NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie licznej populacji potomstwa rekombinowanego z krzyżówki drożdży w sposób, który pozwala zachować informacje o tym, które osobniki pochodziły z tej samej oryginalnej tetrady. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie transformacji heterozygotycznego szczepu diploidalnego, wykorzystywanego w krzyżówce, biblioteką plazmidową zawierającą kod kreskowy specyficzny dla tetrad oraz fluorescencyjny reporter specyficzny dla sporulacji. Drugim krokiem jest przeniesienie komórek z kodem kreskowym na podłoże do sporulacji.

Pozwala to na tworzenie się tetrad i indukuje ekspresję fluorescencyjnego reportera GFP w tetradach, ale nie w komórkach, które nie uległy sporulacji. Następnie sorter FACS oddziela fluorescencyjnie znakowane tetrady od pozostałych komórek i nanosi je bezpośrednio na płytkę agarową, gdzie zewnętrzna otoczka tetrad jest trawiona enzymatycznie. Ostatnim krokiem jest użycie szklanych kulek w celu rozdzielenia i rozprzestrzenienia zarodników z strawionych tetrad na powierzchni płytki agarowej, co pozwala każdemu zarodnikowi na utworzenie pojedynczej kolonii.

Ostatecznie szczepy uzyskane tą metodą zostaną poddane genotypowaniu z wykorzystaniem wysokoprzepustowego protokołu sekwencjonowania DNA metodą multipleksową, który odczyta tetraspecyficzny kod kreskowy każdego szczepu. Kody kreskowe są następnie wykorzystywane do identyfikacji każdego z czterech szczepów powstałych w wyniku pojedynczego zdarzenia mejotycznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna tetradowa dyssekcja z użyciem mikromanipulatora, jest fakt, że jeden badacz może wyizolować kilka tysięcy potomstwa rekombinacyjnego w zaledwie kilka godzin.

Diplotyczne komórki drożdży wykorzystane w niniejszym badaniu zostały wcześniej przetransformowane biblioteką plazmidów z kodami kreskowymi, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C w celu odzyskania komórek z zamrożonych stoków. Następnego dnia należy hodować je przez noc w 5 ml pożywki YPD z dodatkiem 200 µg/ml G 418 w temperaturze 30 °C przy mieszaniu. Komórki z hodowli nocnych należy przemyć trzykrotnie w PBS, a następnie zawiesić w medium do sporulacji do końcowej objętości 2 ml, z dodatkiem 200 µg/ml.

G cztery 18 Mieszaj hodowle sporulacyjne w temperaturze pokojowej. Monitoruj postępy sporulacji codziennie, aż do momentu, gdy przestaną tworzyć się nowe tetrady. Zazwyczaj proces ten trwa od dwóch do czterech dni, odkąd hodowle zawierają dobrze uformowane tetrady i stosunkowo niewielką liczbę dyad.

Zdejmij hodowle z wytrząsarki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej siedem dni przed sortowaniem tetrad. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie dobrej separacji przetrwalników. Doświadczalnie ustaliliśmy, że pozostawienie hodowli sporulujących w temperaturze pokojowej bez wytrząsania przez co najmniej tydzień przed sortowaniem tetrad znacznie poprawia separację przetrwalników.

Tetrady z kultury sporulacyjnej można wykryć i wyizolować za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), ponieważ plazmidy z kodami kreskowymi w komórkach diploidalnych niosą również specyficzne dla sporulacji białko fuzyjne GFP. Opisany tutaj protokół został opracowany dla urządzenia FACS Aria II. Aby rozpocząć tę procedurę, należy załadować kulturę po sporulacji do sortera FACS i ustawić dwie bramki rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz z boku (side scatter), aby wykluczyć zanieczyszczenia, skupiska komórek oraz obecność wielu komórek w jednej kropelce.

Powinna istnieć populacja komórek fluorescencyjnych, która w przypadku zastosowania konstruktu raportującego PS two GFP obejmuje dyady i tetradu; należy zastosować bramkowanie GFP względem FSC, aby uwzględnić te zdarzenia fluorescencyjne. W zależności od tła szczepu może być konieczne zastosowanie dodatkowej bramki w celu usunięcia agregatów zawierających tetrady i inne komórki. Należy przeanalizować histogram FSC dla zdarzeń fluorescencyjnych.

W tym przykładzie zdarzenia w lewym piku to głównie tetry, a zdarzenia w prawym piku to zazwyczaj tetry z przyczepionym pączkiem; zastosuj końcowy bramowanie obejmujące zdarzenia o niższym FSC, które są w większości tetrami, co wskazują czerwone paski. Sprawdź wydajność schematu bramowania, sortując około 1 500 tetr na szkiełko mikroskopowe i obliczając proporcję tetrad do obiektów niebędących tetradami. Przy użyciu mikroskopu fazowego z powiększeniem 400x procent tetrad można dokładnie oszacować, licząc jedynie około 200 posortowanych zdarzeń, jednak sortowanie około 1 500 zmniejsza czas poświęcony na poszukiwanie komórek na szkiełku mikroskopowym.

Te obrazy w jasnym polu mają powiększenie 600x. Przedstawiają przykłady tetrad po lewej stronie oraz obiektów niebędących tetradami po prawej stronie po sortowaniu faktów. Okresowo sprawdzaj, czy sortery dokładnie raportują liczbę zdarzeń, sortując 25 tetrad na okładkę szkiełka przedmiotowego i badając komórki znajdujące się w kropelce za pomocą mikroskopu w kontraście fazowym przy powiększeniu 400x.

W kropelce powinno znajdować się 25 tetrad. Powtórz tę czynność trzy lub cztery razy, aby ocenić wariancję urządzenia fax w danej serii. Przygotuj płytki agarowe do tej procedury, ogrzewając odpowiednią liczbę 18 płytek z pożywką YPD plus G przez co najmniej 1,5 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C umieszczonym w pobliżu sortera fax.

Kluczową cechą protokołu sortowania jest możliwość dokładnego kierowania tetrad sortowanych metodą FACS do konkretnego miejsca na płytce agarowej zawierającej pulę roztworu X. W tym celu należy najpierw umieścić orientacyjną płytkę 96-dołkową w zautomatyzowanej jednostce depozycji komórek sortera. Następnie należy przygotować układ sortowania, który pozwoli na przesortowanie 25 tetrad do jednego dołka płytki 96-dołkowej.

Prawidłowe sortowanie 25 tetrad na płytkę pozwala uzyskać dobrze odseparowane kolonie. Wybierz dołek znajdujący się blisko środka płytki, na przykład dołek D5.

Przenieś stos 10 płytek z agarem z inkubatora ustawionego na 37 °C do sortera. Pobierz jedną płytkę z agarem i nanieś pipetą 25 µL roztworu zy na agar w pobliżu środka płytki. Następnie umieść płytkę na referencyjnej płytce 96-dołkowej, wyrównując kroplę X nad celem.

Wybrano to wcześniej. Sódni D5. Rozpocznij sortowanie i zdeponuj 25 tetras w centrum kropli zy na płytce agarowej.

Wyjmij i przykryj płytkę. Powtórz sortowanie dla każdej płytki, aż do momentu, gdy na każdej płytce w stosie zostanie posortowane 25 tetrad do kropel zamo. Wróć stos płytek zawierających tetrady do inkubatora ustawionego na 37 °C.

Przenieś następny stos 10 płytek do sortera i powtórz procedurę sortowania. Zarodniki można oddzielić po inkubacji płytek z agarem zawierającym tetrady w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do każdej płytki od 15 do 25 sterylnych szklanych kulek o średnicy 3 mm, a następnie potrząsaj płytkami, podzielonymi na dwa stosy po pięć płytek, przez trzy do pięciu minut.

Najlepszą separację zarodników uzyskuje się poprzez sztywne przesuwanie płytek z boku na bok lub od przodu do tyłu. Nie należy przesuwać płytek w sposób, który powodowałby wirowanie kulek przy zewnętrznej krawędzi płytki. Po zakończeniu pracy pozostaw kulki na płytkach.

Umieść stos płytek z koralikami skierowanymi do góry w inkubatorze w temperaturze 30 °C. Wyjmij kolejny stos płytek z inkubatora w temperaturze 37 °C i powtórz procedurę separacji zarodników z wykorzystaniem koralików. Wszystkie płytki inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C w dniu następującym po separacji zarodników.

Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora ustawionego na 30 °C, uważając, aby nie poruszyć szklanych kulek. Na płytkach powinny powstać małe kolonie. Usuń szklane kulki, ostrożnie i szybko odwracając płytki nad głębokim pojemnikiem.

Opukanie dna płytki w pozycji odwróconej może pomóc w odklejeniu kulek przywierających do jej powierzchni. Pojemniki powinny być wystarczająco głębokie, aby przechwycić kulki, zapobiegając ich odbijaniu się i uderzaniu w płytkę z agarem. Należy policzyć liczbę kolonii na każdej płytce i wykorzystać tę liczbę do oszacowania wydajności oddzielania i odzyskiwania przetrwalników.

Na przykład 25 tetrad na płytce w przypadku krzyżówki o przeżywalności bliskiej 100% mogłoby przynieść łącznie 100 kolonii na płytkę z płytek o wystarczającej liczbie kolonii, na przykład powyżej 65 przy wysokiej przeżywalności. Przenieś komórki z każdej kolonii do oddzielnej studzienki płytki 96-dołkowej zawierającej pożywkę YPD w formie płynnej z dodatkiem G four 18. Zapisz również, które studzienki zawierają kolonie z tej samej płytki z agarem.

Informacje te zostaną wykorzystane później do pomocy w przypisywaniu tetrad. Oprogramowanie Software best może znacznie zwiększyć szybkość izolacji zarodników z tetrad. Chociaż obecna wersja metody wykazuje pewien spadek wydajności w porównaniu z manualną sekcją, do obliczenia oczekiwanego ułamka tetrad z co najmniej jednym pomyślnie odzyskanym zarodnikiem tworzącym 1, 2, 3 lub cztery kolonie, w oparciu o proporcję wszystkich pomyślnie odzyskanych zarodników, wykorzystano rozkład dwumianowy.

Wykres ten może służyć jako orientacyjna wskazówka dotycząca liczby szczepów, które ostatecznie zostaną zmontowane w trzy lub cztery tetry zarodników, zgodnie z obserwacjami w niniejszym badaniu. Liczba odzyskanych kompletnych tetr rośnie wraz ze wzrostem liczby kolonii na płytce w tym badaniu. 25 radów z całego zakresu, przy żywotności zarodników bliskiej 100% ustalonej poprzez manualną dyssekcję, wysiano na 149 płytek z agarem.

Maksymalna liczba kolonii zaobserwowana na płytce wyniosła 80, co wskazuje, że 20 spor nie utworzyło oddzielnych kolonii. Średnia liczba kolonii na płytkę wynosiła 62. Z 61 płytek zawierających 65 lub więcej kolonii wyizolowano i zsekwencjonowano 4 354 kolonie. Z 3 700 szczepów, które przeszły kontrolę jakości sekwencjonowania, 2 665, czyli 72%, po opracowaniu danych mogło zostać obliczeniowo przypisane do trzech lub czterech tetrad spor.

Technikę tę można wykorzystać do procesowania ponad tysiąca tetrad na godzinę. W przypadku jednak procedur trwających dłużej niż trzy godziny, konieczna będzie pomoc.