Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wirusem Sendai. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i posiew komórek fibroblastów, które mają zostać przetransdukowane. Kolejnym krokiem zabiegu jest zakażenie komórek wirusem Sendai.

Następnie zakażone komórki fibroblastów są przenoszone na świeże embrionalne komórki żywiące fibroblasty myszy. Ostatnim krokiem jest ręczne wybranie przeprogramowanego. Obecnie pluripotencjalne komórki macierzyste, ostatecznie przeprogramowanie komórek fibroblastów w PSC I, bez użycia genów trans, można wykazać za pomocą znakowania immunologicznego i R-T-P-C-R.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że zwiększa ona wydajność przeprogramowania bez pozostawania przy transporcie i w opłacalny sposób W przypadku tego protokołu należy mieć gotowe ludzkie fibroblasty hodowane w DMEM. Za pomocą FBS przenieś te komórki na 24-dołkowe płytki w celu eksperymentu, płytki komórek w sześciu szeregowych rozcieńczeniach, aby określić najlepszą gęstość do przyłączenia komórek. Każdy rząd płytki 24-dołkowej może pomieścić jedną serię komórek do rozcieńczania.

W ten sposób na jednej płytce można przetestować cztery typy komórek, inkubować rozcieńczenie przez 24 godziny. Następnego dnia wybierz studnie na trzech poziomach konfluencji do transdukcji. Jeden na wysokim poziomie zbiegu od 80 do 90%, drugi przy około 60% konfluencji, a trzeci przy około 30% konfluencji na godzinę lub więcej przed transdukcją.

Zastąp pożywkę 300 mikrolitrami świeżej pożywki fibroblastów do rozmrażania transdukcji. Jeden zestaw probówek z wirusem Sendai w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka sekund, a następnie zakończ. Rozmrażanie ich w temperaturze pokojowej.

Odwirować rozmrożone wirusy w temperaturze 6 000 G przez 10 sekund i przechowywać je na lodzie w jednej mikroprobówce wirówkowej. Przygotuj mieszaninę wirusów obliczoną na podstawie liczby komórek, które mają zostać przetransdukowane. Szczegóły obliczeń można znaleźć w protokole tekstowym.

Dobrze wymieszać wirusy, delikatnie pipetując. Teraz do najbardziej zagęszczonych komórek dodaj dwie objętości wirusa. Dodaj jedną objętość wirusa do komórek o średniej gęstości i dodaj połowę objętości wirusa do najmniej gęstego zaznaczenia.

Zakręć płytką i pozwól jej inkubować przez noc, aby reakcja zaszła następnego dnia. Zastąp pożywkę 500 mikrolitrami świeżej pożywki fibroblastowej. Zrób to ponownie dwa dni później, trzy dni po drugiej zmianie pożywki dokonanej na transdukowanych komórkach.

Przygotuj komórki metamfetaminy w 60-milimetrowych naczyniach z DMEM zawierającym 10% FBS, płytkę 500 000 komórek na naczynie i inkubuj je przez noc. Następnego dnia zastąp pożywkę na komórkach metamfetaminy świeżą pożywką, a następnie przystąp do ustawiania kokultury. Najpierw usuń pożywkę z transdukowanych fibroblastów i przemyj je raz DPBS.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,25% trypsyny EDTA do każdej transdukowanej studzienki komórek w ciągu pięciu minut. Zbierz wszystkie odłączające komórki w jednej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki w temperaturze 1 350 G przez cztery minuty.

Następnie usunąć supernatant i przemyć granulowane komórki około pięcioma mililitrami świeżej pożywki, aby zneutralizować trippin. Teraz zbierz komórki, obracając je przez kolejne cztery minuty przy 1 350 G.Następna płytka. Większość komórek to sześć seryjnych rozcieńczeń metamfetaminy.

Pierwsze i ostatnie rozcieńczenie może nie być potrzebne w zależności od śmiertelności komórek. Zachowaj niektóre komórki do ekstrakcji RNA i inkubuj płytki przez noc. Następnego dnia zastąp pożywkę ludzkim podłożem ES uzupełnionym 10 mikromolami inhibitora kinazy RO Y 2 7 6 3 2.

Aby poprawić przeżywalność komórek w ciągu następnych dni, zmień pożywkę na normalną pożywkę ludzką ES uzupełnioną unsu. Po tygodniu hodowli zacznij sprawdzać szalki co kilka dni pod kątem tworzenia się kolonii ES, takich jak grudki komórek. Gdy się pojawią, monitoruj wzrost.

Trzy tygodnie po transdukcji kolonie grudek komórek ES powinny być gotowe do ekspansji. Przygotowałem komórki podające metamfetaminę na 24-dołkowych płytkach, tak jak były one przygotowane dla płytek 60-milimetrowych. Przed pobraniem jakichkolwiek kolonii zmień pożywkę na komórkach metamfetaminy na pożywkę ES z 10 mikrolitrami Y 2 7, 6, 3, 2.

Wybieraj z naczyń jedną kolonię na raz. Przenieś kolonię do 15-mililitrowej probówki z tamtejszym roztworem. Rozdrobnij kolonię za pomocą pipetera.

Potem przykryj jednego mnie. No cóż, z rozbitą kolonią. Ostatecznie załaduj każdą studnię jedną rozdrobnioną kolonią i załaduj jak najwięcej studni.

Utrzymuj komórki za pomocą codziennych zmian pożywki i rozszerz je do sześciu płytek dołkowych, a następnie 60-milimetrowych szalek. Zazwyczaj fibroblasty zakażone wirusem Sendai nie wykazują żadnych zmian morfologicznych aż do pięciu dni. Następnie komórki przybierają okrągły kształt z większym jądrem i mniejszą cytoplazmą.

Ten protokół na małą skalę obejmuje kilka parametrów, które można zoptymalizować, takich jak gęstość fibroblastów, miano wirusa i gęstość posiewu do mes. Można również zoptymalizować transdukcję komórek o różnej płynności pokazanej w różnych kolorach. Po tygodniu wspólnej hodowli z komórkami karmiącymi metamfetaminę, częściowo przeprogramowane fibroblasty mają luźny kształt przypominający kształt i są łatwe do zebrania, w przeciwieństwie do zbierania za pomocą trypsyny.

W pełni przeprogramowane komórki komórkowe I są łatwo rozpoznawalne od częściowo przeprogramowanych komórek. W pełni przeprogramowane komórki są ciasno upakowane, a kolonie mogą mieć wyraźne granice. Częściowo przeprogramowane komórki tworzą luźne klastry, które można łatwo odczepić.

Po namnażaniu klonów IPSC przez kilka tygodni, barwienie w poszukiwaniu markerów komórek macierzystych jest uzasadnione w porównaniu z komórkami H9. IPC są dodatnie dla kilku oczekiwanych przeciwciał, w tym SSEA cztery, OCT cztery, TRA 81 i nano G, co potwierdza ich pluripotencjalną jakość. Za pomocą R-T-P-C-R ekspresji transgenu nie stwierdzono u ludzkich klonów IPSC.

Po 10 starterach dla egzogennego OCT cztery, SOX dwa, klf cztery i Cmic zastosowano z pozytywnymi próbkami kontrolnymi, które wykazały silne poziomy ekspresji transgenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprogramować komórki somatyczne, aby indukować polipotencjalne komórki macierzyste i jak je wybrać, całkowicie przeprogramować komórki z innych komórek.