Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Opisano metodę analizy degradacji białek za pomocą radioaktywnego i lucyferazy-fuzyjnego białka w ekstrakcie z jaj Xenopus oraz jej adaptację do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla małocząsteczkowych modulatorów degradacji białek.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie bezkomórkowego biochemicznego systemu ekstraktu z jaj ksenopusa do analizy obrotu beta katyny. Osiąga się to poprzez najpierw dodanie i/lub zubożenie podejrzanych efektorów do aktywowanego ekstraktu z jaj xip w celu zidentyfikowania modulatorów obrotu beta-kateniny jako drugiego etapu egzogenna in vitro, transkrybowana i translowana beta-katenina, albo znakowana radiowo S 35, albo połączona z lucyferazy, jest dodawana do ekstraktu z jaja XUS, który jest aktywnie rozkładany w warunkach natywnych. Następnie zbierz punkty czasowe, aby ocenić zmiany w beta katine i poziomach białka w czasie.

Uzyskano wyniki, które pokazują, czy konkretna modulacja ekstraktu z jaj ksenopusa zwiększa lub zmniejsza tempo beta catine i degradacji w oparciu o autoradiografię i/lub wykrywanie luminescencji. Przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami, takimi jak eksperymenty z pościgiem impulsowym lub cyklicznym pościgiem heide w hodowanych komórkach, jest to, że ekstrakt z jaj xenopus zapewnia bezkomórkowy system biochemiczny, w którym można analizować regulację białek na poziomie białka i brakuje mu dodatkowej złożoności aktywnej transkrypcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transdukcji sygnału poprzez identyfikację regulatorów kluczowych białek sygnałowych, takich jak beta catina.

Praca z ekstraktem z ksenopusu umożliwia użytkownikowi łatwe zubożenie składników szlaku i dodanie z powrotem określonej ilości białka. Aby określić jego działanie zależne od dawki, użyj świeżo przygotowanego ekstraktu z jaj XUS lub szybko rozmroź, zamrożonego ekstraktu i umieść na lodzie. Wykonaj wszystkie manipulacje na zimno, przygotuj granulowane przeciwciało lub kulki powinowactwa w jednej 10 objętości ekstraktu, aby zminimalizować rozcieńczenie ekstraktu, przed dodaniem ekstraktu należy pobrać jak najwięcej płynu z kulek.

Za pomocą żelowych końcówek ładujących z długimi, zwężającymi się końcami ekstrakt dodaje się do żywicy wiążącej GST. Obracaj mieszankę kulek ekstraktu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie obracaj mieszankę kulek ekstraktu w temperaturze 12 600 g w mikro fuge w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund.

Uważając, aby nie przenieść żadnych koralików z ekstraktem. Przenieś zubożony ekstrakt do świeżej mikrorurki fuge na lodzie. Potwierdź skuteczność zubożenia przez immuno blotting, zarówno zubożony ekstrakt, jak i perełki.

Ponieważ T i degradacja są zależne od energii, szybko wyczerpują endogenne zapasy A TP. W związku z tym, aby utrzymać solidną degradację T, należy stosować miks do odzyskiwania energii. Przygotuj 20-krotną regenerację energii lub mieszankę ER zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Szybko rozmrozić ekstrakt z jaj opus, pocierając zamrożoną rurkę między dłońmi. Umieść probówkę na lodzie tuż przed tym, jak cały ekstrakt się rozpuści. Dodaj 10 mikrolitrów regeneracji energii.

Wymieszać z podwielokrotnością ekstraktu z jaj xenopus. Dokładnie wymieszaj, szybko przesuwając rurkę i pulsując, wirując pulsacyjnie, wirując pulsacyjnie, i natychmiast umieść na lodzie. Podwielokrotność odpowiednich objętości do testu degradacji do wstępnie schłodzonych mikroprobówek do fuge na lodzie.

Aby przygotować się do znakowanych radiowo testów beta katine i degradacji, należy pobrać od dwóch do pięciu mikrolitrów ekstraktu na każdy punkt czasowy, aby przeprowadzić znakowany radiowo test degradacji beta-kateniny w ekstrakcie z jaj XUS. Najpierw przygotuj radiowe oznaczone beta-kateniną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodać jeden do trzech mikrolitrów beta-kateniny translowanej in vitro do 20 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej xip na lodzie, dokładnie mieszając szybkim ruchem probówki i krótkim impulsem wirowania.

To ważny krok. Ekstrakt z jaj XUS jest bardzo lepki, a niepełne wymieszanie wpłynie na konsystencję wyników pulsu, wirowania i umieszczania na lodzie. Rozpocznij reakcję degradacji beta-kateniny, przesuwając probówki do temperatury pokojowej w wyznaczonym punkcie czasowym.

Usunąć od jednego do pięciu mikrolitrów próbki i natychmiast wymieszać z pięciokrotną objętością buforu próbki SDS, aby zatrzymać reakcję i upewnić się, że reakcja degradacji została całkowicie zakończona. Przesuń rurkę kilka razy i energicznie wiruj, aby wykonać stronę SDS. Automatyczna radiografia przeprowadza równoważność jednego mikrolitra ekstraktu dla każdego punktu czasowego na pas.

Wyniki można określić ilościowo za pomocą obrazu, kwanty obrazu J lub innego preferowanego oprogramowania do obrazowania. Degradacja beta-kateniny w ekstrakcie z jaj xap powinna być potwierdzona zależnym od czasu spadkiem intensywności znakowanej radiowo beta kaine w paśmie. Aby przygotować lucyferazy beta-kateniny, należy zsyntetyzować lucyferazy nieznakowaną radioaktywnie oznaczoną beta-kateniną.

Korzystanie z systemu sprzężonego z translacją transkrypcji z kompletną mieszanką aminokwasów. Potwierdź produkcję beta-kateniny znakowanej lucyferazy, mierząc aktywność lucyferazy od 0,5 do jednego mikrolitra reakcji. Oceń luminescencję tła, mierząc luminescencję z nieulegającej translacji mieszaniny reakcyjnej, aby przeprowadzić test degradacji lucyferazy beta katyny Najpierw rozmrozić i przygotować ekstrakt z jaj ksenopusów, jak poprzednio.

Następnie dodać translowaną in vitro fuzję beta katyny i lucyferazy do przygotowanej reakcji xip. Wymieszaj na lodzie i dobrze wymieszaj. Tak jak poprzednio, przenieś ekstrakt do temperatury pokojowej, aby rozpocząć reakcję degradacji.

Usunąć podwielokrotność reakcji we wskazanym punkcie czasowym i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Wyjąć trzy próbki do analizy w każdym punkcie czasowym. Zamrożony ekstrakt można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do analizy.

Rozmrozić próbki na lodzie i przenieść próbki na standardowe białe 96-dołkowe płytki na lodzie przed przetworzeniem. Jeśli chodzi o aktywność lucyferazy, zależna od trzech degradacji beta-kateniny GSK GSK może być łatwo wykazana na wiele sposobów przy użyciu ekstraktu z jaj XUS. Degradacja S 35 znakowanej radiowo beta-kateniny w ekstrakcie XUS jest hamowana przez dodanie inhibitora proteasomu MG 1 32.

Mutant beta-kateniny jest stabilizowany w ekstrakcie z jaj XUS w stosunku do betainy typu dzikiego, a inhibitory białkowe GSK trzy podobnie hamują degradację beta-kateniny. Wreszcie, zubożenie GSK trzy z ekstraktu z jaj xip hamuje degradację beta-kateniny można uratować przez dodanie egzogennego GSK trzy. Test degradacji lucyferazy beta-kateninowej w ekstrakcie z jaja XIP zastosowano do oceny degradacji beta katine i lucyferazy.

Szybkość degradacji beta katine i lucyferazy jest podobna do nieznakowanego białka beta-kateniny. Regulacja degradacji w przypadku fuzji beta katine i lucyferazy jest zasadniczo identyczna z białkiem niefuzyjnym. Ponieważ dodanie chlorku litu spowodowało zahamowanie obrotu beta katyny i lucyferazy, zmiany w sygnale radioaktywnym beta catina.

Białko lucyferazy jest równoległe do zmian aktywności enzymatycznej lucyferazy w czasie Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby trzymać wszystkie odczynniki na lodzie i dokładnie wymieszać reakcje przed przystąpieniem do tego testu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować regulatory i analizować beta catine i obrót za pomocą bezkomórkowego systemu ekstraktu z jaj xenopus.