób, który pozwala zachować informacje o tym, które osobniki pochodziły z tej samej oryginalnej tetrady. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie transformacji heterozygotycznego szczepu diploidalnego, wykorzystywanego w krzyżówce, biblioteką plazmidową zawierającą kod kreskowy specyficzny dla tetrad oraz fluorescencyjny reporter specyficzny dla sporulacji. Drugim krokiem jest przeniesienie komórek z kodem kreskowym na podłoże do sporulacji.Pozwala to na tworzenie się tetrad i indukuje ekspresję fluorescencyjnego reportera GFP w tetradach, ale nie w komórkach, które nie uległy sporulacji. Następnie sorter FACS oddziela fluorescencyjnie znakowane tetrady od pozostałych komórek i nanosi je bezpośrednio na płytkę agarową, gdzie zewnętrzna otoczka tetrad jest trawiona enzymatycznie. Ostatnim krokiem jest użycie szklanych kulek w celu rozdzielenia i rozprzestrzenienia zarodników z strawionych tetrad na powierzchni płytki agarowej, co pozwala każdemu zarodnikowi na utworzenie pojedynczej kolonii.Ostatecznie szczepy uzyskane tą metodą zostaną poddane genotypowaniu z wykorzystaniem wysokoprzepustowego protokołu sekwencjonowania DNA metodą multipleksową, który odczyta tetraspecyficzny kod kreskowy każdego szczepu. Kody kreskowe są następnie wykorzystywane do identyfikacji każdego z czterech szczepów powstałych w wyniku pojedynczego zdarzenia mejotycznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna tetradowa dyssekcja z użyciem mikromanipulatora, jest fakt, że jeden badacz może wyizolować kilka tysięcy potomstwa rekombinacyjnego w zaledwie kilka godzin.Diplotyczne komórki drożdży wykorzystane w niniejszym badaniu zostały wcześniej przetransformowane biblioteką plazmidów z kodami kreskowymi, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C w celu odzyskania komórek z zamrożonych stoków. Następnego dnia należy hodować je przez noc w 5 ml pożywki YPD z dodatkiem 200 µg/ml G 418 w temperaturze 30 °C przy mieszaniu. Komórki z hodowli nocnych należy przemyć trzykrotnie w PBS, a następnie zawiesić w medium do sporulacji do końcowej objętości 2 ml, z dodatkiem 200 µg/ml.G cztery 18 Mieszaj hodowle sporulacyjne w temperaturze pokojowej. Monitoruj postępy sporulacji codziennie, aż do momentu, gdy przestaną tworzyć się nowe tetrady. Zazwyczaj proces ten trwa od dwóch do czterech dni, odkąd hodowle zawierają dobrze uformowane tetrady i stosunkowo niewielką liczbę dyad.Zdejmij hodowle z wytrząsarki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej siedem dni przed sortowaniem tetrad. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie dobrej separacji przetrwalników. Doświadczalnie ustaliliśmy, że pozostawienie hodowli sporulujących w temperaturze pokojowej bez wytrząsania przez co najmniej tydzień przed sortowaniem tetrad znacznie poprawia separację przetrwalników.Tetrady z kultury sporulacyjnej można wykryć i wyizolować za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), ponieważ plazmidy z kodami kreskowymi w komórkach diploidalnych niosą również specyficzne dla sporulacji białko fuzyjne GFP. Opisany tutaj protokół został opracowany dla urządzenia FACS Aria II. Aby rozpocząć tę procedurę, należy załadować kulturę po sporulacji do sortera FACS i ustawić dwie bramki rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz z boku (side scatter), aby wykluczyć zanieczyszczenia, skupiska komórek oraz obecność wielu komórek w jednej kropelce.Powinna istnieć populacja komórek fluorescencyjnych, która w przypadku zastosowania konstruktu raportującego PS two GFP obejmuje dyady i tetradu; należy zastosować bramkowanie GFP względem FSC, aby uwzględnić te zdarzenia fluorescencyjne. W zależności od tła szczepu może być konieczne zastosowanie dodatkowej bramki w celu usunięcia agregatów zawierających tetrady i inne komórki. Należy przeanalizować histogram FSC dla zdarzeń fluorescencyjnych.W tym przykładzie zdarzenia w lewym piku to głównie tetry, a zdarzenia w prawym piku to zazwyczaj tetry z przyczepionym pączkiem; zastosuj końcowy bramowanie obejmujące zdarzenia o niższym FSC, które są w większości tetrami, co wskazują czerwone paski. Sprawdź wydajność schematu bramowania, sortując około 1 500 tetr na szkiełko mikroskopowe i obliczając proporcję tetrad do obiektów niebędących tetradami. Przy użyciu mikroskopu fazowego z powiększeniem 400x procent tetrad można dokładnie oszacować, licząc jedynie około 200 posortowanych zdarzeń, jednak sortowanie około 1 500 zmniejsza czas poświęcony na poszukiwanie komórek na szkiełku mikroskopowym.Te obrazy w jasnym polu mają powiększenie 600x. Przedstawiają przykłady tetrad po lewej stronie oraz obiektów niebędących tetradami po prawej stronie po sortowaniu faktów. Okresowo sprawdzaj, czy sortery dokładnie raportują liczbę zdarzeń, sortując 25 tetrad na okładkę szkiełka przedmiotowego i badając komórki znajdujące się w kropelce za pomocą mikroskopu w kontraście fazowym przy powiększeniu 400x.W kropelce powinno znajdować się 25 tetrad. Powtórz tę czynność trzy lub cztery razy, aby ocenić wariancję urządzenia fax w danej serii. Przygotuj płytki agarowe do tej procedury, ogrzewając odpowiednią liczbę 18 płytek z pożywką YPD plus G przez co najmniej 1,5 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C umieszczonym w pobliżu sortera fax.Kluczową cechą protokołu sortowania jest możliwość dokładnego kierowania tetrad sortowanych metodą FACS do konkretnego miejsca na płytce agarowej zawierającej pulę roztworu X. W tym celu należy najpierw umieścić orientacyjną płytkę 96-dołkową w zautomatyzowanej jednostce depozycji komórek sortera. Następnie należy przygotować układ sortowania, który pozwoli na przesortowanie 25 tetrad do jednego dołka płytki 96-dołkowej.Prawidłowe sortowanie 25 tetrad na płytkę pozwala uzyskać dobrze odseparowane kolonie. Wybierz dołek znajdujący się blisko środka płytki, na przykład dołek D5.Przenieś stos 10 płytek z agarem z inkubatora ustawionego na 37 °C do sortera. Pobierz jedną płytkę z agarem i nanieś pipetą 25 µL roztworu zy na agar w pobliżu środka płytki. Następnie umieść płytkę na referencyjnej płytce 96-dołkowej, wyrównując kroplę X nad celem.Wybrano to wcześniej. Sódni D5. Rozpocznij sortowanie i zdeponuj 25 tetras w centrum kropli zy na płytce agarowej.Wyjmij i przykryj płytkę. Powtórz sortowanie dla każdej płytki, aż do momentu, gdy na każdej płytce w stosie zostanie posortowane 25 tetrad do kropel zamo. Wróć stos płytek zawierających tetrady do inkubatora ustawionego na 37 °C.Przenieś następny stos 10 płytek do sortera i powtórz procedurę sortowania. Zarodniki można oddzielić po inkubacji płytek z agarem zawierającym tetrady w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do każdej płytki od 15 do 25 sterylnych szklanych kulek o średnicy 3 mm, a następnie potrząsaj płytkami, podzielonymi na dwa stosy po pięć płytek, przez trzy do pięciu minut.Najlepszą separację zarodników uzyskuje się poprzez sztywne przesuwanie płytek z boku na bok lub od przodu do tyłu. Nie należy przesuwać płytek w sposób, który powodowałby wirowanie kulek przy zewnętrznej krawędzi płytki. Po zakończeniu pracy pozostaw kulki na płytkach.Umieść stos płytek z koralikami skierowanymi do góry w inkubatorze w temperaturze 30 °C. Wyjmij kolejny stos płytek z inkubatora w temperaturze 37 °C i powtórz procedurę separacji zarodników z wykorzystaniem koralików. Wszystkie płytki inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C w dniu następującym po separacji zarodników.Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora ustawionego na 30 °C, uważając, aby nie poruszyć szklanych kulek. Na płytkach powinny powstać małe kolonie. Usuń szklane kulki, ostrożnie i szybko odwracając płytki nad głębokim pojemnikiem.Opukanie dna płytki w pozycji odwróconej może pomóc w odklejeniu kulek przywierających do jej powierzchni. Pojemniki powinny być wystarczająco głębokie, aby przechwycić kulki, zapobiegając ich odbijaniu się i uderzaniu w płytkę z agarem. Należy policzyć liczbę kolonii na każdej płytce i wykorzystać tę liczbę do oszacowania wydajności oddzielania i odzyskiwania przetrwalników.Na przykład 25 tetrad na płytce w przypadku krzyżówki o przeżywalności bliskiej 100% mogłoby przynieść łącznie 100 kolonii na płytkę z płytek o wystarczającej liczbie kolonii, na przykład powyżej 65 przy wysokiej przeżywalności. Przenieś komórki z każdej kolonii do oddzielnej studzienki płytki 96-dołkowej zawierającej pożywkę YPD w formie płynnej z dodatkiem G four 18. Zapisz również, które studzienki zawierają kolonie z tej samej płytki z agarem.Informacje te zostaną wykorzystane później do pomocy w przypisywaniu tetrad. Oprogramowanie Software best może znacznie zwiększyć szybkość izolacji zarodników z tetrad. Chociaż obecna wersja metody wykazuje pewien spadek wydajności w porównaniu z manualną sekcją, do obliczenia oczekiwanego ułamka tetrad z co najmniej jednym pomyślnie odzyskanym zarodnikiem tworzącym 1, 2, 3 lub cztery kolonie, w oparciu o proporcję wszystkich pomyślnie odzyskanych zarodników, wykorzystano rozkład dwumianowy.Wykres ten może służyć jako orientacyjna wskazówka dotycząca liczby szczepów, które ostatecznie zostaną zmontowane w trzy lub cztery tetry zarodników, zgodnie z obserwacjami w niniejszym badaniu. Liczba odzyskanych kompletnych tetr rośnie wraz ze wzrostem liczby kolonii na płytce w tym badaniu. 25 radów z całego zakresu, przy żywotności zarodników bliskiej 100% ustalonej poprzez manualną dyssekcję, wysiano na 149 płytek z agarem.Maksymalna liczba kolonii zaobserwowana na płytce wyniosła 80, co wskazuje, że 20 spor nie utworzyło oddzielnych kolonii. Średnia liczba kolonii na płytkę wynosiła 62. Z 61 płytek zawierających 65 lub więcej kolonii wyizolowano i zsekwencjonowano 4 354 kolonie. Z 3 700 szczepów, które przeszły kontrolę jakości sekwencjonowania, 2 665, czyli 72%, po opracowaniu danych mogło zostać obliczeniowo przypisane do trzech lub czterech tetrad spor.Technikę tę można wykorzystać do procesowania ponad tysiąca tetrad na godzinę. W przypadku jednak procedur trwających dłużej niż trzy godziny, konieczna będzie pomoc.

best-barcode-enabled-sequencing-of-tetrads

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie z kodami kreskowymi w tetradach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Poznaj metodę BEST do automatycznej izolacji tetrad drożdży z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Technika ta umożliwia szybkie generowanie tysięcy rekombinowanych potomstw z zachowaniem informacji o pochodzeniu.

NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Przeglądaj więcej filmów