Name: Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę ilościowego RT-PCR dla pojedynczych komórek w celu profilowania ekspresji genów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Technika ta ujawnia heterogeniczność populacji i wspiera badania nad biologią komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lee za cenne dyskusje na temat rękopisu. Prace w laboratorium Lee były wspierane przez granty z Robertson Investigator Award New York Stem Cell Foundation oraz z Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Przygotowanie płytki 96-dołkowej
<ol>
	<li>Zmieszać 1 μl jednokomórkowej DNazy1 z 9 μl roztworu do lizy pojedynczych komórek.</li>
	<li>Umieścić 10 μl zmieszanego roztworu w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR.</li>
</ol>
2. Odłączanie hESC do oczyszczania FACS
<ol>
	<li>Odłączyć linię komórkową OCT4::EGFP ES od naczynia o średnicy 60 mm za pomocą 1 ml Accutase na 20 minut, w temperaturze 37 °C, które zostały zneutralizowane ludzkim podłożem ES.</li>
	<li>Przygotować populację komórek w 1 ml buforze FACS i dostosować komórkę do 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przepuść próbkę komórek przez rurkę z filtrem siatkowym o średnicy 35 μm.</li>
	<li>Przechowuj probówkę w lodzie przed sortowaniem komórek.</li>
</ol>
3. Liza pojedynczej komórki oczyszczonej metodą FACS w każdym dołku płytki 96-dołkowej
<ol>
	<li>Posortuj próbkę pod kątem komórek dodatnich pod kątem EGFP w sortowniku komórek z przeszkolonym operatorem. Umieść pojedynczą komórkę w roztworze lizy pojedynczej komórki/DNazy1 w 96-dołkowej płytce PCR. W razie potrzeby 96-dołkową płytkę z próbką można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C krócej niż jeden miesiąc.</li>
	<li>Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu zatrzymującego, aby zatrzymać reakcję lizy.</li>
	<li>Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Dodać do każdego z nich 0,5 μl podwielokrotności 20 μM SMA-T15, SMA-A.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 4 μl buforu 5X, 2 μl DTT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 1 μl dNTP.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję w termocyklerze.
	<ol>
		<li>Ustaw program termiczny na 42 °C × 90 min i dezaktywuj odwrotną transkryptazę na 85 °C × 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wzmocnienie
<ol>
	<li>Dodać 4 μl odczynnika ExoSAP-IT do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.
	<ol>
		<li>Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut i w temperaturze 80 °C przez 15 minut w celu dezaktywacji odczynnika ExoSAP-IT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR z SMA-p2 (2 nM)</li>
	<li>Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej PCR do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację, składającą się z 20 cykli denaturacji (94 °C przez 30 sekund), wyżarzania (57 °C przez 30 sekund) i przedłużania (68 °C przez 10 minut).</li>
</ol>
6. Wydajność qRT-PCR
<ol>
	<li>Do każdej studzienki dodaj 10 μl 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 μl amplifikowanego cDNA, 2 startery nM i 7 μl wody.
	<ol>
		<li>Ustaw program, a następnie 95 °C na 3 sekundy, 60 °C na 30 sekund x 40 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj w dwóch egzemplarzach w przypadku błędów technicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Profilowanie genów pojedynczych komórek może być głównym narzędziem do przewidywania funkcjonalności pojedynczej komórki lub całej populacji. Ze względu na ograniczenia techniczne, analiza profilowania całych genów została ograniczona do średnich populacji. Zaproponowano, aby różnice we wzorcach i poziomach ekspresji genów między poszczególnymi komórkami a subpopulacjami powodowały błędną interpretację. Tak zróżnicowane aspekty komórkowe można odnaleźć w hESC, a ich heterogeniczność powoduje subtelnie różną zdolność do u...

Większość wyższych populacji eukariontów jest niejednorodna, dlatego przy analizie populacji zbiorczej, często trudno jest zinterpretować ich cechy komórkowe. Poszczególne komórki w populacji mogą się subtelnie różnić, a różnice te mogą mieć ważne konsekwencje dla właściwości i funkcji całej populacji 1,2. Wiadomo zwłaszcza, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są niejednorodne, co powoduje różne poziomy pluripotencji i różne potencjały specyfikacji linii w delikatnie charakterystyczny sposób 3,4. Na przykład, różne antygeny powierzchniowe komórek mogą być używane do kategoryzacji niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, a grupa Austina Smitha zaproponowała różne poziomy pluripotencji w mysich embrionalnych komórkach macierzystych, w oparciu o ich morfologię, skłonność do różnicowania i zależność szlaku sygnałowego6. Hipotezę o zjawisku tym postawiono na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych7. Podczas gdy ogólne badania przeprowadzono na różnych liniach komórek macierzystych, a nie na pojedynczych komórkach macierzystych, bardzo intrygujące może być analizowanie różnych poziomów pluripotencji na poziomie pojedynczej komórki, co potencjalnie wpływa na ich zdolności różnicowania w kierunku wszystkich linii komórek somatycznych.
Heterogeniczność komórkowa i molekularna może być podyktowana profilowaniem transkrypcji, które nazywa się 'transkryptomem pojedynczej komórki' i kładzie nacisk na nowe podejścia do ilościowego określania poziomów ekspresji genów8-10. Do analizy poziomów ekspresji genów w poszczególnych komórkach opracowaliśmy prosty, ale solidny protokół ilościowego RT-PCR dla pojedynczych komórek. Potwierdziliśmy skuteczność i wykonalność naszego protokołu, porównując każdą połówkę lizatów pojedynczych komórek, a także seryjnie rozcieńczane całkowite RNA hESC, co skutkuje minimalnymi różnicami technicznymi i różnicami. Ponadto wykorzystaliśmy genetyczną linię reporterową do wyizolowania jednorodnej populacji hESC za pomocą systemu celowania genowego. Zastosowano wektor dawcy do celowania w locus OCT4 (konstrukt OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro) oraz parę plazmidów TALEN11. Wektor dawcy i parę plazmidów TALEN wprowadzono do hESC (H9, WA09) przy użyciu naszego protokołu nukleofekcji i selekcji klonalnej, a utrzymanie hESC przeprowadzono w oparciu o nasz rutynowy protokół12. Potwierdziliśmy, że ta genetyczna linia reporterowa wyraża EGFP dla ekspresji OCT4 w hESC OCT4::EGFP.
Nasz wynik pokazuje, że poszczególne hESC (posortowane według komórek OCT4::EGFP silnie dodatnie) mają wysoki poziom ekspresji OCT4, ale różne poziomy ekspresji NANOG. Tak więc nasz test ekspresji genów w pojedynczej komórce powinien być przydatny do badania heterogeniczności populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płytka do PCR</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do lizy komórek Ambion</td> Life <td>Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Odwrotna transkryptaza</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimeraza High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> FACS <td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu; l DNaza, filtr sterylizowany</td></tr><tr><td>35 i mu; m rurki z nakrętką sitową do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego rt-pcr

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeniczność populacji komórek macierzystych utrudnia szczegółowe zrozumienie biologii komórek macierzystych, takich jak ich skłonność do różnicowania się w kierunku różnych linii. Test transkryptomu pojedynczej komórki może być nowym podejściem do analizy indywidualnej zmienności. Opracowaliśmy metodę qRT-PCR dla pojedynczej komórki i potwierdziliśmy, że metoda ta działa dobrze w kilku profilach ekspresji genów. Na poziomie pojedynczej komórki, każda ludzka embrionalna komórka macierzysta, posortowana według komórek dodatnich OCT4::EGFP, ma wysoką ekspresję w OCT4, ale inny poziom ekspresji NANOG. Nasz test ekspresji genów w pojedynczej komórce powinien być przydatny do badania heterogeniczności populacji.

Wydajna i niezawodna amplifikacja RNA z pojedynczej komórki
Aby zminimalizować zmienność transkrypcyjną wśród hESC, do oczyszczania metodą FACS wykorzystano klon hESC OCT4::EGFP. Po posortowaniu komórek pozytywnych pod kątem OCT4::EGFP do płytki 96-dołkowej, każdą komórkę poddano lizie w buforze do lizy, a RNA poly(A)+ przekształcono w pełnowartościowy cDNA przy użyciu primera SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) oraz zakotwiczenia SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG) z...

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest profilowanie poziomów ekspresji genów w pojedynczych ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych z wykorzystaniem ilościowej reakcji polimerazy w łańcuch z odwrotną transkrypcją dla pojedynczych komórek, czyli R-T-P-C-R. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w celu posortowania pojedynczych komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej bufor do lizy komórek. Drugim krokiem jest odwrotna transkrypcja RNA w celu uzyskania cDNA z lizatów pojedynczych komórek.Następnie cDNA jest amplyfikowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie ilościowej RT-PCR na amplifikowanym cDNA. Ostatecznie badanie to jest przydatne do analizy ekspresji genów w heterogenicznych populacjach, takich jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi ilościowymi naczyniami sztucznymi dla pojedynczych komórek jest to, że metoda ta, EEG, jest bardziej stabilna przed oczyszczaniem frakcyjnym. W przypadku OCT dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych hESC wyrażających EGFP, komórki są odrywane z szalki 60 mm. Należy usunąć całą pożywkę, dodać 1 mL Accutane i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.Zneutralizuj Accutane za pomocą 1 mL pożywki ES dla ludzi, a następnie odwiruj próbkę, aby uzyskać pellet komórek. Po odlaniu nadsączu ponownie zawieś komórki w buforze FACS i dostosuj stężenie do 1×10⁶ komórek/mL. Następnie przepuść próbkę komórek przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 35 µm bezpośrednio do probówki. Przechowuj probówkę w lodzie do momentu sortowania komórek.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mieszaniny głównej (master mix) zawierającej 1 µL single cell D Ns one oraz 9 µL roztworu do lizy pojedynczych komórek. Do każdej studzienki płytki PCR 96-dołkowej przenieś 10 µL przygotowanej mieszaniny. Zaprogramuj sorter komórkowy tak, aby sortować pojedyncze komórki wykazujące pozytywną ekspresję EGFP do studzienek płytki PCR 96-dołkowej. Po zakończeniu sortowania inkubuj próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia lizy komórek. Aby zatrzymać reakcję lizy, dodaj 1 µL roztworu zatrzymującego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.Aby rozpocząć tę procedurę, należy najpierw dodać do każdej studzienki płytki 96-dołkowej 0,5 µL Eloqua zawierającego 20 µM starterów SMAT 15 i SMAA. Próbki należy podgrzewać w temperaturze 80 °C przez pięć minut. Następnie należy dodać 4 µL buforu 5x, 2 µL DTT, 1 µL odwrotnej transkryptazy oraz 1 µL dNTP.W każdym dołku przeprowadź odwrotną transkrypcję w termocyklerze. Ustaw program termiczny na 42 °C przez 90 minut, a następnie 85 °C przez pięć minut. Aby dezaktywować odwrotną transkryptazę po zakończeniu odwrotnej transkrypcji, dodaj cztery µL odczynnika exo do każdej próbki cDNA i inkubuj w 37 °C przez 15 minut w celu strawienia nadmiaru oligonukleotydów, a następnie w 80 °C przez 15 minut.Aby inaktywować odczynnik exo, przygotować mieszaninę reakcyjną PCR z 2 nM primera SMAP dwa. Dodać 10 µL mieszaniny reakcyjnej PCR do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.Przeprowadzić amplifikację składającą się z 20 cykli denaturacji, przyłączania i elongacji. Po amplifikacji próbek przeprowadzić dwa zestawy reakcji ilościowych R-T-P-C-R na oddzielnych płytkach w celu potwierdzenia wyników R-T-P-C-R. Do każdej studzienki dwóch płytek 96-dołkowych dodać 10 µL 2x Cyber Green PCR master mix, 1 µL amplifikowanego cDNA, dwa primery oraz 7 µL wody. Ustawić program na 95 °C przez 3 sekundy, a następnie na 60 °C przez 30 sekund.W celu zmniejszenia błędu startera zrezygnowano z etapu wyżarzania przez 40 cykli. W niniejszym badaniu mikrogramowe ilości całkowitego RNA z łupin zostały rozcieńczone do poziomów nanogramowych i pikogramowych, aby ocenić zmienność techniczną oraz możliwość wykrycia różnic przy niskich ilościach całkowitego RNA. Ilościową reakcję R-T-P-C-R dla genu G-A-P-D-H przeprowadzono z użyciem MR.NA z połączonych łupin, rozcieńczonych szeregowo od 10 nanogramów per mikrolitr do 0,1 pikograma per mikrolitr. Każdy punkt przedstawia wartość CT dla szeregowo rozcieńczonego mRNA oraz mRNA z pojedynczych komórek wyizolowanych za pomocą FACS.Zaobserwowano korelację między każdą próbką a wynikami QR TPCR, przy czym kilka pojedynczych komórek wykazało podobne wartości CT. Wykorzystano FACS do sortowania i wyboru silnie pozytywnych pod kątem EGFP komórek z linii HESC z reporterem EGFP OCT four. Wyniki wykazują populację pozytywną pod kątem EGFP na poziomie około 60% w porównaniu do populacji negatywnej, co potwierdza spójność pomiędzy różnymi partiami reakcji odwrotnej transkrypcji i amplifikacji.Oczyszczone lizaty pojedynczych komórek uzyskane metodą FACS podzielono na pół, a protokół zastosowano do każdej z części w celu przeprowadzenia porównań serii. Zaobserwowano istotną korelację między wartościami CT dla OCT four w każdej z części lizatów pojedynczych komórek. Prezentacja w formie mapy ciepła ekspresji genów w pojedynczych komórkach wykazuje spójny i wysoki poziom ekspresji OCT four, ale zróżnicowane poziomy innego genu markera komórek macierzystych, NAN og. Podsumowując, nasze wyniki wykazują, że ten test ekspresji genów w pojedynczych komórkach jest użyteczny do badania heterogeniczności populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak prawidłowo przeprowadzić procedurę QITP dla transkryptomu pojedynczych komórek.

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza pojedynczych ludzkich zarodkowych komórek macierzystych metodą RT-PCR ilościową

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Poznaj metodę ilościowego RT-PCR dla pojedynczych komórek w celu profilowania ekspresji genów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Technika ta ujawnia heterogeniczność populacji i wspiera badania nad biologią komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Przeglądaj więcej filmów