Name: Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj metodę monitorowania aktywacji receptorów RIG-I i PKR poprzez ograniczone trawienie proteazą i natywne PAGE. Technika ta pozwala badać zmiany konformacyjne i oligomeryzację receptorów rozpoznawania wzorców podczas infekcji wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alejandro Brunowi z CISA-INIA za dostarczenie surowicy wirusa przeciw gorączce doliny Rift. Praca w naszych laboratoriach jest wspierana przez klejnot Forschungsförderung. §2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Leibniz Graduate School for Emerging Viral Diseases (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 oraz DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Wysiewanie komórek A549 w celu infekcji
<ol>
	<li>Hodować kolbę T75 z komórkami A549 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce do hodowli komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutaminy, 50 000 U/l penicyliny i 50 mg / l streptomycyny).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem pobierania komórek należy rozgrzać pożywkę do hodowli komórkowych, PBS i 0,05% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i przemyć komórki 10 ml PBS. Ponownie wyjmij PBS.</li>
	<li>Dodać 3 ml trypsyny-EDTA i równomiernie rozprowadzić w kolbie. Przenieść kolbę do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po odłączeniu wszystkich komórek dodać 7 ml pożywki do hodowli komórkowych, ponownie zawiesić komórki i przenieść zawiesinę komórkową do 15 ml probówki Falcon.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki do hodowli świeżych komórek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej.</li>
	<li>Dodać 2,5 x 106 komórek w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych w dwóch kolbach T25 każda. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Jedna kolba służy do symulowanej kontroli, a druga do zakażenia Cl 13.</li>
</ol>
2. Zakażenie wirusem gorączki doliny Rift Fever Klon 13 (Cl 13)
<ol>
	<li>UWAGA: Cl 13 jest atenuowanym mutantem wirusa, który w Niemczech może być przetwarzany w warunkach BSL-2. Proszę zapoznać się z odpowiednimi wytycznymi krajowymi. Innymi typowymi induktorami IFN są wirus Sendai (szczep Cantell) lub wirus rzekomego pomoru drobiu.</li>
	<li>Wstępnie podgrzany PBS, pożywka bez surowicy i pożywka do hodowli komórkowych zawierająca 5% FCS.</li>
	<li>Przygotować 1,25 x 107 PFU/ml Cl 13 w podłożu bez surowicy, aby zainfekować 2,5 x 106 komórek A549 o wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5. Przygotuj nieco (około 10%) większą ilość niż potrzeba, aby uwzględnić błędy pipet.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS zgodnie z opisem w ppkt 1.3.</li>
	<li>Dodać 1 ml rozcieńczenia Cl 13 lub pożywki bez surowicy (niezakażona kontrola, makieta) do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ostrożnie przesuwać kolbę co 15 minut, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie odpowiednio rozcieńczenia Cl 13 i podłoża wolnego od surowicy.</li>
	<li>Po 1 godzinie zakażenia usunąć inokula, dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych z 5% FCS i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie lizatów komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować PBS / 0,5% Triton X-100 w temperaturze 4 °C. Nie należy dodawać inhibitorów proteazy seryny.</li>
	<li>Umyj komórki zimnym PBS i dodaj 10 ml świeżego PBS.</li>
	<li>Zeskrobać komórki, przenieść zawiesinę komórek do probówki sokoła i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 μl PBS / 0,5% Triton X-100. Przenieść lizat do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować lizat o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść oczyszczony lizat komórkowy (supernatant) do świeżej probówki.</li>
	<li>Określić stężenie białka za pomocą testu Bradforda, jak opisano w innym miejscu33.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do trawienia trypsyny (4.1) lub natywnej PAGE (5.1).</li>
</ol>
4. Określanie zmian konformacyjnych receptorów rozpoznawania wzorców
<ol>
	<li>Leczenie lizatów komórkowych trypsyną TPCK
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć trypsynę L-1-tozyloamido-2-fenyloetylochlorometylową (TPCK) w PBS do końcowego stężenia roboczego 2 μg/μl.</li>
		<li>Dostosować w dwóch nowych probówkach końcowe stężenie białka wynoszące 25 μg każdego lizatu białkowego (makieta lub Cl 13) w końcowej objętości 9 μl za pomocą PBS. W związku z tym powinny to być cztery probówki z 25 μg lizatu każda, dwa razy pozorowane i dwa razy zakażenie Cl 13. Jeden zestaw jako kontrola wejściowa (nieleczona) i jeden zestaw do leczenia trypsyną TPCK.</li>
		<li>Dodać 1 μl PBS (niepoddanego obróbce) lub 1 μl 2 μg/μl TPCK-trypsyny (stężenie końcowe: 0,2 μg/μl) do lizatów komórkowych i wymieszać reakcje przez pipetowanie. NIE zamrażaj i nie rozmrażaj porcji trypsyny TPCK, ponieważ wpłynie to negatywnie na efektywność trawienia.</li>
		<li>Inkubować lizaty w temperaturze 37 °C przez 25 minut. Zatrzymać reakcję, dodając 5x denaturujący bufor próbki (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol, 25% β-merkaptoetanol, 0,5% błękitu bromfenolowego) i gotowanie przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Ważne jest, aby NIE przedłużać czasu inkubacji trypsyny. W przypadku, gdy nie są wykrywalne żadne fragmenty odporne na proteazy, czas trawienia trypsyny musi zostać skrócony.</li>
		<li>Po ugotowaniu próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE) i Western Blotting
	<ol>
		<li>Załadować próbki na żel poliakryloamidowy z dodecylosiarczanu sodu (SDS) zawierający 5% stos na żelu o rozdzielczości 12%. Oddziel białka w ilości 25 mA na żel, aż skończy się błękit bromfenolowy.</li>
		<li>Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) na 30 sekund metanolem i umieść ją w buforze transferowym (48 mM Tris, 39 mM glicyny, 1,3 mM SDS, 20% metanolu).</li>
		<li>Przygotować bibułę za pomocą systemu do blottingu półsuchego i pozwolić na transfer białek pod napięciem 10 V przez 1 godzinę. Wyjmij membranę, spłucz ją krótko wodą i pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>Reaktywuj błonę, szybko przenosząc się do metanolu. Myć przez 5 min z TBS. Blokować 10% odtłuszczonym mlekiem w TBS przez 1 godzinę w temperaturze RT lub 4 °C O/N. Umyć membranę 3x po 5 minut za pomocą TBS.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenie przeciwciał zgodnie z zaleceniami w tabeli 1 i inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C O/N.</li>
		<li>Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą TBS-T. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:20 000 w 1% odtłuszczonym mleku w TBS. Inkubować 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą TBS-T i jeden dodatkowy raz za pomocą TBS.</li>
		<li>Do wykrywania sygnału należy użyć komercyjnego zestawu chemiluminescencyjnego i cyfrowego systemu obrazowania żelowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Coomassie Brilliant Blue G-250
	<ol>
		<li>Wykonaj SDS-PAGE zgodnie z opisem w 4.2.1. Załaduj próbki na żel poliakryloamidowy SDS i uruchom żel w tempie 25 mA na żel, aż skończy się błękit bromfenolowy.</li>
		<li>Wykonaj barwienie Coomassie Brilliant Blue G-250 w temperaturze RT. Wszystkie inkubacje wykonuj pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
		<li>Przenieść żel do roztworu utrwalającego zawierającego 40% metanolu i 10% kwasu octowego na 30 minut.</li>
		<li>Zamienić bufor na roztwór odbarwiający (25% etanol i 8% kwas octowy) i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Zabarwić żel 0,2% Coomassie Brillant Blue G-250 w 40% metanolu i 10% kwasie octowym przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odbarwić żel roztworem odbarwiającym i wymienić bufor po 10 minutach, 30 minutach i 60 minutach.</li>
		<li>Żel należy przechowywać w 25% etanolu, 8% kwasie octowym i 4% glicerolu w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić obrazowanie i analizę zgodnie z opisem w ppkt 4.2.8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza oligomerycznych stanów receptorów rozpoznawania wzorców
<ol>
	<li>Natywna strona
	<ol>
		<li>Przygotować 50 μg lizatu komórkowego w końcowej objętości 10 μl z PBS i dodać 5× natywnego buforu próbki (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% deoksycholanu sodu, 50% glicerolu, 0,5% błękitu bromfenolowego) do końcowego stężenia 1x.</li>
		<li>Załaduj próbki NATYCHMIAST na natywny żel poliakrylamidowy z 5% jako żelem układającym w stos i 8% jako żelem rozdzielczym. Każde opóźnienie będzie skutkowało utratą rodzimych kompleksów34.</li>
		<li>Uruchomić żel w temperaturze 20 mA na żel w temperaturze 4 °C z 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glicyną jako anodą i 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glicyną, 1% deoksycholanem sodu jako buforem katodowym. Po 1,5-2 godzinach (niebieska opaska bromfenolowa opuściła żel około 45 minut wcześniej) elektroforeza jest zakończona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachodnia plama
	<ol>
		<li>Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) na 30 sekund metanolem i umieść ją w buforze Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, 20% metanolu).</li>
		<li>Zamontuj komorę mokrego blota zgodnie z instrukcją producenta i napełnij zbiornik buforem Tovin.</li>
		<li>Wykonuj osuszanie prądem 250 mA przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po zakończeniu osuszania należy postępować zgodnie z opisem począwszy od ppkt 4.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gurtler, C., Bowie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+detection+of+microbial+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune detection of microbial nucleic acids.</a> Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).</li>
<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RIG-I+has+an+essential+function+in+double-stranded+RNA-induced+innate+antiviral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.</a> Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).</li>
<li>Andrejeva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+proteins+of+paramyxoviruses+bind+the+IFN-inducible+RNA+helicase%2C+mda-5%2C+and+inhibit+its+activation+of+the+IFN-beta+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+innate+antiviral+defenses+through+a+shared+repressor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22in+RIG-I+and+LGP2+Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain.</a> in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).</li>
<li>Ferrage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+second+CARD+of+human+RIG-I+provide+mechanistic+insights+into+regulation+of+RIG-I+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).</li>
<li>Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolakofsky%2C+D+%22A+structure-based+model+of+RIG-I+activation%22">A structure-based model of RIG-I activation</a>. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).</li>
<li>Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+determinants+of+viral+RNA+recognition+by+innate+immune+sensor+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).</li>
<li>Kowalinski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+activation+of+innate+immune+pattern-recognition+receptor+RIG-I+by+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA.</a> Cell. 147, 423-435 (2011).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+RNA+recognition+by+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into RNA recognition by RIG-I.</a> Cell. 147, 409-422 (2011).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+genome+5%26%2334%3B+termini+as+a+strategy+of+negative-strand+RNA+viruses+to+avoid+RIG-I-dependent+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Processing of genome 5&#34; termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction.</a> PloS One. 3, e2032(2008).</li>
<li>Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+viral+Achilles%27+recognition+of+5%27-triphosphate+RNA+in+innate+anti-viral+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence.</a> Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPichlmair%2C+A+%22RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%22">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates</a>. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornung%2C+V+%225%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%22">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I</a>. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).</li>
<li>Saito, T., Gale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+double-stranded+RNA+by+RIG-I-like+receptors+in+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonself+RNA-sensing+mechanism+of+RIG-I+helicase+and+activation+of+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses.</a> Mol Cell. 29, 428-440 (2008).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+signal+perception+and+integration+by+the+innate+immune+sensor+retinoic+acid-inducible+gene-I+%28RIG-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I).</a> J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-induced+oligomerization+of+the+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA5+activates+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response.</a> Immunity. 36, 959-973 (2012).</li>
<li>Civril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIG-I+ATPase+domain+structure+reveals+insights+into+ATP-dependent+antiviral+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling.</a> EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).</li>
<li>Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+the+innate+antiviral+response+through+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).</li>
<li>Hertzog, P. J., Williams, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+type+I+interferon+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokin.%2C+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fine tuning type I interferon responses.</a> Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).</li>
<li>Pindel, A., Sadler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+R+in+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase R in the interferon response.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).</li>
<li>Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2alpha+kinases%3A+their+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">The eIF2alpha kinases: their structures and functions.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).</li>
<li>Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PKR+an+open+and+shut+case%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of PKR an open and shut case.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).</li>
<li>Dauber, B., Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Antiviral+Kinase+PKR+and+Viral+Countermeasures%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures.</a> Viruses. 1, 523-544 (2009).</li>
<li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+PKR+dimerization%2C+autophosphorylation%2C+and+eIF2alpha+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition.</a> Cell. 122, 901-913 (2005).</li>
<li>Gack, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM25+RING-finger+E3+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RIG-I-mediated+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity.</a> Nature. 446, 916-920 (2007).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+RIG-I+pathway+reveals+a+signaling+role+of+unanchored+polyubiquitin+chains+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity.</a> Cell. 141, 315-330 (2010).</li>
<li>Anderson, E., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+stabilities+in+protein+kinase+R+%28PKR%29%3A+evidence+for+weak+interdomain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions.</a> Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incoming+RNA+virus+nucleocapsids+containing+a+5%27-triphosphorylated+genome+activate+RIG-I+and+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling.</a> Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native.</a> 5, 4338-4346 (2005).</li>
<li>Muller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Bouloy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Ikegami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells+%3A+Devoted+to+Molecula.%2C+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).</li>
<li>Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+IRF-3+activation+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Control of IRF-3 activation by phosphorylation.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).</li>
<li>Bamming, D., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signal+transduction+by+enzymatically+inactive+antiviral+RNA+helicase+proteins+MDA5+RIG-I+and+LGP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+dsRNA+recognition%2C+filament+formation%2C+and+antiviral+signal+activation+by+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5.</a> Cell. 152, 276-289 (2013).</li>
<li>Berke, I. C., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA5+cooperatively+forms+dimers+and+ATP-sensitive+filaments+upon+binding+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA.</a> The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).</li>
<li>Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+evasion+of+type+I+interferon+responses+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses.</a> Virus Research. 162, 12-18 (2011).</li>
<li>Taylor, K. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+viral+evasion+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon.</a> Immunology. 138, 190-197 (2013).</li>
<li>Goodbourn, S., Randall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+type+I+interferon+production+by+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).</li>
<li>Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tricks+to+grid-lock+the+type+I+interferon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tricks to grid-lock the type I interferon system.</a> Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wyczuwanie obecności wirusów i aktywacja przeciwwirusowego systemu IFN typu I mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej22. W wykrywaniu wirusów pośredniczą receptory rozpoznawania patogenów (PRR), takie jak RIG-I i PKR, co umożliwia szybką reakcję i aktywację przeciwwirusowych mechanizmów obronnych. W tym miejscu opisujemy dwie metody bezpośredniej oceny stanu aktywacji RIG-I i PKR.
Ograniczone trawienie proteazy jako narzędzie do monitorowania zmian...

Kluczowym wydarzeniem w obronie przeciwwirusowej gospodarza jest szybkie wykrycie patogenu przez tzw. receptory rozpoznawania wzorców (PRR)1,2. Wewnątrzkomórkowe wykrywanie zakażenia wirusem RNA zależy od dwóch helikaz cytoplazmatycznego RNA, RIG-I (gen I indukowany kwasem retinowym) i MDA5 (białko 5 związane z różnicowaniem czerniaka)3-5. RIG-I składa się z dwóch N-końcowych domen rekrutacyjnych kaspazy (CARD), centralnej domeny helikazy RNA typu DECH-box i domeny C-końcowej (CTD)4,6. Podczas gdy CTD i domena helikazy są wymagane do rozpoznawania RNA innych niż własne (wirusowe), CARD pośredniczą w sygnalizacji końcowej, prowadząc do ustalenia statusu gospodarza przeciwwirusowego.
Jeśli RIG-I jest w stanie cichym, tzn. przy braku specyficznego liganda RNA, drugi CARD oddziałuje z centralną domeną helikazy i utrzymuje RIG-I w konformacji autohamującej7-11. RIG-I wiąże się z krótkimi dwuniciowymi (ds) RNA zawierającymi 5'-trifosforan (5'PPP), długie dsRNA i RNA bogate w poliU / UC, klasyczne struktury sygnaturowe, które są obecne w genomach wielu wirusów RNA12-16. Dwie główne cechy aktywacji RIG-I to przejście na konformację zamkniętą6,17 i homooligomeryzację6,18,19. Przełącznik konformacyjny wzmacnia wiązanie RNA, odsłania CARDS do dalszej sygnalizacji i odtwarza aktywne miejsceATPazy 8,9,11,20. Tworzenie oligomerycznych kompleksów RIG-I prowadzi do lepszej rekrutacji dalszych cząsteczek adaptorowych sygnałowych w celu stworzenia platformy do transdukcji sygnału przeciwwirusowego11. Łańcuch sygnałowy regulowany przez RIG-I ostatecznie aktywuje czynnik transkrypcyjny IRF-3 w celu zwiększenia regulacji genów interferonu (IFN-alfa / beta), a tym samym ekspresji genów stymulowanych interferonem (ISG) w celu uzyskania pełnej odpowiedzi przeciwwirusowej21,22. Jednym z najlepiej scharakteryzowanych ISG jest kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR) 23. PKR należy do rodziny kinaz eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 2 alfa (eIF2α) i składa się z N-końcowej dwuniciowej domeny wiążącej RNA i domeny kinazy C-końcowej. Domena kinazy stanowi granicę dimeryzacji kluczową dla aktywacji PKR i realizuje funkcje katalityczne białka. Wiązanie PKR z wirusowym dsRNA prowadzi do jego zmiany konformacyjnej, umożliwiając m.in. dimeryzację i autofosforylację w Thr 446. PKR następnie pośredniczy w fosforylacji eIF2α, blokując w ten sposób translację wirusowych mRNA23-27.
Zarówno RIG-I, jak i PKR ulegają poważnym rearanżacjom strukturalnym, tworzą oligomeryczne kompleksy i są modyfikowane potranslacyjnie przez fosforylację/defosforylację i ubikwitynację10,11,19,23,24,26-29. Aby lepiej zrozumieć, które struktury wirusowego RNA aktywują RIG-I i PKR (i na jakim etapie antagoniści wirusa mogą zakłócać), ważne jest dokładne określenie stanu aktywacji. W przypadku obu PRR opisano wcześniej, że aktywacja prowadzi do pojawienia się opornych na trypsynę fragmentów białek6,17,30 i oligomerów wyższego rzędu6,18,19. Jednak biorąc pod uwagę bogactwo literatury na temat tych kluczowych czynników przeciwwirusowej odpowiedzi gospodarza1,2,24, zastosowanie metod bezpośrednich wydaje się stosunkowo rzadkie. W nadziei na pobudzenie szerszego zastosowania zapewniamy wygodne i czułe protokoły do solidnej analizy stanów aktywacji RIG-I i PKR. Ludzka linia komórkowa A549 kompetentna do IFN jest zakażona uznanym aktywatorem RIG-I i PKR, atenuowanym zmutowanym klonem wirusa gorączki doliny Rift 13 (Cl 13)31,32. Po prostej procedurze lizy, ekstrakty zakażonych komórek są testowane za pomocą ograniczonego trawienia trypsyny/analizy western blot w celu oceny przełączania konformacyjnego oraz za pomocą elektroforezy w monoforze w monochromie w żelu poliakrylamidowym (PAGE) / analizy Western blot w celu zmierzenia tworzenia oligomerów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-fenyloetylochlorometyloketon (TPCK) trypsyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-RIG-I (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 w 1% odtłuszczonym mleku w TBS</td></tr><tr><td>Mouse monoklonalny anty-PKR (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500 w 1% odtłuszczonym mleku w TBS</td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomika</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000 w 5% BSA w TBS</td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-IRF-3 królik</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 w 1% mleku odtłuszczonym w TBS</td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 w 1% mleku odtłuszczonym w TBS</td></tr><tr><td>Królicza surowica hiperimmunologiczna anty-RVFV "C2" (MP-12)</td><td>Uprzejmie dostarczone przez Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB: 1:2,000 w 1% mleku odtłuszczonym w TBS</td></tr><tr><td>Mysza monoklonalna anty-beta-aktyna (8H10D10)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3700</td><td>WB: 1:1,000 w 1% odtłuszczonym mleku w TBS</td></tr><tr><td>Anty-króliczek kozioł sprzężony z peroksydazą poliklonalną</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20 000 w 1% mleku odtłuszczonym w TBS</td></tr><tr><td>Anty-mysi kozioł sprzężony z peroksydazą poliklonalną</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20 000 w 1% mleku odtłuszczonym w TBS</td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych rig-i i pkr przez ograniczone trawienie proteazy i natywne page

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Obrona gospodarza przed infekcją wirusową zależy od szybkiego wykrycia przez receptory rozpoznające wzorce (PRR) wrodzonego układu odpornościowego. W cytoplazmie PPR RIG-I i PKR wiążą się ze specyficznymi ligandami wirusowego RNA. To najpierw pośredniczy w przełączaniu konformacyjnym i oligomeryzacji, a następnie umożliwia aktywację odpowiedzi interferonu przeciwwirusowego. Podczas gdy metody pomiaru ekspresji genów gospodarza przeciwwirusowego są dobrze znane, metody bezpośredniego monitorowania stanów aktywacji RIG-I i PKR są tylko częściowo i słabiej znane.
Tutaj opisujemy dwie metody monitorowania stymulacji RIG-I i PKR po zakażeniu uznanym induktorem interferonu, wirusem gorączki Rift Valley zmutowanym klonem 13 (Cl 13). Ograniczone trawienie trypsyny pozwala na analizę zmian wrażliwości proteazy, wskazujących na zmiany konformacyjne PRR. Trawienie trypsyny lizatów z pozorowanych zakażonych komórek powoduje szybką degradację RIG-I i PKR, podczas gdy zakażenie Cl 13 prowadzi do powstania opornego na proteazę fragmentu RIG-I. Ponadto PKR wykazuje częściową oporność na trawienie trypsyny wywołaną przez wirusa, co zbiega się z jego charakterystyczną fosforylacją na poziomie Thr 446. Powstawanie oligomerów RIG-I i PKR potwierdzono za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po zakażeniu dochodzi do silnej akumulacji kompleksów oligomerycznych RIG-I i PKR, podczas gdy białka te pozostały jako monomery w pozorowanych zakażonych próbkach.
Ograniczone trawienie proteazy i natywna PAGE, oba w połączeniu z analizą western blot, pozwalają na czuły i bezpośredni pomiar dwóch różnych etapów aktywacji RIG-I i PKR. Techniki te są stosunkowo łatwe i szybkie do wykonania i nie wymagają drogiego sprzętu.

Rozpoznanie wirusowego agonisty przez RIG-I lub PKR wywołuje zmianę konformacyjną6,17,30 oraz oligomeryzację6,18,27. Przebadaliśmy te dwa markery aktywacji odpowiednio za pomocą ograniczonego trawienia proteazą oraz natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Ludzkie komórki A549 zainfekowano klonem 13 (Cl 13) wirusa gorączki doliny Rift, który charakteryzuje się mutacją antagonisty IFN NSs35,36. Ze względu na brak funkcjonalnego białka NSs, klon 13...

Wrodzona obrona przed infekcjami wirusowymi jest wywoływana przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR). Dwa cytoplazmatyczne PR, RIG-I I PKR, wiążą się z sygnaturą wirusa RNA, zmieniają konformację, oligomeryzują i aktywują sygnalizację przeciwwirusową. Opisano metody, które pozwalają wygodnie monitorować przełączanie konformacyjne i oligomeryzację tych cytoplazmatycznych PRR.

Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Wrodzone mechanizmy obronne przeciwko infekcjom wirusowym są inicjowane przez receptory rozpoznające wzorce (PRRs), które podczas infekcji znajdują się w komórkach wrodzonego układu odpornościowego. Cytoplazmatyczne PRRs, takie jak RIG-I i PKR, wiążą wirusowe RNA sygnaturowe, zmieniają swoją konformację, ulegają alligowaniu i aktywują sygnalizację przeciwwirusową. Aby monitorować zmiany konformacyjne RIG-I i PKR oraz ich alligowanie in vitro, ludzkie komórki A549 są zakażane wirusem gorączki Rift Valley.Klon 13 w celu stymulacji aktywacji PRR. Następnie przygotowuje się lizaty komórkowe komórek kontrolnych i zainfekowanych w celu analizy zmian konformacyjnych rig eye oraz PKR. Przeprowadza się ograniczone trawienie trypsyną.Jeśli nastąpiły zmiany konformacyjne w strukturze białka, jest ono bardziej odporne na trawienie, a prążki będą widoczne w analizie Western blotting w celu zbadania tworzenia się kompleksów. Wykonuje się elektroforezę natywną (native PAGE), a następnie analizę Western blotting. Jeśli doszło do oligomeryzacji, widoczne są kompleksy oligomeryczne RIG-I oraz PKR. Główną zaletą ograniczonego trawienia proteazą i elektroforezy natywnej jest to, że techniki te umożliwiają bezpośredni pomiar aktywacji RIG-I oraz PKR.Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności nieswoistej, takie jak dokładna natura i pochodzenie gatunków RNA istotnych dla aktywacji RIG-I oraz PKR. Metody te mogą dostarczyć wiedzy na temat agonistów RIG-I i PKR. Można je również zastosować do innych białek sensorów cytoplazmatycznych, takich jak MDA5; procedurę tę zademonstruje Mila Viva, doktorantka z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem procedury.Należy pamiętać, że klon 13 wirusa gorączki Rift Valley, w dalszej części określany jako CL 13, jest osłabionym mutantem wirusa, który w Niemczech musi być obsługiwany w warunkach BSL 2. Podgrzej wstępnie bezsurowicze podłoże PBS oraz podłoże hodowli komórkowej zawierające 5% FCS. Umieść je w kąpieli wodnej w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj roztwór CL 13 w podłożu bezsurowiczym o stężeniu 1,25 × 10⁷ PFU/ml w celu zainfekowania 2,5 × 10⁶.Komórki A 5 49 z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą pięć; należy przygotować około 10% więcej niż jest wymagane, aby zrekompensować błędy pipetowania. Wyjąć komórki A 5 49 z inkubatora, odessać medium i dodać 10 ml PBS; zakręcić lub przechylić kolbę z hodowlą, aby wypłukać komórki, a następnie usunąć PBS. Następnie dodać jeden mililitr rozcieńczonego CL 13 lub, w przypadku kontroli niezakażonej, przeprowadzić infekcję pozorowaną (mock infection).Dodaj 1 mL pożywki bez surowicy i inkubuj przez jedną godzinę, mieszając co 15 minut. Ostrożnie przechylaj kolbę, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie pożywki. Po jednej godzinie infekcji usuń inokulum.Dodaj pięć mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli komórkowej z 5% FCS i inkubuj przez pięć godzin. Przygotuj PBS z 0,5% tritton X 100 i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie dodawaj inhibitorów proteazy syryjskiej.Następnie przemyj komórki zimnym PBS i dodaj 10 ml świeżego PBS. Potem, używając skrobaka do komórek, ododerwij komórki od naczynia. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 800 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu odessać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 30 µL PBS z 0,5% Triton X 100. Przenieść lizat do nowej probówki 1,5 ml i inkubować przez co najmniej 10 minut w lodzie. Wirować lizat z prędkością 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu przenieś oczyszczony lizat komórkowy do nowej probówki. Przeprowadź test Bradforda, aby określić stężenie białka w oczyszczonym lizacie komórkowym. Przechowuj w temperaturze -20°C lub niezwłocznie przejdź do trawienia trypsyną lub natywnej elektroforezy PAGE w celu analizy zmian konformacyjnych receptorów rozpoznawania wzorców. Najpierw rozcieńcz trypsynę traktowaną chloro-metyloketonem lub trypsynę TPCK w PBS do końcowego stężenia roboczego 2 µg/mL. W dwóch nowych probówkach dla każdego wariantu dostosuj końcowe stężenie białka w lizatach CL 13 oraz w lizatach białkowych kontroli niezakażonej do 25 µg w końcowej objętości 9 µL za pomocą PBS. Jeden zestaw lizatów posłuży jako kontrola wejściowa, a drugi zostanie poddany działaniu trypsyny TPCK. Do pozostałych dwóch probówek z kontrolą nietraktowaną dodaj 1 µL PBS.Dodaj 1 µL trypsyny TPCK o stężeniu 2 µg/µL, aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 µg/µL. Wymieszaj reakcje poprzez pipetowanie. Inkubuj lizaty w temperaturze 37 °C przez 25 minut.Przerwać reakcję poprzez dodanie pięciokrotnego nadmiaru buforu do próbek denaturujących, a następnie gotować przez pięć minut w temperaturze 95 °C. Ważne jest, aby nie przedłużać czasu inkubacji trypsyny. Należy pamiętać, że precyzyjne odmierzenie czasu trawienia trypsyną jest kluczowe dla wykrycia fragmentów opornych bez tła; jeśli białka oporne nie zostaną wykryte lub zostanie wykrytych zbyt wiele, należy odpowiednio skorygować czas trawienia.Po zagotowaniu przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub naładuj próbki na dwa żele do elektroforezy w poliakryloamidzie z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), składające się z 5% żelu ładującego nad 12% żelem rozdzielającym. Rozdzielaj białka przy natężeniu 25 mA na żel, aż błękit bromofenolowy całkowicie przejdzie przez żel ładujący.Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej przenieś białka z jednego żelu na membranę z polifluorku winylidenu i przeanalizuj je metodą western blotting z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko RIG-I oraz PKR; drugi żel zabarw kumasy brilliant blue G-250. Następnie przechowuj żel w roztworze 25% etanolu, 8% kwasu octowego i 4% glicerolu w temperaturze 4°C lub przejdź do obrazowania i analizy. Aby przeanalizować stany oligomeryczne receptorów rozpoznawania wzorców, przygotuj 50 µg lizatu komórkowego w końcowej objętości 10 µL w PBS i dodaj 5x bufor do próbek do końcowego stężenia 1x.Próbki należy niezwłocznie nałożyć na natywny żel poliakrylamidowy z 5% żelem kondensującym i 8% żelem rozdzielczym. Jakakolwiek zwłoka doprowadzi do utraty kompleksów natywnych. Elektroforezę należy prowadzić przy natężeniu 20 mA na żel w temperaturze 4°C.Zatrzymaj elektroforezę 45 minut po tym, jak prążek błękitu bromofenolowego opuści żel, po całkowitym czasie około 1,5 do dwóch godzin, a następnie przeprowadź Western blotting z użyciem przeciwciał przeciwko RIG-I i PKR, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, aby ocenić przełączenie konformacyjne i indukcję oligomerów wywołaną rozpoznaniem agonisty wirusowego przez RIG-I lub PKR. Ograniczone trawienie proteazą i natywne PAGE przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie; trawienie trypsyną lizatów komórek pozornie zakażonych doprowadziło do szybkiej degradacji RIG-I, podczas gdy zakażenie klonem 13 doprowadziło do powstania odpornego fragmentu RIG-I o masie 30 kDa. PKR wykazuje również częściową odporność na trawienie trypsyną w próbkach zakażonych, co pokrywa się z jego fosforylacją. Aby monitorować wydajność i specyficzność trawienia trypsyną, żele barwiono Coomassie Brilliant Blue G-250. Próbki nietraktowane wykazują równe ilości nałożonych białek; poddanie lizatów komórek pozornie zakażonych oraz zakażonych C13 trawieniu trypsyną prowadzi do porównywalnego spadku całkowitej ilości białek.Wykazuje to, że trawienie trypsyną wykazuje taką samą efektywność dla próbek kontrolnych (mock) oraz próbek zakażonych szczepem CL 13 w komórkach niezakażonych. Jako dodatkowa kontrola wykryto jedynie monomery R EYE oraz PKR. Do analizy włączono czynnik transkrypcyjny IRF three, który występuje jako monomer, lecz znany jest z dimeryzacji po aktywacji za pośrednictwem R Eye.Infekcja klonem 13 prowadzi do silnej akumulacji kompleksów oligomerycznych RIG-I w formie rozmycia (smear) oraz dimerów lub oligomerów PKR i IRF3 w formie wyraźnego prążka białkowego. Wyniki te wykazują, że ograniczona proteoliza i natywna elektroforeza żelowa (native PAGE) są użytecznymi narzędziami do monitorowania zmian konformacyjnych oraz tworzenia oligomerów RIG-I i PKR po infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat monitorowania zmian konformacji i oligomeryzacji RIG-I oraz PKR.Tę technikę można przeprowadzić w ciągu dwóch dni zgodnie z poniższą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. czy po rozwoju ligandu stymulującego występuje stabilna interakcja, można wykonać testy typu methods like pro. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny odporności wrodzonej do badania stanu aktywacji receptorów rozpoznających wzorce w komórkach stymulowanych wirusem.

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Monitorowanie aktywacji antywirusowych receptorów rozpoznawania wzorców RIG-I i PKR poprzez ograniczone trawienie proteazy i bieżącą PAGE

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Opisano natywną metodę Western blot do analizy dimeryzacji endogennego czynnika regulacyjnego interferonu 5 w linii komórek dendrytycznych plazmocytoidu CAL-1. Protokół ten można również zastosować do innych linii komórkowych.

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Wzmocnienie sygnału tyramidu podczas barwienia immunofluorescencyjnego umożliwia czułe wykrywanie fosforylowanych RIPK3 i MLKL podczas nekroptozy wywołanej przez ZBP1 po zakażeniu HSV-1.

Wzmocnienie sygnału tyramidu do barwienia immunofluorescencyjnego zależnej od ZBP1 fosforylacji RIPK3 i MLKL po zakażeniu HSV-1 w komórkach ludzkich

Poznaj metodę monitorowania aktywacji receptorów RIG-I i PKR poprzez ograniczone trawienie proteazą i natywne PAGE. Technika ta pozwala badać zmiany konformacyjne i oligomeryzację receptorów rozpoznawania wzorców podczas infekcji wirusowych.

Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Przeglądaj więcej filmów