Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Wrodzona obrona przed infekcjami wirusowymi jest wyzwalana przez receptory rozpoznawania wzorców lub prrs. Obecny w komórkach wrodzonego układu odpornościowego podczas infekcji. Cytoplazmatyczne oko PRRS i PKR wiążą się z sygnaturą wirusa, RNA potwierdzają zmianę wszystkich oczu liga i aktywują sygnalizację przeciwwirusową w celu monitorowania oka platformy i zmian potwierdzających PKR oraz wszystkie więzadła in vitro ludzkie komórki A 5 49 są zakażone wirusem gorączki Rift Valley.

Klon 13, aby stymulować aktywację PRR. Lizaty komórkowe komórek kontrolnych i zakażonych są następnie przygotowywane do analizy pod kątem zmian potwierdzających oko i PKR. Przeprowadza się ograniczone trawienie próbne.

Jeśli wystąpiły potwierdzające zmiany w strukturze białka, białko jest bardziej odporne na trawienie, a prążki zostaną wyświetlone za pomocą analizy Western blot w celu analizy pod kątem tworzenia natywnej strony allgas, a następnie przeprowadza się analizę western blot. Jeśli cała więzadło wystąpiła wyżej, widoczne są wszystkie kompleksy liga rig eye i PKR. Główną zaletą ograniczonego trawienia proteazy i natywnej strony jest to, że techniki te ułatwiają bezpośredni pomiar aktywacji regi i PKR.

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności wrodzonej, takie jak dokładna natura i pochodzenie gatunków RNA istotnych dla aktywacji mechanicznego oka i PKR. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat agonistów i agonistów receptora PKR. Można je również zastosować do innych białek czujników cytoplazmatycznych, takich jak MDA pięć, co pokazuje, że procedura zostanie Mila Viva, doktorantka z mojego laboratorium Przed rozpoczęciem tej procedury.

Należy pamiętać, że klon wirusa gorączki doliny Rift 13, określany dalej jako CL 13, jest atenuowanym mutantem wirusa, który w Niemczech musi być traktowany w dwóch warunkach BSL w celu wstępnego podgrzania pożywki wolnej od surowicy PBS i pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 5% FCS. Umieść je w łaźni wodnej w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Przygotować 1,25 razy 10 do siódmego PFU na mililitr CL 13 w pożywce wolnej od surowicy, aby zainfekować 2,5 razy 10 do szóstego.

5 49 komórek z wielokrotnością infekcji lub MOI wynoszącym pięć przygotowuje około 10% więcej niż jest to potrzebne, aby uwzględnić błędy pipetowania. Usunąć komórki A 5 49 z inkubatora, odessać pożywkę i dodać 10 mililitrów PBS, zawirować lub przechylić kolbę hodowlaną w celu umycia komórek, a następnie usunąć PBS. Następnie dodać jeden mililitr rozcieńczonego CL 13 lub dla niezakażonej kontroli lub pozorowanej infekcji.

Dodaj jeden mililitr wolnej pożywki w surowicy i inkubuj przez godzinę co 15 minut. Ostrożnie przechylić kolbę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie pożywki. Po godzinie od zakażenia usuń szczepionkę.

Dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych z 5% FCS i inkubuj przez pięć godzin. Przygotuj PBS z 0,5% trittonem X 100 i umieść go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie należy dodawać syryjskich inhibitorów proteazy.

Następnie umyj komórki zimnym PBS i dodaj 10 mililitrów świeżego PBS. Następnie za pomocą skrobaka do komórek odłącz komórki od naczynia. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj przy 800 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 30 mikrolitrach PBS z 0,5% Triton X 100. Przenieś lizat do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj przez co najmniej 10 minut na lodzie. Odwirować lizat w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu przenieść oczyszczony lizat komórkowy do świeżej probówki. Wykonać test Bradforda w celu określenia stężenia białka w oczyszczonym lizacie komórkowym Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast przystąpić do próby trawienia lub natywnej strony do oznaczenia potwierdzających zmian receptorów rozpoznawania wzorców, najpierw rozcieńczyć L jeden tosto chloro, ketonem metylowym lub trypsyną TPCK w PBS do końcowego stężenia roboczego dwóch mikrogramów na mililitr w dwóch nowych probówkach dla każdego stanu, dostosować końcowe stężenie białka w CL 13 i niezakażonych lizatach białka kontrolnego do 25 mikrogramów w końcowej objętości dziewięciu mikrolitrów za pomocą PBS, jeden zestaw lizatów zostanie użyty jako kontrola wejściowa, a drugi zostanie potraktowany trypsyną TPCK do nietraktowanych probówek kontrolnych. Dodaj jeden mikrolitr PBS do pozostałych dwóch probówek.

Dodaj jeden mikrolitr dwóch mikrogramów na mikrolitr trypsyny TPCK, aby doprowadzić końcowe stężenie do 0,2 mikrograma na mikrolitr. Wymieszać reakcje przez pipetowanie. Inkubuj lizaty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut.

Zatrzymać reakcję, dodając pięć razy denaturujący bufor próbki, a następnie gotować przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Ważne jest, aby nie wydłużać czasu inkubacji trypsyny. Należy pamiętać, że dokładny czas trawienia trypsyny ma kluczowe znaczenie dla wykrycia opornych fragmentów bez żadnego tła, jeśli nie zostaną wykryte oporne białka lub jeśli wykryto zbyt wiele, należy dostosować czas trawienia. Odpowiednio.

Po ugotowaniu należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub obciążyć je dwoma docal siarczanem sodu. Żele poliakrylamidowe składające się z 5% żelu układającego się w stos na żelu rozdzielczym 12%. Oddziel białka po 25 miliamperach na żel, aż skończy się błękit bromofenolowy.

Po uruchomieniu żeli przenieś białka z jednego żelu do membrany z fluorku poli winorośli i przeanalizuj za pomocą western blot z przeciwciałami skierowanymi przeciwko oku rig i PKR wybarwić drugi żel z kumasi brilliant blue G dwa 50. Następnie przechowuj żel w 25% etanolu, 8% kwasie octowym i 4% glicerolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przystąp do wykonywania obrazowania i analizy. Aby przeanalizować oligomeryczne stany receptorów rozpoznawania wzorców, przygotuj 50 mikrogramów lizatu komórkowego w końcowej objętości 10 mikrolitrów z PBS i dodaj pięć x bufor próbki do końcowego stężenia jednego x.

Natychmiast załaduj próbki na natywny żel poliakryloamidowy z 5% żelem do układania w stosy i 8% żelem rozdzielczym. Każde opóźnienie będzie skutkowało utratą natywnych kompleksów. Uruchom żel z prędkością 20 miliamperów na żel w czterech stopniach Celsjusza.

Przerwać elektroforezę 45 minut po opuszczeniu żelu przez niebieską opaskę Bromo-fenolu po łącznym około 1,5 do dwóch godzinach na wykonanie Western blot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko oku i PKR, jak opisano w dokumencie towarzyszącym w celu przeprowadzenia testu na potwierdzenie zamiany i oligo indukowanego przez rozpoznanie agonisty wirusa przez oko lub ograniczone trawienie proteazy PKR i natywną stronę przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie, Trawienie trypsyny z pozorowanych zakażonych lizatów komórkowych spowodowało szybką degradację oka Rig, podczas gdy zakażenie klonem 13 doprowadziło do wytworzenia odpornego na 30 kilodaltonów fragmentu oka Rig. PKR wykazuje również częściową oporność na trawienie trypinyną w zakażonych próbkach, co zbiega się z jego fosforylacją w celu monitorowania wydajności i swoistości żeli do wytrawiania trypsyny zostały wybarwione błękitem brylantowym kumasi G dwa 50. Próbki niepoddane działaniu substancji wykazują równe ilości załadowanych białek, poddanie próbnym i lizatom komórek C 13 trawieniu trypsyny prowadzi do porównywalnego spadku globalnych ilości białka.

Pokazuje to, że leczenie trypsyną ma taką samą skuteczność w przypadku próbek pozorowanych i zakażonych CL 13 w komórkach niezakażonych. Tylko monomery R EYE i PKR zostały wykryte jako dodatkowa kontrola. Uwzględniono czynnik transkrypcyjny IRF trzy, który jest obecny jako monomer, ale wiadomo, że dimeryzuje po aktywacji przez R Eye.

Zakażenie klonem 13 prowadzi do silnej akumulacji kompleksów oligomerycznych oka w postaci rozmazu oraz trzech dimerów lub oligomerów PKR i IRF jako zdefiniowanego prążka białkowego. Wyniki te pokazują, że ograniczone podróże w trawieniu i natywnej stronie są użytecznymi narzędziami do monitorowania zmian potwierdzających i tworzenia oligonukleoty oka i PKR po zakażeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować przełączanie i izację potwierdzenia WIC eye i PKR po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch dni po tej procedurze. Jako metody takie jak pro, testy mogą być wykonywane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy po jego rozwoju istnieje stabilna interakcja z ligandem stymulującym. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odpornością wrodzoną do zbadania stanu aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców w komórkach stymulowanych wirusem.