Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Ogólnym celem tej procedury jest profilowanie poziomów ekspresji genów w poszczególnych ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją pojedynczej komórki lub R-T-P-C-R. Osiąga się to poprzez zastosowanie fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych w celu posortowania pojedynczych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej bufor do lizy komórek. Drugim krokiem jest odwrotna transkrypcja RNA w celu wygenerowania CDNA z lizatów jednokomórkowych.

Następnie CDNA jest amplifikowany w reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim krokiem jest wykonanie ilościowego R-T-P-C-R na amplifikowanym CDNA. Ostatecznie test ten jest przydatny do badania ekspresji genów w heterogenicznych populacjach, takich jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi pojedynczymi komórkami ilościowego sztucznego naczynia jest to, że ta metoda, EEG i bardziej niezawodne Przed oczyszczaniem faksu. Cztery ludzkie embrionalne komórki macierzyste EGFP lub Hess są odłączane od 60-milimetrowej szalki. Usuń całe podłoże, dodaj jeden mililitr Accutane i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Zneutralizuj Accutane za pomocą jednego mililitra ludzkiej wirówki ES w celu osadzenia komórek po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieszonych komórek w buforze faksowym i dostosuj stężenie do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie przepuść próbkę komórki przez rurkę z nasadką sitka o grubości 35 mikrometrów. Przechowuj probówkę na lodzie przed sortowaniem komórek.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mieszanki wzorcowej zawierającej jeden mikrolitr jednokomórkowego D Ns jeden i dziewięć mikrolitrów roztworu do lizy pojedynczych komórek. Dla każdego z nich, dobrze przenieść 10 mikrolitrów roztworu mieszającego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR do programu do analizy faksowej, sortownika komórek do sortowania pojedynczych komórek dodatnich EGFP do dołków 96-dołkowej płytki PCR po sortowaniu komórek, inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek. Aby zatrzymać reakcję lizy, dodaj jeden mikrolitr roztworu zatrzymującego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.

Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw dodaj do każdej studzienki 96-dołkowej płytki 0,5 mikrolitra Eloqua 20 mikromolowych starterów SMAT 15 i SMAA. Podgrzewać próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj cztery mikrolitry buforu pięć x, dwa mikrolitry naziemnej telewizji cyfrowej, jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy i jeden mikrolitr D i tps.

Do każdej studni wykonaj odwrotną transkrypcję w termocyklerze. Ustaw program termiczny na 42 stopnie Celsjusza na 90 minut, a następnie na 85 stopni Celsjusza na pięć minut. Aby dezaktywować odwrotną transkryptazę po zakończeniu odwrotnej transkrypcji, dodaj cztery mikrolitry odczynnika egzo do każdej próbki CDNA inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby trawić nadmiar oligonukleotydów, a następnie 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Aby dezaktywować odczynnik egzo, należy przygotować mieszaninę reakcyjną PCR z dwoma nanomolowcami startera SMAP dwa. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej PCR. Do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.

Wykonaj amplifikację składającą się z 20 cykli denaturacji, klękania i przedłużania po amplifikacji próbek przeprowadziłem dwa zestawy ilościowych reakcji R-T-P-C-R na oddzielnych płytkach w celu potwierdzenia wyników R-T-P-C-R do każdej studzienki z 2 96 płytek dołkowych dodać 10 mikrolitrów dwóch x cyber green. Mistrz PCR wymieszać jeden mikrolitr amplifikowanego CDNA, dwa startery i siedem mikrolitrów wody. Ustaw program na 95 stopni Celsjusza na trzy sekundy, a następnie 60 stopni Celsjusza na 30 sekund.

Przez 40 cykli krok klęczący jest usuwany, aby zmniejszyć błąd podkładu. Klęcząc w tym badaniu, mikrogramowe ilości całkowitego RNA Hessa rozcieńczono do poziomów nano i pikogramów, aby ocenić zmienność techniczną i wykrycie różnic na niskich ilościach całkowitego RNA ilościowe R-T-P-C-R genu G-A-P-D-H przeprowadzono za pomocą MR. NA zebranych łusek seryjnie rozcieńczanych od 10 nanogramów na mikrolitr do 0,1 pikograma na mikrolitr. Każda kropka pokazuje wartość CT seryjnie rozcieńczonego mRNA i mRNA pojedynczej komórki posortowanej faksem.

Zaobserwowano korelację między każdą próbką a wynikami QR TPCR z kilkoma pojedynczymi komórkami wykazującymi podobne wartości CT. Faks użyto do sortowania i wybierania silnych komórek EEG FP dodatnich z linii reporterowej OCT four EGFP HESC. Wyniki pokazują, że populacja z dodatnim wynikiem EGFP wynosi około 60% w porównaniu z populacją ujemną, aby potwierdzić spójność między różnymi partiami reakcji odwrotnej transkrypcji i amplifikacji.

Oczyszczone faksem lizaty jednokomórkowe podzielono na połowę, a protokół zastosowano do każdej połowy w celu porównania partii. Zaobserwowano istotną korelację między wartością czterech CT OCT dla każdej połowy lizatów jednokomórkowych. Prezentacja mapy cieplnej ekspresji pojedynczego genu łuski pokazuje spójny i solidny poziom ekspresji OCT four, ale różne poziomy innego genu markera komórek macierzystych, NAN og razem wzięte, nasze wyniki pokazują, że ten test ekspresji genów pojedynczej komórki jest przydatny do badania heterogeniczności populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo wykonać QITP dla transkryptomu pojedynczej komórki.