Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar silnej adhezji neutrofili z wykorzystaniem testu w komorze przepływowej, który umożliwia badanie adhezji ludzkich neutrofili w warunkach naprężenia ścinającego. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie podłoża z oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych lub powierzchni komórek śródbłonka, takich jak ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC). Drugim krokiem jest oddzielenie neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu dwuwarstwowej metody wirowania z gradientem gęstości (Ficoll).

Następnie składa się komorę przepływową, aby umożliwić wstrzyknięcie wyizolowanych ludzkich neutrofili pod wpływem naprężenia ścinającego na podłoże zawierające cząsteczki adhezyjne, ligandy lub ve. Ostatnim krokiem jest rejestracja zdarzeń adhezji neutrofili w komorze przepływowej, a następnie dokładna kwantyfikacja silnej adhezji. W końcowym rozrachunku test w komorze przepływowej służy do wykazania silnej adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych oraz powierzchni HX.

Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologii, takie jak funkcjonalne znaczenie wariacji genetycznych w cząsteczkach tkankowych, o których wiadomo, że są związane z rozwojem autoimmunizacji. Badania genetyczne u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym wykazały silny związek z wariantami integryny beta 2, białka zaangażowanego w trwałą adhezję neutrofili. Opracowaliśmy ten system analizy w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji zmienności genetycznej w tej integrynie beta 2, nazywanej Mac-1, w odniesieniu do trwałej adhezji. W celu przygotowania naczyń hodowlanych do użycia w komorze przepływowej.

Do każdej 35 mm szalki hodowlanej dodaj jeden mililitr roztworu fibryny i żelatyny, a następnie pipetuj kilka razy, aby upewnić się, że cała powierzchnia szalki została pokryta. Usuń nadmiar roztworu fibronektyny i żelatyny, a szalki pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Aby zoptymalizować tworzenie macierzy białkowej, pobierz ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub qve, które zostały wyhodowane do 80-90% konfluencji, używając trypsyny EDTA, a następnie wysiej 500 000 komórek do każdej pokrytej szalki hodowlanej.

Do każdej szalki dodać 2 mL pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Stan komórek należy kontrolować codziennie pod kątem wizualnym, wymieniając pożywkę co dwa dni. Pozostawić komórki do czasu osiągnięcia 80 do 90% konfluencji.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy za pomocą markera lub pisaka narysować okrąg o średnicy 0,5 centymetra w centrum 35 milimetrowej szalki do hodowli tkankowej. W zaznaczonym obszarze należy nanieść 20 mikrolitrów roztworu białka A o stężeniu 20 mikrogramów na mililitr. Za pomocą końcówki pipety należy rozprowadzić roztwór białka A tak, aby pokrył cały obszar wewnątrz okręgu o średnicy 0,5 centymetra.

Ważne jest, aby nie dotykać ani nie zarysować powierzchni szalki. Inkubować szalki do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie każdą płytkę pokrytą białkiem przemyć trzykrotnie 1 mL PBS.

Po usunięciu PBS z trzeciej płytki płuczącej, nanieś 50 µL 1% BSA w zaznaczonym obszarze, aby zablokować nieswoiste wiązania na płytce. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach.

Zablokowaną płytkę przemyj trzy razy 1 ml PBS. Przygotuj roztwory chimerycznych białek ligandów receptora adhezyjnego FC do powlekania i do tego eksperymentu; zostaną użyte ICAM-1 FC Kyra w stężeniu 25 µg/ml oraz P-selektyna FC Kyra w stężeniu 0,5 µg/ml. Naniesienie na zaznaczone pole 50 µl substratu, a następnie inkubuj naczynia hodowlane przez noc w temperaturze 4 °C.

Szalki należy wykorzystać w ciągu dwóch dni, nie dopuszczając do wyschnięcia obszaru pokrytego reagentem. W razie potrzeby należy dodać PBS, aby utrzymać 50 µL roztworu na płytce.

Neutrofile do niniejszego badania są izolowane z krwi uczestników, którzy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Po pobraniu krwi drogą wenopunkcji do probówki z antykoagulantem lub probówki typu vacutainer, rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 w PBS i przeprowadzić wszystkie etapy niniejszej procedury. W temperaturze pokojowej przygotować w 50 ml probówkach wirówkowych dwuwarstwową warstwę gęstościową do rozdzielania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) i neutrofili.

Najpierw należy dodać 15 ml ciężkiego PHI call, a następnie ostrożnie nanieść 10 ml lekkiego fi call na warstwę ciężkiego fi call. Między warstwą lekkiego fi call a ciężkiego fi call powinna powstać wyraźna granica. Na koniec należy ostrożnie nanieść 25 ml rozcieńczonej próbki krwi na wierzch lekkiego fi call, uważając, aby nie zaburzyć warstwy PHI.

Wiruj probówki w wirówce do rozwarstwiania przez 30 minut w temperaturze pokojowej; po wirowaniu powinny być widoczne liczne warstwy. Warstwa neutrofili z niewielką ilością erytrocytów znajduje się pomiędzy fazą lekką a ciężką. Pobierz warstwę neutrofili za pomocą pipety transferowej, przenieś ją do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj PBS do uzyskania objętości końcowej 50 ml.

Wiruj z prędkością 225 ×g przez 10 minut. W temperaturze pokojowej po wirowaniu w neutrofilach mogą wciąż znajdować się zmieszane erytrocyty. Odciągnij nadsącz do poziomu 10 ml.

Resuspensja. Zawiesinę osadu neutrofili i erytrocytów rozdrobnić poprzez krótkie mieszanie w wstrząsaczu wirowym (vortex) z niską prędkością, a następnie ponownie przemyć 50 mililitrami PBS i odessać nadsącz, aby usunąć zanieczyszczające erytrocyty. Osadzone komórki resuspenderować w pozostałym PBS, krótko mieszając w vortexie z niską prędkością.

Dodać 25 ml wody i delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex przez 10 sekund. Do lizatu erytrocytów dodać 25 ml 1,8% chlorku sodu i natychmiast wymieszać poprzez wirowanie przy 225 ×g przez 10 minut.

Zanieczyszczające krwinki czerwone należy teraz poddać lizie, aby uzyskać osad białych neutrofili. Osad neutrofili należy przemyć PBS, odrzucić nadsącz i ponownie zawiesić wyizolowane neutrofile w medium RPMI z 10% FBS. Po oznaczeniu stężenia komórek pod mikroskopem świetlnym przy użyciu hemocytometru, należy dostosować gęstość komórek do poziomu 500 000 cells per milliliter za pomocą kompletnego medium RPMI 10% FBS.

Przed rozpoczęciem testu adhezji w komorze przepływowej należy poddać VE primowaniu za pomocą 20 ng/ml ludzkiego TNF alpha przez cztery do sześciu godzin, aby upregulować i stymulować ekspresję cząsteczek adhezyjnych. Po przygotowaniu VE należy złożyć komorę przepływową. Płytkę 35 mm zawierającą konfluentne VE należy umieścić na stole mikroskopu.

Na potrzeby tego filmu badana będzie wyłącznie adhezja neutrofili do VE, jednak ta sama procedura ma zastosowanie do badania adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych; należy połączyć komorę przepływową z równoległymi płytkami z pompą strzykawkową i systemem próżniowym, pozostawiając jedną linię otwartą dla dopływu neutrofili. Umieść komorę przepływową na górnej części płytki i zamocuj zespół komory przepływowej. Uruchom program do nagrywania wideo na komputerze podłączonym do mikroskopu.

Dostosuj pole widzenia i ostrość mikroskopu, aż widoczne będzie wyraźne pole z w pełni wyrośniętym VE. Używając pompy strzykawkowej, przepłucz komorę przepływową medium RPMI. Upewnij się, że w komorze lub w linii doprowadzającej neutrofile nie ma pęcherzyków powietrza.

Użyj pompy strzykawkowej, aby wstrzyknąć neutrofile do komory przepływowej z określoną prędkością. Nagraj wideo, ponieważ adhezja neutrofili może nastąpić szybko; zazwyczaj wystarczy nagranie trwające od czterech do pięciu minut, aby ilościowo określić zdarzenia adhezyjne do analizy. Ten fragment wideo pokazuje przykład wiązania neutrofili do komory przepływowej pokrytej HU E.

Komórkę adherentną definiuje się jako komórkę, która w ciągu pięciu sekund przemieszcza się o odległość mniejszą niż jedna średnica komórki na powierzchni powlekanej HU e. Przedstawiono tutaj zrzuty ekranu z różnych punktów czasowych z przykładowych filmów przedstawiających neutrofile przylegające do powierzchni powlekanej ICAM 1 i P-selektyną lub powierzchni powlekanej uve.

W obu eksperymentach prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 µL/min przy gęstości neutrofili wynoszącej 500 000 komórek/mL. W typowych warunkach zaobserwowano, że od 50 do 70 ludzkich neutrofili trwale przylgnęło do powierzchni pokrytej ligandem lub VE w ciągu czterominutowego okresu rejestracji. Jednakże warianty alleliczne cząsteczek adhezyjnych neutrofili lub warianty alleliczne w podłożu mogłyby znacząco zmienić ilościową adhezję neutrofili, co można zaobserwować, rejestrując filmy o podobnej długości z materiałem pochodzącym od różnych dawców.

W przypadku neutrofili liczbę komórek przylegających na minutę można obliczyć, aby porównać właściwości adhezyjne u różnych dawców. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wizualnie sprawdzić, czy nie występuje agregacja neutrofili spowodowana aktywacją komórek indukowaną procesem izolacji. Ponadto można przeprowadzić równoległą ocenę aktywacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że stan aktywacji komórek jest spójny pomiędzy dawcami oraz pomiędzy poszczególnymi eksperymentami.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny autoimmunologii do analizy adhezji komórkowej w pierwotnych komórkach ludzkich pochodzących od dawców o różnych allelach regionu kodującego łańcucha CD 11 B integryny beta dwa, MAC one. Badania te pozwoliły na dokładną i ilościową ocenę wpływu funkcjonalnego tych wariantów allelicznych w organizmie człowieka.