Name: Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj technikę subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania i oceny brzeżnych przeszczepów. Metoda zmniejsza uszkodzenie zachowawcze i umożliwia funkcjonalną ocenę przed transplantacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez granty badawcze Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) i Astellas. Markus Selzner otrzymał nagrodę ASTS Career Development Award. Matthias Knaak był wspierany przez stypendium badawcze Astellas. Dziękujemy Uwe Mummenhoffowi i rodzinie z Birmingham za ich hojne wsparcie.

Schematyczny przegląd protokołu przedstawiono na Rycynie 1.
<img alt="Schemat przejścia z ciepłego niedokrwienia do perfuzji subnormotermicznej, oś czasu procedury chirurgicznej." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Protokół badania. Projekt badania nad uszkodzeniem wątroby u świń opiera się na modelu donacji po śmierci krążeniowej (DCD). Po przecięciu wszystkich naczyń wątrobowych indukuje się śmierć krążeniową, po której następuje 45 min ciepłego niedokrwienia przeszczepu. Aby zasymulować transport przeszczepu pomiędzy szpitalem dawcy a biorcy w warunkach klinicznych, przeszczep przechowuje się w lodzie przez 4 hr po zimnym, podwójnym płukaniu. Po przechowywaniu na zimno organ poddawany jest perfuzji subnormotermicznej przez 6 hr w celu oceny stabilności perfuzji. W modelu transplantacyjnym czas perfuzji może być krótszy w celu odnowienia zapasów energii oraz oceny żywotności organu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
1. Zwierzęta
UWAGA: W badaniu wykorzystano samce świń rasy Yorkshire o masie 30-35 kg. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z zasadami humanitarnej opieki określonymi w „Principles of Laboratory Animal Care” opracowanych przez National Society for Medical Research oraz „Guide for the Care of Laboratory Animals” opublikowanym przez National Institutes of Health. Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami (Animal Care Committee) Toronto General Research Institute.
2. Pobieranie organów
<ol>
	<li>Utrzymuj samce świń rasy Yorkshire w placówkach badawczych przez 1 tydzień przed perfuzją/transplantacją, aby zmniejszyć poziom stresu i przyzwyczaić zwierzęta do warunków utrzymania. Mniej niż 2 dni pobytu w placówce spowoduje indukowaną stresem reakcję fizyczną, która może zmienić wynik perfuzji22,23.</li>
	<li>Zanurz świnie w narkozie poprzez domięśniowy (i.m.) wtrysk mieszaniny ketaminy (25 mg/kg), atropiny (0,04 mg/kg) i midazolamu (0,15 mg/kg).</li>
	<li>Przed intubacją upewnij się, że świnia oddycha spontanicznie 2 L O2 z domieszką 5% isofluranu. Spryskaj strun głosowe 2% lidokainą 2 min przed intubacją, aby uniknąć skurczów strun głosowych. Na przykład dla świni o masie 35 kg użyj rurki intubacyjnej 6,5 Fr. Zablokuj rurkę intubacyjną 3-5 ml powietrza pokojowego.</li>
	<li>Po intubacji użyj kapnometrii, aby potwierdzić poprawność intubacji. Obniż stężenie gazu isofluranowego do 2%. Ustaw respirator na 14-16 oddechów/min i objętość oddechową 10 ml/kg masy ciała.</li>
	<li>Wprowadź cewnik dożylny (i.v.) 20 G do jednej z żył usznych, aby umożliwić infuzję roztworu mleczanu Ringera (200 ml na godzinę). Następnie wymyj świnię i przykryj ją sterylnymi obłożeniami.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej, a następnie rozszerzenie boczne lewe. Użyj ręcznika, aby przykryć jelita grube i cienkie i przesuń je na lewą stronę.</li>
	<li>Oddziel od siebie żyłę główną dolną (IVC) i aortę dystalną; podwiąż gałęzie aorty idące do pleców; wyizoluj i uwolnij tętnice nerkowe z przyległej tkanki.</li>
	<li>Przetnij więzadło sierpowate i więzadło trójkątne za pomocą kauteryzatora.</li>
	<li>Uwolnij żyłę wrotną poprzez nacięcie otrzewnej między trzustką a żyłą wrotną. Podwiąż żyły odprowadzające krew z trzustki do żyły wrotnej.</li>
	<li>Wydziel pień trzewny poniżej żyły wrotnej i prześledź go wstecz do aorty. Obejmij tętnicę krezkową podwiązką 2-0; obejmij tętnice śledzionową i lewą żołądkową, które odchodzą tylnie od pnia trzewnego. Oddziel pień trzewny od żyły wrotnej.</li>
	<li>Podwiąż naczynia limfatyczne w więzadle wątrobowo-dwunastniczym, aby zapobiec wyciekowi limfy. Przetnij prawą tętnicę żołądkową między podwiązkami. Podwiąż mniejsze żyły. Oddziel przewód żółciowy od więzadła i przetnij go dystalnie po podwiązaniu.</li>
	<li>Wydziel aortę za przeponą między sercem a pniem trzewnym; załóż podwiązkę 2-0 wokół aorty.</li>
	<li>Uwolnij wątrobę z żyły głównej dolnej po prawej stronie za pomocą elektrokoagulacji; w górnej części między żyłą główną a wątrobą użyj nożyczek.</li>
	<li>Usuń pęcherzyk żółciowy i wypal krwawiące naczynia z łoża pęcherzyka żółciowego.</li>
	<li>Podaj dożylnie (i.v.) 1 000 iU/kg masy dawcy heparyny. W modelu DCD wywołaj zatrzymanie akcji serca poprzez wtrysk wewnątrzsercowy 40 mval KCl 3 min po podaniu heparyny. Przyjmij zatrzymanie akcji serca jako punkt początkowy niedokrwienia ciepłego.</li>
	<li>Do perfuzji pobierz 1,6 L krwi świni do worków CPDA (cytrynian, fosforan, dekstroza, adenozyna) natychmiast po śmierci serca. Wykonaj wirowanie łagodne (2 000 ×g bez hamowania). Usuń plazmę i warstwę leukocytarną w warunkach sterylnych (komora bezpieczna klasy II) i przechowuj erytrocyty w workach CPDA do transfuzji.</li>
	<li>Zakanuluj żyłę wrotną i aortę liniami do płukania narządu. Zaciśnij wcześniej założone podwiązki wokół tętnic udowych, nerkowych, śledzionowej, krezkowej i lewej żołądkowej, a także górnej aorty. W modelu dawcy z bijącym sercem (HBD) wykonaj kaniulację aorty i żyły wrotnej w warunkach bijącego serca.</li>
	<li>Po 45 min niedokrwienia ciepłego przepłucz wątrobę roztworem University of Wisconsin (UW), stosując podwójną perfuzję przez aortę (workowy system ciśnieniowy) i żyłę wrotną (siłą grawitacji).</li>
	<li>Wytnij wątrobę ze świni, pozostawiając wszystkie pozostałe naczynia długie.</li>
	<li>Podczas przygotowania na stole preparacyjnym zaklempyj górną IVC za pomocą zacisku Satinsky’ego i przepłucz wątrobę po raz drugi około 0,5 L roztworu UW wstecznie przez dolną IVC, aż odpływ z żyły wrotnej będzie przejrzysty.</li>
	<li>Podwiąż wszystkie gałęzie tętnicze odchodzące od aorty i pnia trzewnego. Wykonaj tętniczą perfuzję ciśnieniową na stole preparacyjnym około 0,5 L roztworu UW.</li>
	<li>Przepłucz przewód żółciowy za pomocą roztworu UW.</li>
	<li>Zakanuluj górną i dolną część IVC, używając reduktorów 1/2” x 3/8” z Luer Lock; zakanuluj żyłę wrotną i tętnicę wątrobową, używając reduktorów 3/8” x 1/4” i 1/4” x 3/8” z Luer Lock. Użyj górnej i dolnej żyły głównej jako odpływu żylnego.</li>
	<li>Umieść wątrobę w worku do narządów, zamknij worek i przechowuj wątrobę w lodzie do czasu rozpoczęcia perfuzji.</li>
</ol>
3. Perfuzja wątroby ex vivo
<ol>
	<li>Przygotować roztwór perfuzyjny zawierający 2 000 ml roztworu Steena, 400 ml wypłukanych erytrocytów, 550 mg pirogronianu sodu, 100 ml roztworu aminokwasów (10% Travasol), 10 mg glukonianu wapnia, 1 000 IE szybkodziałającej insuliny, 1 g cefazoliny, 500 mg metronidazolu oraz 10 000 iU heparyny. Dodać inne cząsteczki w celu wazodylatacji, immunosupresji, neutralizacji reaktywnych form tlenu lub leczenia komórek wątroby, zgodnie z konkretnym protokołem badania.</li>
	<li>W przypadku komponentu dializacyjnego stosować standardowy dializat zawierający 3,5 mM potasu, 25 mM wodorowęglanów, 27 mM glukozy oraz 275 mg/L pirogronianu.</li>
	<li>Złożyć obwód perfuzyjny (schemat przedstawiono na Rysunku 2). 
	<img alt="Schemat perfuzji wątroby; układ krążenia do badania organu; obejmuje pompę, dializator, oksygenator." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
	Rysunek 2. Budowa obwodu. Roztwór perfuzyjny, wypływając z głównego zbiornika stanowiącego punkt startowy i końcowy, jest tłoczony przez pompę odśrodkową do oksygenatora. Bezpośrednio po utlenowaniu roztworu obwód dzieli się na mniejszą linię prowadzącą do jednostki dializatora w celu zachowania homeostazy elektrolitowej oraz większą linię prowadzącą do filtra leukocytów w celu redukcji pozostałych białych krwinek (WBC). Roztwór przepływający przez dializator powraca do głównego zbiornika. Po filtrze leukocytów obwód ponownie rozdziela się na dwie równe linie. Jedna linia pod wysokim ciśnieniem (około 60 mmHg) prowadzi bezpośrednio do aorty, aby perfundować tętnicę wątrobową. Druga linia odpływa do drugiego zbiornika. Z tego zbiornika perfundowana jest żyła wrotna. Ciśnienie perfuzji wrotnej zależy od energii potencjalnej poziomu roztworu w zbiorniku (około 2-6 mmHg). Wszystkie płyny odpływają przez żyłę główną dolną i górną z powrotem do głównego zbiornika. W celu redukcji wpływu grawitacji i zapewnienia homogennej perfuzji, wątrobę umieszcza się w kąpieli wypełnionej wodą o regulowanej temperaturze. Jest ona oddzielona od wody nieprzepuszczalną membraną i unosi się w zawiesinie perfuzyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
	<ol>
		<li>Zebrać wszystkie płyny z obwodu do zbiornika o pojemności 3 L (zbiornik główny) i zaklemować odpływ.</li>
		<li>Połączyć odpływ z pompą odśrodkową, a następnie z komercyjnym oksygenatorem.</li>
		<li>Za oksygenatorem rozdzielić dreny na dwie linie. Jedną linię połączyć z dializatorem i odprowadzić z powrotem do głównego zbiornika. Drugą linię połączyć z filtrem redukcji leukocytów.</li>
		<li>Rozdzielić linię za filtrem redukcji leukocytów na linię tętniczą, która dostarcza roztwór perfuzyjny do tętnicy wątrobowej, oraz linię żyły wrotnej dostarczającą roztwór perfuzyjny do drugiego zbiornika, z którego płyn spływa grawitacyjnie do żyły wrotnej. Zaklemować dopływ wrotny.</li>
		<li>Połączyć linię tętniczą z linią żyły głównej odpływającą do głównego zbiornika w celu odzyskiwania płynów.</li>
		<li>Do zbierania wodobrzusza lub wycieków roztworu perfuzyjnego z wątroby przygotować linię ssącą połączoną z głównym zbiornikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdjąć klemę z odpływu głównego zbiornika i napełnić obwód roztworem perfuzyjnym. Uruchomić pompę odśrodkową z prędkością 1 500 obr./min. Roztwór perfuzyjny będzie przepływać przez linię tętniczą do linii żyły głównej i z powrotem do głównego zbiornika. Upewnić się, że z obwodu usunięto całe powietrze.</li>
	<li>Włączyć dopływ gazu do oksygenatora.</li>
	<li>Wyjąć wątrobę z lodu. Wypłukać roztwór UW za pomocą soli fizjologicznej.</li>
	<li>Umieścić wątrobę wypukłą stroną do dołu, aby ułatwić dostęp do naczyń, najlepiej w środowisku bezgrawitacyjnym, aby uniknąć kompresji organu na powierzchni styku. Użyć łaźni wodnej z funkcją grzania i chłodzenia. Ustawić temperaturę początkową obwodu i łaźni wodnej na 20 °C. Przykryć łaźnię wodną nieprzepuszczalną membraną i położyć wątrobę na tej membranie. Zredukować kompresję grawitacyjną poprzez zanurzenie wątroby w roztworze perfuzyjnym.</li>
	<li>Zmniejszyć prędkość pompy odśrodkowej do 1 000 obr./min i założyć dwie klemy na połączeniu linii tętniczej i linii żyły głównej. Następnie przeciąć dreny pomiędzy klemami. Za pomocą złączki trójdrożnej połączyć oba odpływy z żył głównych i podłączyć je do linii żyły głównej.</li>
	<li>Zdjąć klemę z linii tętniczej, wlać roztwór perfuzyjny do kaniuli tętniczej, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie połączyć linię z kaniulą. Zwiększyć prędkość pompy odśrodkowej do 1 500 obr./min. Zdjąć drugą klemę z linii żyły głównej.</li>
	<li>Zdjąć klemę ze zbiornika żyły wrotnej w celu jego napełnienia. Pozwolić roztworowi perfuzyjnemu wpłynąć do kaniuli wrotnej i połączyć ją. Szczególną uwagę zwrócić na stabilny poziom płynu w zbiorniku wrotnym.</li>
	<li>Podłączyć linie ciśnieniowe do złączy Luer Lock kaniul tętniczej, wrotnej i żyły głównej.</li>
	<li>Aby odwzorować warunki fizjologiczne, podawać preparaty do odpowiedniego naczynia. Wstrzykiwać glukozę do żyły wrotnej, a nie do linii tętniczej, aby ustanowić gradient naśladujący zwiększony gradient glukozy w żyłach wrotnych i indukować syntezę glikogenu24,25.</li>
	<li>Po podłączeniu wątroby do obwodu podnieść temperaturę do 33 °C w ciągu 60 min.</li>
	<li>Dążyć do początkowego przepływu tętniczego na poziomie około 250 ml/min przy 40 mmHg. W trakcie perfuzji, po zwiększeniu ciśnienia do 70 mmHg, przepływ ten może osiągnąć 700 ml/min.</li>
	<li>Przy temperaturze początkowej dążyć do przepływu w żyle wrotnej wynoszącego 500-600 ml/min przy 3-5 mmHg. Po podniesieniu temperatury monitorować przepływ wrotny, który wzrośnie do 1 100 ml/min przy 4-6 mmHg. Unikać przekraczania fizjologicznych wartości ciśnienia wrotnego (około 8 mmHg), aby chronić fenestracje sinusoidalne26. Unikać przekraczania całkowitego przepływu powyżej 2 000 ml/min, aby zapobiec uszkodzeniu organu. Ustawić odpływ na -2 mmHg poprzez obniżenie głównego zbiornika, aby zapobiec zastojowi w wątrobie spowodowanemu funkcjonalną niedrożnością odpływu.</li>
	<li>Dodać komponent dializacyjny do obwodu w celu wyrównania parametrów roztworu perfuzyjnego do określonych wartości27. Ustawić przepływ dializatu na 500 ml/godz. Szczególnie zadbać o dostosowanie odpływu dializy tak, aby roztwór perfuzyjny nie był ani rozcieńczany, ani zagęszczany. W ciągu pierwszej godziny perfuzji należy uważnie obserwować główny zbiornik!</li>
	<li>Zapewnić homogeniczną oksygenację tkanki, aby przywrócić i utrzymać funkcję organu, stosując mieszaninę gazową składającą się głównie z O2 (95-98%) i CO2 (2-5%). Stosować zmienny skład gazu podczas perfuzji, ponieważ wątroba zmienia swój metabolizm i zapotrzebowanie na pH w trakcie procesu.</li>
	<li>Utrzymywać niskie pH na początku perfuzji w celu ochrony organu, stosując koncepcję paradoksu pH28 i unikając ciężkiego uszkodzenia tkanki, które może wystąpić w wyniku szybkiego przejścia na pH fizjologiczne podczas reoksygenacji, ponieważ po przechowywaniu w roztworze UW organ ma pH kwasicze poniżej 7. Stopniowo obniżać ciśnienie parcjalne CO2 do 25-30 mmHg, tak aby pH osiągnęło poziom fizjologiczny w ciągu 1 godziny.</li>
	<li>Dodać wodorowęglan sodu lub potasu do obwodu, aby uzyskać fizjologiczne stężenie standardowego wodorowęglanu w roztworze perfuzyjnym. Wstrzykiwać go ostrożnie, prowadząc regularną kontrolę gazometrii i elektrolitów.</li>
	<li>Monitorować perfuzję poprzez okresowe analizy gazometryczne krwi żylnej i tętniczej oraz oznaczenia AST. Venozowe PO2 powinno pozostawać powyżej 175 mmHg podczas perfuzji. Monitorować przepływ i ciśnienie w naczyniach; stabilną perfuzję stwierdza się poprzez stały opór naczyniowy.</li>
	<li>Utrzymywać stabilność systemu perfuzyjnego do 8 godzin. Na koniec okresu perfuzji ex vivo schłodzić system perfuzyjny do 20 °C, a po odłączeniu drenów obwodu od wątroby, wypłukać roztwór perfuzyjny z wątroby za pomocą lodowatego roztworu UW. Przechowywać wątrobę ponownie na lodzie w sterylnym worku na organy.</li>
</ol>

<ol><li>, Department of Health and Human Service, Organ Procurement and Transplantation Service. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://optn.transplant.hrsa.gov">http://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2013).</li>
<li>Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplants%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation in the United States.</a> Clinical Transplants. , 17-28 (2005).</li>
<li>Maheshwari, A., Maley, W., Li, Z., Thuluvath, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+and+outcomes+of+liver+transplantation+from+donors+after+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Biliary complications and outcomes of liver transplantation from donors after cardiac death.</a> Liver Transpl. 13 (12), 1645-1653 (2007).</li>
<li>Reich, D. J., Hong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+donation+after+cardiac+death+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current status of donation after cardiac death liver transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (3), 316-321 (2010).</li>
<li>Grewal, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+using+controlled+donation+after+cardiac+death+donors%3A+an+analysis+of+a+large+single-center+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation using controlled donation after cardiac death donors: an analysis of a large single-center experience.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1028-1035 (2009).</li>
<li>Nguyen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+of+donation+after+cardiac+death+liver+allografts+from+a+single+center%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes of donation after cardiac death liver allografts from a single center.</a> Clin Transplant. 23 (2), 168-173 (2009).</li>
<li>Heidenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+and+risk+factors+for+ischemic-type+biliary+lesions+following+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Incidence of and risk factors for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation.</a> Transpl Int. 23 (1), 14-22 (2010).</li>
<li>Moench, C., Uhrig, A., Lohse, A. W., Otto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CC+chemokine+receptor+5delta32+polymorphism-a+risk+factor+for+ischemic-type+biliary+lesions+following+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">CC chemokine receptor 5delta32 polymorphism-a risk factor for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation.</a> Liver Transpl. 10 (3), 434-439 (2004).</li>
<li>Iacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic%2C+immunological+and+clinical+risk+factors+for+biliary+strictures+following+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Genetic, immunological and clinical risk factors for biliary strictures following liver transplantation.</a> Liver Int. 32 (8), 1253-1261 (2012).</li>
<li>Heidenhain, C., Puhl, G., Moench, C., Lautem, A., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+Receptor-5Delta32+Mutation+is+No+Risk+Factor+for+Ischemic-Type+Biliary+Lesion+in+Liver+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Chemokine Receptor-5Delta32 Mutation is No Risk Factor for Ischemic-Type Biliary Lesion in Liver Transplantation.</a> J Transplant. , (2009).</li>
<li>Hashimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+tissue+plasminogen+activator+in+liver+transplantation+from+donation+after+cardiac+death+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Use of tissue plasminogen activator in liver transplantation from donation after cardiac death donors.</a> Am J Transplant. 10 (12), 2665-2672 (2010).</li>
<li>Staib, W., Scholz, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStaib%2C+W+%22Stoffwechsel+der+perfundierten+Leber%22">Stoffwechsel der perfundierten Leber</a>. , Springer. (1968).</li>
<li>Brauer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver.</a> Annu Rev Physiol. 18, 253-278 (1956).</li>
<li>Boehnert, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+acellular+ex+vivo+liver+perfusion+reduces+liver+and+bile+duct+injury+of+pig+livers+retrieved+after+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death.</a> Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).</li>
<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+in+human+liver+transplantation%3A+the+first+clinical+series%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: the first clinical series.</a> Am J Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).</li>
<li>Fondevila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+oxygenated+machine+perfusion+in+porcine+donation+after+circulatory+determination+of+death+liver+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hypothermic oxygenated machine perfusion in porcine donation after circulatory determination of death liver transplant.</a> Transplantation. 94 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Rougemont, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hour+hypothermic+oxygenated+perfusion+%28HOPE%29+protects+nonviable+liver+allografts+donated+after+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">One hour hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects nonviable liver allografts donated after cardiac death.</a> Ann Surg. 250 (5), 674-683 (2009).</li>
<li>Chung, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+kidney+to+the+normothermic+ex+vivo+perfused+porcine+liver+model+does+not+increase+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Addition of a kidney to the normothermic ex vivo perfused porcine liver model does not increase cytokine response.</a> J Artif Organs. 15 (3), 290-294 (2012).</li>
<li>Brockmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+perfusion%3A+a+new+paradigm+for+organ+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Normothermic perfusion: a new paradigm for organ preservation.</a> Ann Surg. 250 (1), 1-6 (2009).</li>
<li>Hessheimer, A. J., Fondevila, C., García-Valdecasas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+machine+liver+perfusion%3A+are+we+warming+up%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal machine liver perfusion: are we warming up.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (2), 143-147 (2012).</li>
<li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+normothermic+liver+perfusion%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo normothermic liver perfusion: an update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+performing+experimental+surgery+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Best practices for performing experimental surgery in swine.</a> J Invest Surg. 26 (2), 63-71 (2013).</li>
<li>Smith, A. C., Swindle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+swine+for+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of swine for the laboratory.</a> ILAR J. 47 (4), 358-363 (2006).</li>
<li>Cywes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intraportal+glucose+infusion+on+hepatic+glycogen+content+and+degradation%2C+and+outcome+of+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of intraportal glucose infusion on hepatic glycogen content and degradation, and outcome of liver transplantation.</a> Ann Surg. 216 (3), 235-246 (1992).</li>
<li>Ishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+oral%2C+peripheral+intravenous%2C+and+intraportal+glucose+on+hepatic+glucose+uptake+and+insulin+and+glucagon+extraction+in+conscious+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential effects of oral, peripheral intravenous, and intraportal glucose on hepatic glucose uptake and insulin and glucagon extraction in conscious dogs.</a> J Clin Invest. 72 (2), 590-601 (1983).</li>
<li>Morsiani, E., Aleotti, A., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+and+ultrastructural+observations+on+the+rat+liver+after+two-thirds+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic and ultrastructural observations on the rat liver after two-thirds partial hepatectomy.</a> J Anat. 4 (Pt 4), 507-515 (1998).</li>
<li>Schön, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+after+organ+preservation+with+normothermic+extracorporeal+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion.</a> Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).</li>
<li>Currin, R. T., Gores, G. J., Thurman, R. G., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+acidotic+pH+against+anoxic+cell+killing+in+perfused+rat+liver%3A+evidence+for+a+pH+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox.</a> FASEB J. 5 (2), 207-210 (1991).</li>
<li>Derveaux, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+ex+vivo+vascular+resistance+reflect+viability+of+non-heart-beating+donor+livers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Does ex vivo vascular resistance reflect viability of non-heart-beating donor livers?</a> Transplant Proc. 37 (1), 338-339 (2005).</li>
<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+Machine+Preservation+of+Human+Liver+Allografts%3A+Markers+of+Reperfusion+Injury+%5Babstract%23+1282%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transpl%22%5BJournal%5D)">Hypothermic Machine Preservation of Human Liver Allografts: Markers of Reperfusion Injury [abstract# 1282].</a> Am J Transpl. 7, Suppl 2. 476(2007).</li>
<li>Tolboom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+machine+perfusion+at+both+20%C2%B0C+and+30%C2%B0C+recovers+ischemic+rat+livers+for+successful+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation.</a> J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).</li>
<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+microcirculation%3A+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol Rev. 89 (4), 1269-1339 (2009).</li>
<li>Jamieson, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+and+normothermic+perfusion-preliminary+experiments+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis and normothermic perfusion-preliminary experiments in a porcine model.</a> Transplantation. 92 (3), 289-295 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W modelu świni, który naśladuje przeszczep wątroby DCD, wykazaliśmy, że subnormotermiczna perfuzja wątroby za pomocą roztworu perfuzji komórkowej powoduje stabilne parametry perfuzji, minimalne uszkodzenie hepatocytów i aktywny metabolizm wątrobowy. Udowodniono, że nasz subnormotermiczny zestaw perfuzji odzyskuje homeostazę i metabolizm komórek wątrobowych. Magazynowanie glikogenu zostaje przywrócone, a metabolity są usuwane.
Perfuzja wątroby ex vivo jako technika konserwacji po raz pierwszy daje możliwość oceny markerów funkcji przeszczepu i uszkodzenia podczas konserwacji narządu i przed przeszczepem. Oprócz makroskopowej oceny jednorodności perfuzji przeszczepu, wartości przepływu stanowią dobry wskaźnik żywotności przeszczepu i zakresu uszkodzenia niedokrwiennego, którego doznał wcześniej29. Zużycie tlenu i produkcja żółci są markerami funkcji metabolicznych. Poziomy enzymów wątrobowych, takich jak AspAT, można wykorzystać do oceny stopnia i dynamiki uszkodzenia komórek wątroby30. Ta dokładna ocena przeszczepu może pozwolić na wiarygodne rozróżnienie między narządami brzeżnymi nadającymi się do przeszczepu i nienadającymi się do przeszczepu.
Wybraliśmy temperaturę subnormotermiczną 33 °C w naszym systemie perfuzyjnym, ponieważ temperatura ta jest wystarczająca, aby umożliwić metabolizm, a także syntezę ATP i glikogenu. Jednocześnie zapewnia zmniejszone zapotrzebowanie na tlen w porównaniu z normotermicznymi ustawieniami perfuzji, co zapewnia dodatkowe bezpieczeństwo przed uszkodzeniem niedokrwiennym. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że temperatury perfuzji powyżej 30 °C minimalizują uszkodzenia niedokrwienne zimna i zapewniają wystarczającą aktywność metaboliczną31.
W przeciwieństwie do innych grup, nie używaliśmy krwi pełnej jako perfuzatu, ale normo-osmotycznego roztworu albuminy (Steen) z umytymi i przefiltrowanymi czerwonymi krwinkami. Wykluczając składniki osocza, a także trombocyty i leukocyty, roztwór perfuzyjny ma na celu zminimalizowanie sygnalizacji prozapalnej podczas perfuzji ex vivo .
Oprócz oceny przeszczepu, stabilne warunki perfuzji przez kilka godzin umożliwiają leczenie przeszczepem. Wykazano, że liczne cząsteczki osłabiają uszkodzenia reperfuzyjne w warunkach eksperymentalnych32. Jednak prawie żaden schemat leczenia nie trafił jeszcze do praktyki klinicznej. Jednym z powodów wydaje się być brak możliwości zastosowania tych zabiegów podczas przechowywania w chłodni. Metabolicznie aktywna wątroba w systemie perfuzji ex vivo jest optymalna do stosowania każdego rodzaju leczenia. W związku z tym możliwe jest nie tylko leczenie mające na celu złagodzenie warunków reperfuzji, takich jak osłabienie aktywności komórek Kupffera lub wymiatanie reaktywnych form tlenu, ale także leczenie, takie jak terapia genowa w celu kondycjonowania przeszczepu, np. przed nawrotem wirusowego zapalenia wątroby typu C. Inne potencjalne strategie mogą obejmować zmniejszenie stłuszczenia w okresie perfuzji ex vivo 33.
Podsumowując, perfuzja wątroby ex vivo jest nowatorską strategią mającą na celu zminimalizowanie uszkodzenia niedokrwiennego zimna i ocenę brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem wątroby. Ustawienie perfuzji ex vivo zapewnia wyjątkową możliwość naprawy i kondycjonowania przeszczepów przed przeszczepem.

Przeszczep wątroby jest jedyną opcją leczenia dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością wątroby lub zaawansowanym rakiem wątrobowokomórkowym. W ciągu ostatnich 25 lat liczba kandydatów z list oczekujących stopniowo rosła i przewyższała liczbę dostępnych przeszczepów. Liczba dawców bijących sercem zmniejszyła się w ciągu ostatniej dekady. W tym samym czasie wzrosła liczba przeszczepów brzeżnych, takich jak dawstwo po śmierci sercowej (DCD), a także starych i stłuszczonych wątrob o1,2.
Często odmawia się przeszczepów brzeżnych do przeszczepu wątroby ze względu na większe prawdopodobieństwo braku lub opóźnionej funkcji przeszczepu pierwotnego. W przeszczepach DCD szczególny niepokój budzi rozwój niedokrwiennych zwężeń dróg żółciowych (ITBS). Przy konwencjonalnej technice statycznej konserwacji na zimno ITBS występują w około 10-40% przeszczepów DCD. U większości pacjentów ITBS prowadzi do ponownego przeszczepu lub śmierci pacjenta. Szczególnie przedłużające się okresy niedokrwienia ciepła i zimna są czynnikami ryzyka ITBS3-7. Wiek dawcy, predyspozycje genetyczne (takie jak CCR5 delta 32) oraz wybór rozwiązania konserwującego zostały również omówione jako dodatkowe czynniki ryzyka7-10. Częściowa mikrozakrzepica naczyń okołożółciowych została zasugerowana jako potencjalny mechanizm ITBS po przeszczepieniu wątroby z przeszczepami DCD11.
Przed klinicznym wprowadzeniem transplantacji wątroby, perfuzje wątroby ex vivo były wykorzystywane do badania metabolizmu i fizjologii wątroby12,13. Po tym, jak przeszczep wątroby znalazł drogę do środowiska klinicznego w latach sześćdziesiątych XX wieku, podjęto niezliczone próby wykorzystania perfuzji wątroby ex vivo jako metody konserwacji, naśladując fizjologiczne warunki odżywiania i natlenienia. Jego przydatność do konserwacji przeszczepów brzeżnych była badana w ostatniej dekadzie, ale nie trafiła do standardowej opieki klinicznej. Niedawno opisaliśmy zmniejszenie uszkodzenia dróg żółciowych po przeszczepieniu wątroby DCD poprzez konserwację perfuzją ex vivo 14. Zastosowano różne podejścia do roztworu perfuzyjnego. Wybór obejmuje zarówno roztwory komórkowe, takie jak krew pełna od dawcy zwierzęcego lub upakowane krwinki czerwone w połączeniu z ludzkim osoczem, jak i podejścia bezkomórkowe, takie jak roztwór maszynowy University of Wisconsin, roztwór IGL lub roztwór Steena14-19.
Temperatura waha się od 4 do 37 °C20. Nomenklatura w hipotermii, subnormotermii i normotermii jest bardzo zmienna i niespójna. Wszystkie różne techniki, roztwory i ustawienia temperatury mają na celu 1) stabilne warunki perfuzji, 2) wystarczające natlenienie i 3) przywrócenie funkcji narządów. Zwiększona zdolność konserwatorska, a także zdolność oceny i leczenia narządów podczas perfuzji normotermicznej i subnormotermicznej wiąże się z większą złożonością techniczną i kosztami w porównaniu z perfuzją hipotermiczną20,21.
W ciągu ostatnich 4 lat opracowaliśmy subnormotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo. System może być używany do 1) "doładowania" zawartości energii w wątrobie, 2) oceny jakości przeszczepu oraz 3) naprawy brzeżnych wątrob przed przeszczepem. Poniższy protokół zawiera wszystkie informacje dotyczące stabilnej perfuzji wątrobowej.

<table><tbody><tr><td>obieg</td><td>Maquet (Hirrlingen, GER)</td><td>zbiornik główny wykonany na zamówienie</td><td>(3 L, odpływ 3/8") 
Zbiornik portalowy (1,5 L, 1/4", odpływ) 
Pompa odśrodkowa 
dotleniacz 
filtr likocytów </td></tr><tr><td>Rurka (1/4" x 1/16")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>Rurka (3/8" x 3/32")</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>Łączniki rurek</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td></td><td>różne rozmiary</td></tr><tr><td>Filtr dializacyjny, Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>STEEN roztwór</td><td>XVIVO (G&ouml; teborg, SWE)</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>koncentratu kwasu dializacyjnego A</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>Aminokwas, Travasol 10%</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P2256</td><td>1,1 g</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40 000 iU</td></tr><tr><td>Wapń glukonian</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Insulina szybko działająca</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td>1,000 iU</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Sukces transplantacji wątroby doprowadził do dramatycznego niedoboru narządów. W większości regionów transplantacyjnych 20-30% pacjentów znajdujących się na liście oczekujących na przeszczep wątroby umiera bez otrzymania przeszczepu narządu lub zostaje skreślonych z listy z powodu progresji choroby. Jedną ze strategii zwiększania puli dawców jest wykorzystanie przeszczepów marginalnych, takich jak stłuszczenie wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub dawstwo po śmierci sercowej (DCD). Obecna technika konserwacji polegająca na przechowywaniu statycznym w niskiej temperaturze jest słabo tolerowana przez wątroby brzeżne, co prowadzi do znacznego uszkodzenia narządów. Ponadto przechowywanie narządów w chłodnych warunkach statycznych nie pozwala na ocenę lub naprawę przeszczepu przed przeszczepem.
Te niedociągnięcia w zachowaniu zimnej elektrostatyczności wzbudziły zainteresowanie konserwacją narządów z ciepłą perfuzją w celu zmniejszenia uszkodzeń niedokrwiennych spowodowanych zimnem, oceny przeszczepów wątroby podczas konserwacji i zbadania możliwości naprawy wątroby brzeżnej przed przeszczepem. Optymalne warunki ciśnienia i przepływu, temperatura perfuzji, skład roztworu perfuzyjnego i potrzeba nośnika tlenu były w przeszłości kontrowersyjne.
Pomimo obiecujących wyników w kilku badaniach na zwierzętach, złożoność i koszty uniemożliwiły do tej pory szersze zastosowanie kliniczne. Ostatnio, dzięki ulepszonej technologii i lepszemu zrozumieniu fizjologii wątroby podczas perfuzji ex vivo, wyniki perfuzji wątroby na ciepło poprawiły się i można osiągnąć niezmiennie dobre wyniki.
Ten artykuł dostarczy informacji na temat pobierania wątroby, technik przechowywania i izolowanej perfuzji wątroby u świń. Zilustrujemy a) wymagania dotyczące zapewnienia wystarczającego dopływu tlenu do narządu, b) względy techniczne dotyczące maszyny do perfuzji i roztworu perfuzyjnego oraz c) biochemiczne aspekty izolowanych narządów.

Poniżej przedstawiamy wyniki 5 eksperymentów z perfuzją przeszczepów DCD po 45 min ciepłego i 4 h zimnego niedokrwienia przed rozpoczęciem subnormotermicznej perfuzji ex vivo.
Głównym celem perfuzji wątroby ex vivo jest zapewnienie organowi odpowiedniej podaży tlenu. Niedokrwienie powoduje skurcz naczyń, co zwiększa opór perfuzyjny. Osiągnięcie stałych przepływów naczyniowych przy stabilnych ciśnieniach jest dobrym wskaźnikiem właściwego natlenienia. W okresie indukcji trwającym 1-2 h roztwór perfuzyjny oraz organ są ogrzewane do 33 °C, co zmniejsza opór naczyniowy wątroby. Po osiągnięciu docelowej temperatury 33 °C wartości przepływu stabilizują się na stałym, niemal fizjologicznym poziomie przez pozostały czas perfuzji wynoszący 6 h (Ryciny 3A-3D).
W tym samym czasie organ staje się metabolicznie aktywny. Rysunek 4A przedstawia żylne pO2, będące markerem zużycia tlenu. W ciągu pierwszych 2 hr żylne pO2 spada do stałego poziomu plateau. W tym metabolicznie aktywnym stanie wątroba zaczyna produkować żółć (Rysunek 4B). Dializator zapewnia zrównoważoną homeostazę elektrolitową (Rysunki 4C-4D). Początkowa hiperkaliemia zostaje szybko zniwelowana. Pomiar AST online służy do monitorowania uszkodzeń hepatocytów. Rysunek 5 wykazuje jedynie niewielki liniowy wzrost AST w całym okresie perfuzji. Barwienie H&amp;E po 6 hr perfuzji ujawnia nekrozę hepatocytów &lt;5 % przy zachowanej strukturze zrazikowej i sinusoidalnej (Rysunek 6). Barwienie PAS w tym samym punkcie czasowym wykazuje odnowione zapasy glikogenu komórkowego w porównaniu do wyczerpanych zapasów w przeszczepach DCD przechowywanych w zimnie (Rysunek 7).
<img alt="Cztery wykresy przedstawiające zmiany przepływu i ciśnienia w tętnicy wątrobowej (HA) i żyle wrotnej (PV) w czasie." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przepływy i ciśnienia perfuzyjne (n = 5, słupki błędów wskazują odchylenie standardowe). (A,B) Przepływ i ciśnienie w tętnicy wątrobowej (HA): Podczas fazy ogrzewania w ciągu pierwszych 1-2 hr przepływ wzrasta przy stabilnym ciśnieniu i pozostaje stały w dalszym czasie. Analizując spadek ciśnienia w żyle wrotnej (C), wzrost przepływu w HA pod koniec perfuzji może być autoregulacyjną reakcją wątroby. (C,D) Przepływ w żyle wrotnej (PV) wzrasta analogicznie do przepływu w HA podczas pierwszych 2 hr ogrzewania. Ciśnienia pozostają względnie stabilne.
<img alt="Wykresy liniowe przebiegu czasowego ilustrujące zmiany pO2 w żyle, przepływu żółci oraz poziomu sodu i potasu." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Monitorowane parametry (n = 5, słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe). (A) Wartość pO2 w żyle, będąca markerem zapotrzebowania na tlen i aktywności metabolicznej, spada w początkowej fazie ogrzewania ze względu na aktywację metabolizmu komórkowego; w dalszej części procesu pozostaje stabilna. (B) Produkcja żółci jako marker aktywności metabolicznej rozpoczyna się przy temperaturach około 30 °C, a zatem między pierwszą a drugą godziną perfuzji. (C,D) Dializator zapewnia homeostazę elektrolitową; początkowa hiperkaliemia zostaje szybko wyrównana.
<img alt="Wykres poziomu AST w funkcji czasu, analiza aktywności enzymatycznej z trendem w ciągu 6 godzin." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. AST (n = 5, słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe). AST jest czułym markerem uszkodzenia hepatocytów; niewielki wzrost sugeruje brak istotnego uszkodzenia podczas perfuzji ex vivo.
<img alt="Porównanie histologiczne tkanki wątroby, obraz mikroskopowy, analiza różnic w strukturze komórkowej." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Barwienie H&amp;E (powiększenie 20X). (A) Próbka wątroby z grupy sham przed ciepłym niedokrwieniem, jeden reprezentatywny zrazik wątrobowy z zachowaną architekturą. (B) Próbka wątroby po 45 min ciepłego niedokrwienia, 4 h zimnego niedokrwienia i 6 h perfuzji subnormotermicznej; architektura zrazikowa jest zachowana, bez martwicy i z jedynie minimalnym obrzękiem komórek, przestrzenie naczyniowe są lekko poszerzone w porównaniu z próbką sham.

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Celem tej procedury jest zachowanie i ocena przeszczepu wątroby w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie przeszczepu wątroby od świni dawcy. W drugim etapie wątroba jest kaniulowana, a następnie przeszczep jest podłączany do obwodu perfuzji ex vivo.W ostatnim etapie właściwości perfuzji i charakterystyka przeszczepu wątroby są monitorowane pod kątem pożądanego czasu perfuzji. Ostatecznie stosuje się poziomy aminotransferazy asparaginianowej lub ST oraz analizy histologiczne biopsji miąższu, aby wykazać zachowanie uszkodzenia i żywotność przeszczepu wątroby. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami konserwacji, takimi jak tzw. przechowywanie statyczne, jest to, że zachowanie w warunkach fizjologicznych skutkuje mniejszymi uszkodzeniami konserwatorskimi i umożliwia funkcjonalną ocenę i leczenie przeszczepu przed właściwym przeszczepem narządu.Natychmiast po wywołaniu śmierci sercowej przez podanie chlorku potasu należy pobrać 1,6 litra krwi od 30 do 35 kilogramowego samca świni Yorkshire do worków CPDA, zamknąć jamę brzuszną, pozostawić wątrobę w jamie brzusznej na 45 minut, aby wywołać ciepłe uszkodzenie niedokrwienne bezpośrednio przed końcem ciepłego niedokrwienia. W tym czasie czas kanuluje aortę i żyłę wrotną liniami przepłukującymi narządy. Użyj podwójnej perfuzji za pomocą ciśnienia w aorcie i worków wrotnych napędzanych grawitacją, aby przepłukać wątrobę roztworem University of Wisconsin.Następnie odetnij wątrobę świni, pozostawiając wszystkie pozostałe naczynia długie i umieść ją w worku na organy. Kanulokuj nad- i podwątrobowe części grotołaza żyły dolnej za pomocą reduktorów o wymiarach pół cala na trzy ósme cala z blokadą przynęty. Kankaniuluj żyłę wrotną i tętnicę wątrobową trzema ósmymi cala na ćwierć cala i ćwierć cala na trzy ósme cala.W tym czasie zmniejsza się również z blokadą przynęty. Następnie zamknij torebkę i przechowuj wątrobę na lodzie do czasu perfuzji. Aby skonfigurować obwód perfuzji ex vivo, podłącz odpływ głównego zbiornika do pompy odśrodkowej i komercyjnego natleniacza za natleniaczem.Podziel rurkę na dwie linie. Podłącz jedną linię do dializatora, który spływa z powrotem do głównego zbiornika. Podłącz drugą linię do filtra redukującego leukocyty.Podziel linię po redukcji leukocytów Przefiltruj na linię tętniczą w celu dostarczenia perfuzji ósmej do tętnicy wątrobowej i do linii żyły wrotnej w celu dostarczenia perfuzji ósmej do drugiego zbiornika, który spływa do żyły wrotnej przez odpływ grawitacyjny. Zacisnąć dopływ portalowy, a następnie podłączyć linię tętniczą do pętli katoworkowca żyły spływającej do głównego zbiornika. W celu odzyskania płynów ustaw temperaturę początkową obwodu i łaźni wodnej na 20 stopni Celsjusza.Następnie przykryj kąpiel nieprzepuszczalną membraną, aby zebrać wodobrzusze lub wyciek perfuse eight. Podłącz przewód ssący napędzany pompą rolkową do głównego zbiornika. Następnie zwolnij zacisk odpływowy z głównego zbiornika i napełnij obwód roztworem perfuzyjnym.Uruchom pompę odśrodkową z prędkością 1 500 obrotów na minutę, upewniając się, że całe powietrze zostało wyprowadzone z obwodu. Następnie włącz dopływ gazu do dotleniacza. Podłączenie wątroby do obwodu jest najtrudniejszą częścią procedury.Należy uważać, aby nie załamać rurki i usunąć wszelkie pęcherzyki, aby zapobiec utrudnieniu odpływu wątroby. Należy również uważnie śledzić poziom zbiornika portalowego. Nigdy nie może być pusty.Usuń wątrobę z lodu i wypłucz roztwór University of Wisconsin solą fizjologiczną. Następnie umieść wątrobę na membranie nad łaźnią wodną. Zmniejsz prędkość pompy odśrodkowej do 1000 obrotów na minutę i umieść dwa zaciski po stronie tętniczej pętli kawetoła.Następnie przeciąć rurkę między zaciskami i podłączyć oba odpływy z żyły jaskiniowej z linią kaweny kawenowskiej. Zwolnij zacisk z przewodu tętniczego. Wlej perfuse ósemkę do kaniuli tętniczej, aby pozbyć się pęcherzyków i połącz linię z kaniulą.Zwiększ pompę odśrodkową do 1 500 obrotów na minutę i zwolnij drugi zacisk z linii jaskini venner i zwolnij zacisk ze zbiornika żyły wrotnej, aby go napełnić. Pozwól, aby roztwór perfuzyjny wlał się do kaniuli wrotnej, a następnie podłącz go. Dbanie o utrzymanie stabilnego poziomu płynów w zbiorniku portalowym.Po podłączeniu wątroby do obwodu należy podnieść temperaturę łaźni wodnej do 33 stopni Celsjusza w ciągu następnych 60 minut. Celuj w początkowy przepływ tętniczy około 250 mililitrów na minutę przy 40 milimetrach słupa rtęci. Podczas perfuzji może to osiągnąć 700 mililitrów na minutę.Gdy ciśnienie wzrośnie do 70 milimetrów słupa rtęci, należy dążyć do przepływu żył portowych od 500 do 600 mililitrów na minutę przy trzech do pięciu milimetrach słupa rtęci. Po podniesieniu temperatury przepływ żylny w porcie wzrośnie do 1 100 mililitrów na minutę. Obniż główny zbiornik, aby ustawić odpływ na minus dwa miligramy rtęci, aby zapobiec przekrwieniu wątroby przez funkcjonalną niedrożność odpływu, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie zostały złapane w rurkę kawałową.Ustaw ósemkę dializy na 500 mililitrów na godzinę. Należy zwrócić uwagę na takie dostosowanie odpływu z dializy, aby PERFUSE ósemka nie była ani rozcieńczona, ani zagęszczona. Utrzymuj niskie pH na początku perfuzji, aby chronić narząd.Ciągłe dostosowywanie ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla do 25 do 30 milimetrów słupa rtęci, tak aby pH osiągnęło poziom fizjologiczny w ciągu godziny. Aby naśladować warunki fizjologiczne, w sposób ciągły wstrzykuj glukozę i insulinę do żyły wrotnej. Ostrożnie wstrzyknąć wodorowęglan sodu lub potasu do obwodu pod powtarzającą się kontrolą krwi, gazów i elektrolitów oraz monitorować perfuzję za pomocą okresowego gazometrii krwi żylnej i tętniczej oraz analiz ST.Monitoruj przepływ naczyniowy i ciśnienie. Stabilna perfuzja utrzyma stały opór naczyniowy pod koniec okresu perfuzji ex vivo. Wyłącz system perfuzyjny, a następnie po odłączeniu rurki od wątroby, przepłucz PERFUSE ósemkę podwójnie z wątroby lodowatym roztworem University of Wisconsin.Na koniec przechowuj wątrobę na lodzie w sterylnej torbie na narządy przed przeszczepem. Osiągnięcie stałych przepływów naczyniowych przy stabilnym ciśnieniu jest dobrym wskaźnikiem odpowiedniego natlenienia. Po osiągnięciu temperatury docelowej 33 stopni Celsjusza wartości przepływu utrzymują się na stałym, niemal fizjologicznym poziomie przez pozostałą część okresu perfuzji, w tym samym czasie narząd staje się aktywny metabolicznie.Ten wykres przedstawia żylne ciśnienie parcjalne tlenu, marker zużycia tlenu. W ciągu pierwszych dwóch godzin żylne ciśnienie parcjalne tlenu spada do stałego wówczas plateau. W tym metabolicznie aktywnym stanie wątroba zaczyna wytwarzać żółć, a dializator zapewnia zrównoważoną homeostazę elektrolitów.Internetowy pomiar A ST służy jako monitor uszkodzenia komórek wątroby. Na przykład w tym eksperymencie obserwuje się tylko płytki wzrost A ST w całym okresie perfuzji. Barwienie H i E po sześciu godzinach perfuzji ujawnia martwicę hepatocytów mniejszą niż 5% z nienaruszoną strukturą zrazikową i sinusoidalną.Barwienie BAS perfundowanej wątroby ex vivo w tym samym punkcie czasowym wykazuje uzupełnione magazynowanie glikogenu komórkowego w porównaniu z wyczerpanym magazynowaniem obserwowanym w zakonserwowanych na zimno przeszczepach śmierci sercowej dawcy. Po tej procedurze można wykonać model reperfuzji narządów, taki jak przeszczep wątroby, w celu zbadania wpływu perfuzji wątroby ex vivo na uszkodzenie reperfuzyjne i funkcję narządów.

technique-subnormothermic-ex-vivo-liver-perfusion-for-storage

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Technika subnormotermicznej ex vivo perfuzji wątroby w celu przechowywania, oceny i naprawy marginalnych szczepionów wątroby

Badanie fizjologii organów zwierzęcych można uzyskać, przeprowadzając eksperymentalny system perfuzji ex vivo. Dodanie nerki świni, jako narządu homeostatycznego, do naszego wcześniej opracowanego modelu perfuzji wątroby ex vivo, może być głównym krokiem w kierunku osiągnięcia lepszego środowiska fizjologicznego.

Etapy autologicznego eksperymentu ex vivo z perfuzją wątroby i nerek świni

Tutaj prezentujemy protokół opisujący natlenioną perfuzję ex situ przeszczepów wątroby dawcy. Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku dotyczący pozyskania i przygotowania przeszczepu wątroby do perfuzji maszynowej, przygotowania płynu perfuzyjnego, zalania maszyny perfuzyjnej i przeprowadzenia natlenionej normotermicznej perfuzji maszynowej przeszczepu wątroby.

Ex situ Perfuzja maszynowa Normothermiczna wątroby dawcy

Opisujemy metodę perfuzji ex vivo ludzkich przeszczepów wątroby w temperaturze subnormotermicznej (21 °C).

Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

Poważny niedobór organów spowodował zwiększone wykorzystanie brzeżnych przeszczepów nerek do przeszczepów. Wywołało to zainteresowanie alternatywnymi metodami przechowywania, ponieważ szczególnie przeszczepy brzeżne słabo tolerują przechowywanie w niskiej temperaturze. Technika normotermicznej perfuzji nerek ex vivo (NEVKP) stanowi nowatorską metodę konserwacji przeszczepów nerek przed przeszczepem.

Normothermiczna perfuzja nerek ex vivo w celu zachowania przeszczepów nerek przed przeszczepem

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) prawie nie zbadano pod kątem zachowania alloprzeszczepów trzustki. Przedstawiamy innowacyjną technikę konserwacji alloprzeszczepów trzustki przed przeszczepem.

Normothermiczna perfuzja trzustki ex vivo w celu zachowania alloprzeszczepów trzustki przed przeszczepem

Opisany tutaj świński model normotermicznej perfuzji maszynowej wątroby (NMP) może być z powodzeniem wykorzystany do badania NMP jako strategii zachowania, narzędzia do oceny żywotności i platformy do naprawy narządów. Ma wysoką wartość translacyjną, jednak jest trudny technicznie i pracochłonny.

Chorobowa normemmiczna izolowana perfuzja wątroby u świń

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Ten protokół przedstawia metodologię tworzenia modelu świń wykorzystującego zmienną perfuzję maszynową (MP) w celu zachowania wątroby dawcy, a następnie ortotopowego przeszczepu wątroby (OLTx). Ma on na celu zwiększenie wskaźnika powodzenia OLTx przy użyciu dawstwa wątroby po śmierci krążeniowej (DCD) i ustanowienie stabilnego modelu.

Zachowanie wątroby od dawców świń po śmierci krążeniowej (DCD) metodą perfuzji i ortotopowego przeszczepu wątroby

Przedstawiamy tutaj protokół mający na celu ustanowienie długoterminowego modelu przechowywania i przeszczepu chłodzenia wątroby u susła daurskiego (DGS), który był technicznie trudny w standardowych modelach gryzoni.

Przechowywanie chłodu wątroby i przeszczep u zimno adaptujących się do zimna susłów dauriańskich

Poznaj technikę subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania i oceny brzeżnych przeszczepów. Metoda zmniejsza uszkodzenie zachowawcze i umożliwia funkcjonalną ocenę przed transplantacją.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Przeglądaj więcej filmów