Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar twardej adhezji neutrofili za pomocą testu w komorze przepływowej, który pozwala na adhezję ludzkich neutrofili w obecności naprężeń ścinających. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie substratu z oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych lub powierzchni komórek śródbłonka, takiej jak ludzka żyła pępowinowa, komórki śródbłonka lub żyła. Drugim krokiem jest oddzielenie neutrofili od ludzkiej krwi obwodowej za pomocą dwuwarstwowej metody wirowania PHI zwanej wirowaniem.

Następnie komora przepływowa jest montowana, aby umożliwić wstrzyknięcie izolowanych ludzkich neutrofili pod wpływem naprężeń ścinających na podłoże adhezji, ligandów lub ve. Ostatnim krokiem jest zarejestrowanie zdarzeń adhezji neutrofili w komorze przepływowej, a następnie dokładne określenie ilościowe przyczepności twardej. Ostatecznie test w komorze przepływowej służy do wykazania silnej adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych i powierzchni HX.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologii, takie jak funkcjonalne znaczenie zmian genetycznych w cząsteczkach tkanki, o których wiadomo, że są związane z rozwojem autoimmunizacji. Badania genetyczne u pacjentów z opadaniem promienia rumienia tocznia układowego wykazały silny związek z wariantami i integryną Abeta two, białkiem zaangażowanym w mocną adhezję neutrofili. Opracowaliśmy ten system testów, aby ocenić funkcjonalne konsekwencje zmienności genetycznej w tym beta dwa endokrynologiczne o nazwie Mac jeden na mocnej przyczepności Aby przygotować naczynia hodowlane do użytku w komorze przepływowej.

Dodaj jeden mililitr roztworu fibryny i żelatyny do każdego 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej i kilkakrotnie pipetować, aby upewnić się, że cała powierzchnia płytki jest pokryta. Usuń nadmiar fibronektyny i roztworu żelatyny i wysusz płytki na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Aby zoptymalizować tworzenie macierzy białkowej, należy pobrać ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub qve, które zostały wyhodowane do 80 do 90% zbiegu, używając nasion trypsyny EDTA 500 000 komórek do każdej powlekanej płytki do hodowli tkankowej.

Dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej do każdej pożywki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 5% ogniwa CO2 powinny być codziennie sprawdzane wizualnie z wymianą podłoża co dwa dni. Pozwól komórkom rosnąć do 80 do 90% konfluencji.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj markera lub długopisu, aby narysować okrąg o średnicy 0,5 centymetra na środku 35-milimetrowej płytki do hodowli tkankowej. 20 mikrolitrów 20 mikrogramów na mililitr białka, roztwór w zaznaczonym obszarze. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić białko, roztwór pokryje cały obszar w okręgu o średnicy 0,5 centymetra.

Ważne jest, aby nie dotykać ani nie drapać powierzchni naczynia. Inkubować szalki z kultur tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj każde białko na pokrytej płytce trzy razy jednym mililitrem PBS.

Po wyjęciu PBS z trzeciej płytki myjącej, 50 mikrolitrów 1%BSA w zaznaczonym obszarze, aby zablokować niespecyficzne wiązanie na płytce. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach.

Umyj zablokowaną płytkę trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Przygotuj roztwory ligandów chimerycznych receptora adhezji FC do powlekania, a w tym eksperymencie i ICAM zostanie użyty jeden FC Kyra w dawce 25 mikrogramów na mililitr i selektyna P FC Kyra w dawce 0,5 mikrograma na mililitr. Pokryj zaznaczony obszar 50 mikrolitrami substratu, inkubuj szalki z kultur tkankowych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Naczynia należy zużyć w ciągu dwóch dni, a pokryty obszar nie powinien wyschnąć. W razie potrzeby. Dodaj PBS, aby utrzymać 50 mikrolitrów roztworu na płytce.

Neutrofile w tym badaniu są izolowane z krwi uczestników, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę. Po pobraniu krwi przez flebotomię do probówki do pobierania krwi przeciwzakrzepowej lub vacutainera, rozcieńczyć krew jeden do jednego za pomocą PBS i wykonać wszystkie kroki tej procedury. W temperaturze pokojowej przygotuj dwuwarstwowe wezwanie do oddzielania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej lub p BMC i neutrofili w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych.

Najpierw dodaj 15 mililitrów ciężkiego połączenia PHI, a następnie ostrożnie ułóż 10 mililitrów lekkiego połączenia fi na ciężkim wywołaniu fi. Powinna istnieć wyraźna granica między warstwami lekkiego połączenia fi a ciężkiego połączenia fi. Na koniec ostrożnie ułóż 25 mililitrów rozcieńczonej próbki krwi na wierzchu światła fi call, nie naruszając PHI.

Zadzwoń do warstwy wirującej probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej po odwirowaniu, powinno być obecnych wiele warstw. Warstwa neutrofili z niewielką liczbą czerwonych krwinek znajduje się między lekkim a ciężkim phi. Zadzwoń za pomocą pipety transferowej i przenieś warstwę neutrofili do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i dodaj PBS do końcowej objętości 50 mililitrów.

Wirować 225 razy G przez 10 minut. W temperaturze pokojowej po odwirowaniu nadal mogą znajdować się czerwone krwinki zmieszane z neutrofilami. Odessać supernatant do 10 mililitrów.

Marek Resus. Zawiesić na krótko osad czerwonych krwinek obojętnochłonnych, wirując z małą prędkością, a następnie ponownie przemyć 50 mililitrami PBS odessać supernatant w celu usunięcia zanieczyszczających czerwonych krwinek. Zawiesić granulowane komórki w pozostałym PBS za pomocą krótkiego wiru o niskiej prędkości.

Dodaj 25 mililitrów wody i delikatnie wiruj przez 10 sekund. Na. Czerwone krwinki dodają 25 mililitrów 1,8% chlorku sodu i natychmiast mieszają przez odwirowanie w temperaturze 225 razy G przez 10 minut.

Zanieczyszczające czerwone krwinki powinny teraz zostać unieruchomione, pozostawiając białą osadkę komórek neutrofilowych. Przemyć osad komórek obojętnochłonnych PBS, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane neutrofile w pożywce RPMI z 10% FBS. Po określeniu stężenia komórek pod mikroskopem świetlnym za pomocą hemocytometru, dostosuj gęstość komórek do 500 000 komórek na mililitr za pomocą kompletnego podłoża RPMI 10% FBS.

Przed rozpoczęciem testu adhezyjnego w komorze przepływowej należy napełnić VE 20 nanogramami na mililitr ludzkiego TNF alfa przez cztery do sześciu godzin, aby zwiększyć i stymulować ekspresję cząsteczki adhezyjnej. Gdy VE są gotowe, zmontuj komorę przepływową. Umieść 35-milimetrową miskę zawierającą zlewający się VE na stole mikroskopowym.

Na potrzeby tego filmu zbadana zostanie tylko adhezja neutrofili do VE, ale ta sama procedura dotyczy badania adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych, które łączą równoległą komorę przepływową z płytką z pompą strzykawkową i systemem próżniowym i pozostawiają jedną linię otwartą dla wejścia neutrofili. Włóż komorę przepływową na górę płyty i zamocuj zespół komory przepływu. Uruchom program do nagrywania wideo na komputerze podłączonym do mikroskopu.

Dostosuj pole i ostrość mikroskopu, aż widoczne będzie czyste pole z w pełni rozwiniętym VE. Za pomocą pompy strzykawkowej przepłukać komorę przepływową medium RPMI. Upewnij się, że w komorze lub przewodzie wejściowym neutrofili nie ma pęcherzyków powietrza.

Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknąć neutrofile do komory przepływowej z określoną prędkością. Nagraj wideo Ponieważ adhezja neutrofili może wystąpić szybko, zwykle wystarcza cztery do pięciu minut filmu, aby określić ilościowo zdarzenia adhezji do analizy. Ten klip wideo pokazuje przykład wiązania neutrofili z komorą przepływową pokrytą HU E.

Komórka przylegająca jest definiowana jako komórka, która porusza się o mniej niż jedną średnicę komórki w ciągu pięciu sekund. Na powierzchni pokrytej HU e. Pokazano tutaj zrzuty ekranu w różnych punktach czasowych z przykładowych filmów przedstawiających neutrofile przylegające do powierzchni pokrytej selektorem ICAM One P lub powierzchni pokrytej uve.

W obu eksperymentach prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 mikrolitrów na minutę przy gęstości neutrofili 500 000 komórek na mililitr. W typowych warunkach zaobserwowano, że od 50 do 70 ludzkich neutrofili mocno przylegało do powierzchni pokrytej ligandem lub VE podczas czterominutowego okresu rejestracji. Jednak alleliczne warianty cząsteczek adhezyjnych neutrofili lub warianty alleli w podłożu mogą znacząco zmienić ilościową adhezję neutrofili poprzez nagrywanie filmów o podobnej długości z różnymi dawcami.

Neutrofile, liczbę komórek przylegających na minutę można obliczyć w celu porównania właściwości adhezyjnych między różnymi dawcami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wizualnym sprawdzeniu neutrofili pod kątem zaciśnięcia komórek spowodowanego aktywacją komórek wywołaną izolacją. Ponadto można przeprowadzić ocenę aktywacji komórek metodą cytometrii przepływu równoległego, aby upewnić się, że stan aktywacji komórek jest dopasowany między dawcami i między eksperymentami.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się autoimmunizacją do zbadania adhezji komórek w pierwotnych komórkach ludzkich pochodzących od dawców genotypu, którzy mają różne allele regionu kodującego łańcucha B CD 11 integryny beta dw, MAC jeden. Badania te pozwoliły na staranną i ilościową ocenę funkcjonalnego wpływu tych wariantów alleli na organizm człowieka.