Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Wrodzone mechanizmy obronne przeciwko infekcjom wirusowym są inicjowane przez receptory rozpoznające wzorce (PRRs), które podczas infekcji znajdują się w komórkach wrodzonego układu odpornościowego. Cytoplazmatyczne PRRs, takie jak RIG-I i PKR, wiążą wirusowe RNA sygnaturowe, zmieniają swoją konformację, ulegają alligowaniu i aktywują sygnalizację przeciwwirusową. Aby monitorować zmiany konformacyjne RIG-I i PKR oraz ich alligowanie in vitro, ludzkie komórki A549 są zakażane wirusem gorączki Rift Valley.

Klon 13 w celu stymulacji aktywacji PRR. Następnie przygotowuje się lizaty komórkowe komórek kontrolnych i zainfekowanych w celu analizy zmian konformacyjnych rig eye oraz PKR. Przeprowadza się ograniczone trawienie trypsyną.

Jeśli nastąpiły zmiany konformacyjne w strukturze białka, jest ono bardziej odporne na trawienie, a prążki będą widoczne w analizie Western blotting w celu zbadania tworzenia się kompleksów. Wykonuje się elektroforezę natywną (native PAGE), a następnie analizę Western blotting. Jeśli doszło do oligomeryzacji, widoczne są kompleksy oligomeryczne RIG-I oraz PKR. Główną zaletą ograniczonego trawienia proteazą i elektroforezy natywnej jest to, że techniki te umożliwiają bezpośredni pomiar aktywacji RIG-I oraz PKR.

Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności nieswoistej, takie jak dokładna natura i pochodzenie gatunków RNA istotnych dla aktywacji RIG-I oraz PKR. Metody te mogą dostarczyć wiedzy na temat agonistów RIG-I i PKR. Można je również zastosować do innych białek sensorów cytoplazmatycznych, takich jak MDA5; procedurę tę zademonstruje Mila Viva, doktorantka z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem procedury.

Należy pamiętać, że klon 13 wirusa gorączki Rift Valley, w dalszej części określany jako CL 13, jest osłabionym mutantem wirusa, który w Niemczech musi być obsługiwany w warunkach BSL 2. Podgrzej wstępnie bezsurowicze podłoże PBS oraz podłoże hodowli komórkowej zawierające 5% FCS. Umieść je w kąpieli wodnej w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj roztwór CL 13 w podłożu bezsurowiczym o stężeniu 1,25 × 10⁷ PFU/ml w celu zainfekowania 2,5 × 10⁶.

Komórki A 5 49 z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą pięć; należy przygotować około 10% więcej niż jest wymagane, aby zrekompensować błędy pipetowania. Wyjąć komórki A 5 49 z inkubatora, odessać medium i dodać 10 ml PBS; zakręcić lub przechylić kolbę z hodowlą, aby wypłukać komórki, a następnie usunąć PBS. Następnie dodać jeden mililitr rozcieńczonego CL 13 lub, w przypadku kontroli niezakażonej, przeprowadzić infekcję pozorowaną (mock infection).

Dodaj 1 mL pożywki bez surowicy i inkubuj przez jedną godzinę, mieszając co 15 minut. Ostrożnie przechylaj kolbę, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie pożywki. Po jednej godzinie infekcji usuń inokulum.

Dodaj pięć mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli komórkowej z 5% FCS i inkubuj przez pięć godzin. Przygotuj PBS z 0,5% tritton X 100 i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie dodawaj inhibitorów proteazy syryjskiej.

Następnie przemyj komórki zimnym PBS i dodaj 10 ml świeżego PBS. Potem, używając skrobaka do komórek, ododerwij komórki od naczynia. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 800 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu odessać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 30 µL PBS z 0,5% Triton X 100. Przenieść lizat do nowej probówki 1,5 ml i inkubować przez co najmniej 10 minut w lodzie. Wirować lizat z prędkością 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu przenieś oczyszczony lizat komórkowy do nowej probówki. Przeprowadź test Bradforda, aby określić stężenie białka w oczyszczonym lizacie komórkowym. Przechowuj w temperaturze -20°C lub niezwłocznie przejdź do trawienia trypsyną lub natywnej elektroforezy PAGE w celu analizy zmian konformacyjnych receptorów rozpoznawania wzorców. Najpierw rozcieńcz trypsynę traktowaną chloro-metyloketonem lub trypsynę TPCK w PBS do końcowego stężenia roboczego 2 µg/mL. W dwóch nowych probówkach dla każdego wariantu dostosuj końcowe stężenie białka w lizatach CL 13 oraz w lizatach białkowych kontroli niezakażonej do 25 µg w końcowej objętości 9 µL za pomocą PBS. Jeden zestaw lizatów posłuży jako kontrola wejściowa, a drugi zostanie poddany działaniu trypsyny TPCK. Do pozostałych dwóch probówek z kontrolą nietraktowaną dodaj 1 µL PBS.

Dodaj 1 µL trypsyny TPCK o stężeniu 2 µg/µL, aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 µg/µL. Wymieszaj reakcje poprzez pipetowanie. Inkubuj lizaty w temperaturze 37 °C przez 25 minut.

Przerwać reakcję poprzez dodanie pięciokrotnego nadmiaru buforu do próbek denaturujących, a następnie gotować przez pięć minut w temperaturze 95 °C. Ważne jest, aby nie przedłużać czasu inkubacji trypsyny. Należy pamiętać, że precyzyjne odmierzenie czasu trawienia trypsyną jest kluczowe dla wykrycia fragmentów opornych bez tła; jeśli białka oporne nie zostaną wykryte lub zostanie wykrytych zbyt wiele, należy odpowiednio skorygować czas trawienia.

Po zagotowaniu przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub naładuj próbki na dwa żele do elektroforezy w poliakryloamidzie z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), składające się z 5% żelu ładującego nad 12% żelem rozdzielającym. Rozdzielaj białka przy natężeniu 25 mA na żel, aż błękit bromofenolowy całkowicie przejdzie przez żel ładujący.

Po przeprowadzeniu elektroforezy żelowej przenieś białka z jednego żelu na membranę z polifluorku winylidenu i przeanalizuj je metodą western blotting z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko RIG-I oraz PKR; drugi żel zabarw kumasy brilliant blue G-250. Następnie przechowuj żel w roztworze 25% etanolu, 8% kwasu octowego i 4% glicerolu w temperaturze 4°C lub przejdź do obrazowania i analizy. Aby przeanalizować stany oligomeryczne receptorów rozpoznawania wzorców, przygotuj 50 µg lizatu komórkowego w końcowej objętości 10 µL w PBS i dodaj 5x bufor do próbek do końcowego stężenia 1x.

Próbki należy niezwłocznie nałożyć na natywny żel poliakrylamidowy z 5% żelem kondensującym i 8% żelem rozdzielczym. Jakakolwiek zwłoka doprowadzi do utraty kompleksów natywnych. Elektroforezę należy prowadzić przy natężeniu 20 mA na żel w temperaturze 4°C.

Zatrzymaj elektroforezę 45 minut po tym, jak prążek błękitu bromofenolowego opuści żel, po całkowitym czasie około 1,5 do dwóch godzin, a następnie przeprowadź Western blotting z użyciem przeciwciał przeciwko RIG-I i PKR, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, aby ocenić przełączenie konformacyjne i indukcję oligomerów wywołaną rozpoznaniem agonisty wirusowego przez RIG-I lub PKR. Ograniczone trawienie proteazą i natywne PAGE przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie; trawienie trypsyną lizatów komórek pozornie zakażonych doprowadziło do szybkiej degradacji RIG-I, podczas gdy zakażenie klonem 13 doprowadziło do powstania odpornego fragmentu RIG-I o masie 30 kDa. PKR wykazuje również częściową odporność na trawienie trypsyną w próbkach zakażonych, co pokrywa się z jego fosforylacją. Aby monitorować wydajność i specyficzność trawienia trypsyną, żele barwiono Coomassie Brilliant Blue G-250. Próbki nietraktowane wykazują równe ilości nałożonych białek; poddanie lizatów komórek pozornie zakażonych oraz zakażonych C13 trawieniu trypsyną prowadzi do porównywalnego spadku całkowitej ilości białek.

Wykazuje to, że trawienie trypsyną wykazuje taką samą efektywność dla próbek kontrolnych (mock) oraz próbek zakażonych szczepem CL 13 w komórkach niezakażonych. Jako dodatkowa kontrola wykryto jedynie monomery R EYE oraz PKR. Do analizy włączono czynnik transkrypcyjny IRF three, który występuje jako monomer, lecz znany jest z dimeryzacji po aktywacji za pośrednictwem R Eye.

Infekcja klonem 13 prowadzi do silnej akumulacji kompleksów oligomerycznych RIG-I w formie rozmycia (smear) oraz dimerów lub oligomerów PKR i IRF3 w formie wyraźnego prążka białkowego. Wyniki te wykazują, że ograniczona proteoliza i natywna elektroforeza żelowa (native PAGE) są użytecznymi narzędziami do monitorowania zmian konformacyjnych oraz tworzenia oligomerów RIG-I i PKR po infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat monitorowania zmian konformacji i oligomeryzacji RIG-I oraz PKR.

Tę technikę można przeprowadzić w ciągu dwóch dni zgodnie z poniższą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. czy po rozwoju ligandu stymulującego występuje stabilna interakcja, można wykonać testy typu methods like pro. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny odporności wrodzonej do badania stanu aktywacji receptorów rozpoznających wzorce w komórkach stymulowanych wirusem.