Name: Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę generowania ludzkich indukowanych komórek macierzystych z fibroblastów przy użyciu wirusa Sendai. Technika ta zapewnia wysoką wydajność reprogramowania bez integracji transgenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lee za cenne dyskusje na temat rękopisu. Prace w laboratorium Lee były wspierane przez granty z Robertson Investigator Award New York Stem Cell Foundation oraz z Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Przygotowanie komórki i mediów (Dzień 1)
<ol>
	<li>Hodowla i ekspansja ludzkich fibroblastów za pomocą pożywek DMEM zawierających 10% FBS.</li>
	<li>Umieść ludzkie fibroblasty (ryc. 1) na 24-dołkowej płytce z odpowiednią gęstością na studzienkę w dniu poprzedzającym transdukcję. 
		nuta: Zalecane są następujące rozcieńczenia seryjne (200 K, 100 K, 50 K, 25 K, 12,5 K i 6,25 K), ponieważ różne typy komórek mają różną zdolność przyłączania.</li>
	<li>Inkubować komórki jeszcze przez jeden dzień w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 , upewniając się, że komórki w pełni przylegają i są rozciągnięte.</li>
</ol>
2. Wykonaj transdukcję (dzień 2)
<ol>
	<li>W dniu transdukcji należy sprawdzić gęstość komórek i wybrać najbardziej efektywne studzienki o gęstości (rysunek 2). Lepiej jest wybrać trzy różne gęstości: wysoką (80 ~ 90%), średnią (50 ~ 70%) i niską (20 ~ 40%).</li>
	<li>Co najmniej 1 godzinę przed transdukcją odessać pożywkę fibroblastów z komórek i wymienić nowe 300 μl pożywki fibroblastowej.</li>
	<li>Wyjmij jeden zestaw 4 różnych probówek z wirusem Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Rozmrozić każdą probówkę w tym samym czasie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka sekund, a następnie wyjąć probówki z łaźni wodnej. Następnie rozmrozić je do temperatury pokojowej; Probówki wirówkowe o masie 6 000 x g przez 10 sekund i umieszczać je na lodzie do czasu użycia. Nie zamrażaj ponownie i nie rozmrażaj wirusa, ponieważ miana nie utrzymają się.</li>
	<li>Dodać wskazane objętości każdej z czterech probówek z wirusem Sendai (Oct-4, Klf-4, c- Myc i Sox-2) do probówki mikrowirówkowej. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany, delikatnie pipetując. Na przykład, jeśli 50 tys. komórek/jedna studzienka na płytce 24-dołkowej wygląda dobrze na transdukcję: (Miano oparte na Certyfikacie Analizy od Life Technologies, może się różnić w zależności od partii) 
			Rurka hOct-4 = 6,0 x 107 CIU, 3 MOI = 5 μl 
			Rurka hSox-2 = 6,5 x 107 CIU, 3 MOI = 4,6 μl 
			Rurka hKlf-4 = 6,3 x 107 CIU, 3 MOI = 4,8 μl 
			Rurka hc-Myc = 7,8 x 107 CIU, 3 MOI = 3,8 μl 
		Razem = 18,2 μl mieszaniny czterech czynników wirusowych/jeden dołek (50 tys. komórek) z płytki 24-dołkowej</li>
	<li>W zależności od gęstości komórek, dodaj 2X, 1X i 0,5X objętość mieszaniny wirusów do studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką od przodu do tyłu, w lewo i w prawo (2X: 36,4 μl mieszaniny wirusów, 1X: 18,2 μl i 0,5X: 9,1 μl).</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez noc.</li>
</ol>
3. Wymiana pożywki hodowlanej (Dzień 3 i Dzień 5)
<ol>
	<li>24 godziny po transdukcji zastąp pożywkę 500 μl świeżej pożywki fibroblastowej.</li>
	<li>W dniu 5 zmień pożywkę na świeżą pożywkę fibroblastów.</li>
</ol>
4. Przygotuj potrawy MEF dla kokultury (Dzień 8)
<ol>
	<li>Przygotować komórki MEF w 60-milimetrowych szalkach hodowlanych z 10% pożywką DMEM zawartą w FBS na dzień przed przeniesieniem transdukowanego fibroblastu na komórki zasilające MEF. 
		Uwaga: Używamy 5 x 105 MEF w każdej naczyniu 60 mm.</li>
</ol>
5. Rozpocznij kokulturację transdukowanych komórek z komórkami zasilającymi MEF (Dzień 9)
<ol>
	<li>Przed posiewem transdukowanych komórek odessać 10% pożywki DMEM zawierającej FBS z naczyń podajnika MEF i dodać świeżą pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS.</li>
	<li>Usuń pożywkę z transdukowanych fibroblastów, które znajdują się w 24-dołkowej płytce i przemyj komórki raz D-PBS. Dodaj 200 μl 0,25% trypsyny/EDTA do komórek fibroblastów w 24-dołkowej płytce. Po mniej niż 5 minutach inkubacji z trypsyną/EDTA, gdy komórki zaczną odłączać się od płytki, zebrać komórki z pożywką wzrostową w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie odwirować je w 6 000 x g przez 4 min. 
		nuta: Zaleca się łączenie fibroblastów transdukowanych wirusem 2X, 1X i 0,5X.</li>
	<li>Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem i przemyć w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego 4-5 ml świeżej pożywki fibroblastowej w celu zneutralizowania z trypsyny. Następnie odwirować je przy 135 x g przez 4 min.</li>
	<li>Płytki jako gęstość rozcieńczenia szeregowego i rozpocząć kohodowlę z pożywkami fibroblastów na MEF: takich jak 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 i 1/128 na szalkę 60 mm. W zależności od wskaźnika śmierci komórek w pierwszym tygodniu transdukcji, może nie być konieczne rozcieńczanie do gęstości 1/2 lub 1/128. Odłóż na bok pozostałe komórki, aby wyekstrahować całkowite RNA jako pozytywną kontrolę dla Transgene RT-PCR.</li>
	<li>Umieść na noc szalki o średnicy 60 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Podawaj ludzkie embrionalne komórki macierzyste i monitoruj komórki (Dzień 10)
<ol>
	<li>Następnego dnia zmień pożywkę fibroblastową na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Następnie codziennie zmieniaj pożywkę na ludzką pożywkę ES: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml zamiennika surowicy nokautującej + 10 ml L-glutaminy + 10 ml minimum 10 mM MEM aminokwasów endogennych + 1 ml 2-merkaptoetanolu + 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów.</li>
	<li>Wykonuj codzienną zmianę nośnika za pomocą świeżych ludzkich pożywek ES. Po tygodniu sprawdzaj naczynia raz na 2 ~ 3 dni pod mikroskopem pod kątem tworzenia się grudek komórek przypominających kolonię ES. W zależności od typu komórki, hodowla zajmie mniej lub więcej czasu, zanim zostaną znalezione kolonie.</li>
</ol>
7. Wybieranie indukowanych pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i rozszerzanie komórek (Dzień 20~)
<ol>
	<li>Trzy tygodnie po transdukcji kolonie powinny wyglądać na odpowiednio wyrośnięte do zbioru.</li>
	<li>Dzień przed zbiorem rodzin przygotuj karmnik MEF na płytce 24-dołkowej. UWAGA: Używamy 12,5 x 105 MEF na jednej płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Następnego dnia zmień pożywkę szalek MEF z pożywki fibroblastów na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Za każdym razem ręcznie pobierać jedną kolonię pod mikroskopem w kapturze do wybierania i tworzyć mniejsze grudki za pomocą pipetowania i przenoszenia ich na nowo przygotowane szalki MEF. Spróbuj wybrać kilka klonów.</li>
	<li>Najpierw przejdź i rozszerz każdą studzienkę z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej. Następnie z płytki 6-dołkowej na szalkę 60 mm przed dalszym rozmnażaniem.</li>
</ol>
8. Charakterystyka ludzkich iPSC (po 10 przejściach)
<ol>
	<li>Immunofluorescencji
		<ol>
			<li>Umieść ludzkie iPSC na 24-dołkowej płytce i posiew przez 4-5 dni z codzienną wymianą pożywki.</li>
			<li>Aby rozpocząć test immunofluorescencyjny, należy raz przemyć płytkę D-PBS. Następnie natychmiast utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Następnie myj trzy razy w D-PBS przez 5 minut.</li>
			<li>Utrwalone komórki należy traktować 0,1% roztworem Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zassać roztwór do permeablacji (0,1% roztwór trytona X-100), a następnie dodać 0,5% roztwór blokujący BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wykonaj detekcję Nanog, Oct-4, SSEA (specyficzny dla etapu antygen embrionalny) i TRA-1-81 (antygen odrzucenia nowotworu) za pomocą przeciwciała antyludzkiego w 0,5% roztworze BSA (sprawdź tabelę materiałów dla szybkości rozcieńczenia przeciwciał). Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy w D-PBS przez 5 minut każdy.</li>
			<li>Sprawdź za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 1 godzinie inkubacji z przeciwciałami anty-mysim IgG Alexa Fluor 488 Goat jako 2 przeciwciałem ND, które rozcieńcza się w stosunku 1:2,000 w 0,5% roztworze BSA w temperaturze pokojowej. Wybarwić wszystkie jądra każdej komórki zasilającej MEF i hiPSC za pomocą DAPI.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>RT-PCR potwierdzenia transgenu
		<ol>
			<li>Ekstrakcja całkowitego mRNA z osadu komórkowego za pomocą odczynników do ekstrakcji RNA.</li>
			<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję na podwielokrotnościach (1 μg) całkowitego RNA i wynikowym cDNA do amplifikacji PCR przez odwrotną transkryptazę.</li>
			<li>Przygotować mieszaniny PCR tak, aby zawierały 2 μl matrycy cDNA, 10 μl mieszaniny głównej 2X PCR, 2 μl 2 pmol starterów (do przodu: 1 μl i do tyłu: 1 μl) i 6 μl DW. Aby wykryć ekspresję genu, należy wykonać RT-PCR ze starterami wymienionymi w Tabeli 1.</li>
			<li>Wykonaj RT-PCR z genem GAPDH jako kontrolę skuteczności reakcji amplifikacji. Wizualizacja i analiza produktu PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych na hiPSC niesie ze sobą bezprecedensowe nadzieje w dziedzinie biologii podstawowej, medycyny osobistej itransplantacji. Wcześniej ludzkie generacje iPSC wymagały wirusa DNA, który stwarza ryzyko integracji z genomem gospodarza, co może powodować niepożądane mutacje genetyczne, które ograniczają dalsze zastosowania kliniczne, takie jak opracowywanie leków i terapie transplantacyjne13. Z tego powodu doniesiono o wielu badaniach, w których za pomocą kilku...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mają zdolność do samoodnawiania się in vitro i mają pluripotencję, co może być potencjalnie przydatne do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i rozwoju terapii komórkowych do leczenia chorób i uszkodzeń tkanek. Jednak hESC mają ograniczenia w terapii zastępczej komórek ze względu na bariery immunologiczne, onkologiczne i etyczne, a w celu zbadania genów związanych z chorobą, specyficzne dla choroby hESC można wyizolować za pomocą metod preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej (PGD), ale nadal jest to technicznie trudne, a dawstwo zarodków jest dość rzadkie. Zagadnienia te są związane z postępem w biologii komórek macierzystych, który doprowadził do rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).
Ludzkie iPSC są genetycznie przeprogramowane z ludzkich dorosłych komórek somatycznych i posiadają pluripotencjalne cechy podobne do komórek macierzystych hESC, co czyni je użytecznym źródłem dla medycyny regeneracyjnej, takiej jak odkrywanie leków, modelowanie chorób i terapia komórkowa w sposób specyficzny dla pacjenta1,2 .
Do tej pory istnieje kilka metod generowania ludzkich iPSC, w tym transdukcji genów za pośrednictwem wirusów (retrowirus i adenowirus)3, transdukcji genów bez pośrednictwa wirusa (transdukcja systemu BAC i wektorów)4 oraz system dostarczania białek5-7.
Chociaż dostarczenie genów za pośrednictwem wirusa może zapewnić pewien poziom efektywności, wektory wirusowe mogą pozostawić ślad genetyczny, ponieważ integrują się z chromosomami gospodarza, aby wyrazić przeprogramowanie genów w niekontrolowany sposób. Nawet jeśli wirusowa integracja czynników transkrypcyjnych może aktywować lub dezaktywować geny gospodarza8, może spowodować nieoczekiwaną aberrację genetyczną i ryzyko nowotworzenia5,9. Z drugiej strony, donoszono o bezpośrednim wprowadzeniu białek lub RNA do komórek somatycznych, ale ma to pewne wady, takie jak pracochłonna, wielokrotna transfekcja i niski poziom przeprogramowania7,10. Nawet episomalny i nieintegrujący adenowirus, wirus związany z adenowirusem i wektory plazmidowe są nadal stosunkowo mniejwydajne11. Z tych powodów prawdopodobne jest wybranie metod przeprogramowania nieintegracyjnego o wysokiej skuteczności generowania iPSC i mniejszej liczbie nieprawidłowości genetycznych. W tym badaniu używamy przeprogramowania opartego na wirusie Sendai. Wiadomo, że metoda ta nie jest zintegrowana z genomem gospodarza i konsekwentnie wytwarza ludzkie iPSC bez integracji transgenowych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEFs, odporny na neomycynę, poddany działaniu mitomycyny C&nbsp;</td><td>Globalna płytka macierzysta</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm lub płytka 12,5 x 105/24-dołkowa</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25% Trypsyna z EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska z pokrywką</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Magazyn: 10 mM)</td></tr><tr><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Magazyn: 100 ug)</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Modyfikowane podłoże Eagle (D-MEM, DMEM) (1X), płynne (o wysokiej zawartości glukozy)</td> <td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina-200 mM (100X), płynny</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (1,000X), płynny</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hemacytometry kontrastowe Hausser</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% roztwór żelatyny</td><td>Milipor</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anty-Tra-1-81</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R& D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 koza anty-mysz</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1X bez wapnia i magnez</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Zestaw do odwrotnej transkrypcji</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>komornik</td> luneta <td>sekcyjna NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem sendai

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Kilka lat temu, wprowadzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapoczątkowało nową erę w biomedycynie. Potencjalne zastosowania ludzkich iPSC obejmują modelowanie patogenezy chorób genetycznych człowieka, autologiczną terapię komórkową po korekcji genów oraz spersonalizowane badania przesiewowe leków poprzez zapewnienie źródła komórek specyficznych dla pacjenta i istotnych dla objawów. Istnieje jednak kilka przeszkód do pokonania, takich jak wyeliminowanie pozostałej ekspresji transgenu czynnika przeprogramowującego po wytworzeniu ludzkich iPSC. Co ważniejsze, resztkowa ekspresja transgenu w niezróżnicowanych ludzkich iPSC może utrudniać prawidłowe różnicowanie i błędnie interpretować istotne dla choroby fenotypy in vitro. Z tego powodu opracowano ludzkie i/lub transgeniczne iPSC wolne od integracji i/lub transgenów przy użyciu kilku metod, takich jak adenowirus, system piggyBac, wektor minicircle, wektory episomalne, bezpośrednie dostarczanie białek i zsyntetyzowane mRNA. Jednak wydajność przeprogramowania przy użyciu metod bezintegracyjnych jest w większości przypadków dość niska.
Tutaj prezentujemy metodę izolowania ludzkich iPSC za pomocą systemu przeprogramowania opartego na wirusie Sendai (wirus RNA). Ta metoda przeprogramowania wykazuje spójne wyniki i wysoką wydajność w opłacalny sposób.

Zwykle zakażone fibroblasty nie wykazują żadnych zmian morfologicznych przez kilka dni po transdukcji wirusem Sendai, lecz pięć dni później zaczynają przybierać inne kształty (Rysunek 1). Jak przedstawiono na prawym panelu Rysunku 1, komórki nie mają już typowej morfologii fibroblastów. Mają okrągły kształt, a ich jądro jest większe od cytoplazmy. Nawet jeśli transdukcję przeprowadzono przy 80% konfluencji komórkowej, po rozpoczęciu przeprogramowania sprawiają one wrażenie mniej konfluen...

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wirusem Sendai. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i posiew komórek fibroblastów, które mają zostać przetransdukowane. Kolejnym krokiem zabiegu jest zakażenie komórek wirusem Sendai.Następnie zakażone komórki fibroblastów są przenoszone na świeże embrionalne komórki żywiące fibroblasty myszy. Ostatnim krokiem jest ręczne wybranie przeprogramowanego. Obecnie pluripotencjalne komórki macierzyste, ostatecznie przeprogramowanie komórek fibroblastów w PSC I, bez użycia genów trans, można wykazać za pomocą znakowania immunologicznego i R-T-P-C-R.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że zwiększa ona wydajność przeprogramowania bez pozostawania przy transporcie i w opłacalny sposób W przypadku tego protokołu należy mieć gotowe ludzkie fibroblasty hodowane w DMEM. Za pomocą FBS przenieś te komórki na 24-dołkowe płytki w celu eksperymentu, płytki komórek w sześciu szeregowych rozcieńczeniach, aby określić najlepszą gęstość do przyłączenia komórek. Każdy rząd płytki 24-dołkowej może pomieścić jedną serię komórek do rozcieńczania.W ten sposób na jednej płytce można przetestować cztery typy komórek, inkubować rozcieńczenie przez 24 godziny. Następnego dnia wybierz studnie na trzech poziomach konfluencji do transdukcji. Jeden na wysokim poziomie zbiegu od 80 do 90%, drugi przy około 60% konfluencji, a trzeci przy około 30% konfluencji na godzinę lub więcej przed transdukcją.Zastąp pożywkę 300 mikrolitrami świeżej pożywki fibroblastów do rozmrażania transdukcji. Jeden zestaw probówek z wirusem Sendai w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka sekund, a następnie zakończ. Rozmrażanie ich w temperaturze pokojowej.Odwirować rozmrożone wirusy w temperaturze 6 000 G przez 10 sekund i przechowywać je na lodzie w jednej mikroprobówce wirówkowej. Przygotuj mieszaninę wirusów obliczoną na podstawie liczby komórek, które mają zostać przetransdukowane. Szczegóły obliczeń można znaleźć w protokole tekstowym.Dobrze wymieszać wirusy, delikatnie pipetując. Teraz do najbardziej zagęszczonych komórek dodaj dwie objętości wirusa. Dodaj jedną objętość wirusa do komórek o średniej gęstości i dodaj połowę objętości wirusa do najmniej gęstego zaznaczenia.Zakręć płytką i pozwól jej inkubować przez noc, aby reakcja zaszła następnego dnia. Zastąp pożywkę 500 mikrolitrami świeżej pożywki fibroblastowej. Zrób to ponownie dwa dni później, trzy dni po drugiej zmianie pożywki dokonanej na transdukowanych komórkach.Przygotuj komórki metamfetaminy w 60-milimetrowych naczyniach z DMEM zawierającym 10% FBS, płytkę 500 000 komórek na naczynie i inkubuj je przez noc. Następnego dnia zastąp pożywkę na komórkach metamfetaminy świeżą pożywką, a następnie przystąp do ustawiania kokultury. Najpierw usuń pożywkę z transdukowanych fibroblastów i przemyj je raz DPBS.Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,25% trypsyny EDTA do każdej transdukowanej studzienki komórek w ciągu pięciu minut. Zbierz wszystkie odłączające komórki w jednej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki w temperaturze 1 350 G przez cztery minuty.Następnie usunąć supernatant i przemyć granulowane komórki około pięcioma mililitrami świeżej pożywki, aby zneutralizować trippin. Teraz zbierz komórki, obracając je przez kolejne cztery minuty przy 1 350 G.Następna płytka. Większość komórek to sześć seryjnych rozcieńczeń metamfetaminy.Pierwsze i ostatnie rozcieńczenie może nie być potrzebne w zależności od śmiertelności komórek. Zachowaj niektóre komórki do ekstrakcji RNA i inkubuj płytki przez noc. Następnego dnia zastąp pożywkę ludzkim podłożem ES uzupełnionym 10 mikromolami inhibitora kinazy RO Y 2 7 6 3 2.Aby poprawić przeżywalność komórek w ciągu następnych dni, zmień pożywkę na normalną pożywkę ludzką ES uzupełnioną unsu. Po tygodniu hodowli zacznij sprawdzać szalki co kilka dni pod kątem tworzenia się kolonii ES, takich jak grudki komórek. Gdy się pojawią, monitoruj wzrost.Trzy tygodnie po transdukcji kolonie grudek komórek ES powinny być gotowe do ekspansji. Przygotowałem komórki podające metamfetaminę na 24-dołkowych płytkach, tak jak były one przygotowane dla płytek 60-milimetrowych. Przed pobraniem jakichkolwiek kolonii zmień pożywkę na komórkach metamfetaminy na pożywkę ES z 10 mikrolitrami Y 2 7, 6, 3, 2.Wybieraj z naczyń jedną kolonię na raz. Przenieś kolonię do 15-mililitrowej probówki z tamtejszym roztworem. Rozdrobnij kolonię za pomocą pipetera.Potem przykryj jednego mnie. No cóż, z rozbitą kolonią. Ostatecznie załaduj każdą studnię jedną rozdrobnioną kolonią i załaduj jak najwięcej studni.Utrzymuj komórki za pomocą codziennych zmian pożywki i rozszerz je do sześciu płytek dołkowych, a następnie 60-milimetrowych szalek. Zazwyczaj fibroblasty zakażone wirusem Sendai nie wykazują żadnych zmian morfologicznych aż do pięciu dni. Następnie komórki przybierają okrągły kształt z większym jądrem i mniejszą cytoplazmą.Ten protokół na małą skalę obejmuje kilka parametrów, które można zoptymalizować, takich jak gęstość fibroblastów, miano wirusa i gęstość posiewu do mes. Można również zoptymalizować transdukcję komórek o różnej płynności pokazanej w różnych kolorach. Po tygodniu wspólnej hodowli z komórkami karmiącymi metamfetaminę, częściowo przeprogramowane fibroblasty mają luźny kształt przypominający kształt i są łatwe do zebrania, w przeciwieństwie do zbierania za pomocą trypsyny.W pełni przeprogramowane komórki komórkowe I są łatwo rozpoznawalne od częściowo przeprogramowanych komórek. W pełni przeprogramowane komórki są ciasno upakowane, a kolonie mogą mieć wyraźne granice. Częściowo przeprogramowane komórki tworzą luźne klastry, które można łatwo odczepić.Po namnażaniu klonów IPSC przez kilka tygodni, barwienie w poszukiwaniu markerów komórek macierzystych jest uzasadnione w porównaniu z komórkami H9. IPC są dodatnie dla kilku oczekiwanych przeciwciał, w tym SSEA cztery, OCT cztery, TRA 81 i nano G, co potwierdza ich pluripotencjalną jakość. Za pomocą R-T-P-C-R ekspresji transgenu nie stwierdzono u ludzkich klonów IPSC.Po 10 starterach dla egzogennego OCT cztery, SOX dwa, klf cztery i Cmic zastosowano z pozytywnymi próbkami kontrolnymi, które wykazały silne poziomy ekspresji transgenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprogramować komórki somatyczne, aby indukować polipotencjalne komórki macierzyste i jak je wybrać, całkowicie przeprogramować komórki z innych komórek.

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych wielopotężnych pochodzenia indukowanego z ludzkich komórek somatycznych za pomocą wirusa Sendai

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Poznaj metodę generowania ludzkich indukowanych komórek macierzystych z fibroblastów przy użyciu wirusa Sendai. Technika ta zapewnia wysoką wydajność reprogramowania bez integracji transgenów.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai (Wideo) | JoVE Journal

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Przeglądaj więcej filmów