Name: Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę analizy degradacji białek w bezkomórkowym ekstrakcie z jaj Xenopus, wykorzystującą β-kateninę. Technika umożliwia identyfikację modulatorów obrotu białek w warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Laurie Lee za krytyczne przeczytanie rękopisu. T.W.C jest wspierany przez American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). M.R.B. jest wspierany przez grant szkoleniowy National Cancer Institute (T32 CA119925). SSH jest wspierany przez National Institutes of Health (R01DK078640). E.L. jest wspierany przez National Institutes of Health (R01GM081635 i R01GM103926).

<ol><li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li>
<li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-catenin+stability%3A+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+extracts%3A+a+model+system+to+study+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li>
<li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li>
<li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li>
<li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+state+of+protein+turnover%3A+It%27s+about+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li>
<li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+regulation+of+%5Bbeta%5D-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li>
<li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li>
<li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li>
<li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3%27s+phosphorylation+of+%CE%B2-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li>
<li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li>
<li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+Laevis+%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+GSK3%CE%B2+to+the+APC-%CE%B2-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li>
<li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ekstrakt z jaj Xenopus to solidny system biochemiczny do badania obrotu β-kateniny. Stężenie β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus wynosi ~25 nM2. W optymalnych warunkach ekstrakt z jaj jest zdolny do rozkładu β-kateniny z szybkością 50-100 nM/h i jest o połowę maksymalny przy 200 nM24. Istnieje kilka kluczowych etapów skutecznego odtworzenia degradacji β-kateniny przy użyciu ekstraktu z jaj Xenopus. Obejmują one: 1) wytwarzanie wysokiej jakości ekstraktu z jaj Xenopus...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis był szeroko stosowany do badania wielu procesów biologicznych komórek, w tym dynamiki cytoszkieletu, składania i importu jądra, apoptozy, metabolizmu ubikwityny, progresji cyklu komórkowego, transdukcji sygnału i obrotu białkami1-17. System ekstraktu z jaj Xenopus jest podatny na analizę biochemiczną legionu procesów komórkowych, ponieważ ekstrakt z jaj reprezentuje zasadniczo nierozcieńczoną cytoplazmę, która zawiera wszystkie niezbędne składniki cytoplazmatyczne niezbędne do przeprowadzenia tych procesów i umożliwienia badania. Jednorazowo można przygotować duże ilości ekstraktu z jaj do manipulacji biochemicznych, które wymagają dużych ilości materiału (np. oczyszczanie białka lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe)18-20. Kolejną zaletą jest to, że stężenie określonych białek w ekstrakcie z jaj Xenopus można precyzyjnie dostosować poprzez dodanie białka rekombinowanego i/lub immunodeplecję białek endogennych, w przeciwieństwie do transfekcji plazmidowego DNA, gdzie ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania jest trudna do kontrolowania. Ponadto brak dostępnych białek rekombinowanych można przezwyciężyć poprzez dodanie transkryptów kodujących interesujące nas białko, wykorzystując wysoką zdolność świeżo przygotowanego ekstraktu z jaj Xenopus do translacji egzogennie dodanego mRNA.
Regulacja degradacji białek jest kluczowa dla kontroli wielu szlaków i procesów komórkowych21. Ekstrakt z jaj Xenopus jest szeroko stosowany do badania degradacji białek, ponieważ system pozwala na wiele sposobów monitorowania obrotu białkami bez zakłócania wpływu transkrypcji i translacji. Szlak sygnałowy Wnt jest wysoce konserwatywnym szlakiem sygnałowym, który odgrywa kluczową rolę w rozwoju i chorobie. Obrót β-kateniny, głównego efektora szlaku Wnt, jest wysoce regulowany, a zwiększony poziom β-kateniny w stanie stacjonarnym ma kluczowe znaczenie dla aktywacji docelowych genów Wnt. Znaczenie degradacji β-kateniny podkreśla fakt, że mutacje w szlaku Wnt, które hamują degradację β-kateniny, występują w ~90% wszystkich sporadycznych przypadków raka jelita grubego22. Degradacja β-kateniny przez składniki szlaku Wnt może być wiernie podsumowana w ekstrakcie z jaj Xenopus w celu zbadania mechanizmu jej obrotu, a także zidentyfikowania nowych małocząsteczkowych modulatorów jej degradacji 2,19,20,23-29 .
Metody przygotowania ekstraktu z jaj Xenopus do badania cyklu komórkowego zostały opisane w poprzednich publikacjach JoVE 30-32. Obecny protokół opisuje modyfikację tych metod i jest zoptymalizowany pod kątem degradacji znakowanej radioaktywnie [35S] β-kateniny i znakowanej lucyferazą β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus. Test degradacji znakowanej radioaktywnie pozwala na bezpośrednią wizualizację poziomów białka za pomocą autoradiografii. [35] S]metionina jest włączana do białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą reakcji translacji in vitro, którą można następnie bezpośrednio dodać do reakcji degradacji. Ponadto test wymiany białek znakowanych radioaktywnie nie wymaga przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania ani znacznika epitopowego, co może wpływać na stabilność białka. Ponieważ nawet niewielkie zmiany w poziomach białka, odzwierciedlone w zmianach intensywności znakowanego radioaktywnie pasma białkowego, są łatwo wizualizowane przez autoradiografię, test degradacji znakowany radioaktywnie [35S] stanowi bardzo przydatną metodę wizualizacji obrotu białka2.
Fuzja β-kateniny z lucyferazy świetlika (dalej nazywana po prostu "lucyferazy") pozwala na precyzyjne i łatwe ilościowe pomiary poziomów białek, w celu określenia właściwości kinetycznych obrotu β-kateniny19,20 . Główną zaletą testu lucyferazy jest to, że zapewnia on silny system ilościowy, który można łatwo skalować. Poniższy protokół zapewnia proste metody oznaczania degradacji β-kateniny oraz solidną, wydajną i skuteczną metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowych modulatorów β-kateniny.

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG)</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>Rozpuszczona w wodzie destylowanej przed użyciem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td> Research <td>Products International</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Acros Organics</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td></td><td>Sigma A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml: końcówka Luer Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Igła 27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa solidna biała mikropłytka polistyrenowa, okrągłodenna</td><td></td> System do oznaczania lucyferazy Corning <td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>Przechowywać długoterminowo w temperaturze -80 & stopni; C, można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>System lizatu retikulocytów sprzężony z TNT Sp6</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>TNT Sp6 wysokowydajny system ekspresji białek kiełków pszenicy</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>Generalnie wyższa wydajność niż lizat retikulocytów&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyTag Express mieszanka do znakowania białek [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2920</td><td>Takie same warunki przechowywania jak Steady-Glo</td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik o stałym kącie nachylenia Sorvall SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115 V 50/60 Hz Miniwirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Zestaw mMachine Sp6</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-firefly Przeciwciało lucyferazy</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GSK3</td><td>Laboratoria Transdukcji BD 610201</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C Inkubator</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj xenopus

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis to dobrze scharakteryzowany, solidny system do badania biochemii różnorodnych procesów komórkowych. Ekstrakt z jaj Xenopus został wykorzystany do badania obrotu białek w wielu kontekstach komórkowych, w tym w cyklu komórkowym i szlakach transdukcji sygnału1-3. W niniejszym artykule opisano metodę izolowania ekstraktu z jaj Xenopus, która została zoptymalizowana pod kątem promowania degradacji krytycznego składnika szlaku Wnt, β-kateniny. Opisano dwie różne metody oceny degradacji białka β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus. Jedna metoda jest wizualnie pouczająca (białka znakowane radioaktywnie [35S], podczas gdy druga jest łatwiejsza do skalowania w testach wysokoprzepustowych (białka fuzyjne znakowane lucyferazą świetlika). Opisane techniki mogą być wykorzystane między innymi do oceny obrotu białek β-kateniny i identyfikacji składników molekularnych przyczyniających się do ich obrotu. Dodatkowo, zdolność do oczyszczania dużych ilości jednorodnego ekstraktu z jaj Xenopus w połączeniu z ilościowym i łatwym odczytem białek znakowanych lucyferazą pozwala na łatwe dostosowanie tego systemu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych pod kątem modulatorów degradacji β-kateniny.

Schemat degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus przedstawiono na Ryc. 2A. β-kateninę znakowaną 35S inkubowano w ekstrakcie z jaj Xenopus, w odpowiednich odstępach czasu pobierano alikwoty (równoważne 1 ml ekstraktu), a następnie próbki poddano elektroforezie SDS-PAGE oraz autoradiografii. Degradacja β-kateniny przez komponenty szlaku Wnt jest zapśredniczona przez układ ubikwityna-proteasom2, a degradacja znakowanej [35S] β-kateniny w ekstrakcie ...

Opisano metodę analizy degradacji białek za pomocą radioaktywnego i lucyferazy-fuzyjnego białka w ekstrakcie z jaj Xenopus oraz jej adaptację do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla małocząsteczkowych modulatorów degradacji białek.

Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie bezkomórkowego biochemicznego systemu ekstraktu z jaj Xenopus do analizy obrotu beta-kateniny. Jest to osiągane poprzez dodanie i/lub usunięcie w pierwszym kroku domniemanych efektorów do aktywnego ekstraktu z jaj Xenopus, aby zidentyfikować modulatory obrotu beta-kateniny; w drugim kroku do ekstraktu z jaj Xenopus, w którym zachodzi aktywna degradacja w warunkach natywnych, dodaje się egzogenną, transkrybowaną i translacyjną in vitro beta-kateninę, znakowaną radiacyjnie S 35 lub połączoną z lucyferazą. Następnie pobiera się próbki w określonych punktach czasowych, aby ocenić zmiany poziomów białka beta-kateniny w czasie.Uzyskane wyniki wskazują, czy konkretna modulacja ekstraktu z jaj Xenopus zwiększa lub zmniejsza tempo akumulacji i degradacji beta-kateniny, na podstawie autoradiografii i/lub detekcji luminescencyjnej. Przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami, takimi jak eksperymenty pulse-chase lub cykloheksymid-chase w hodowlach komórkowych, jest to, że ekstrakt z jaj Xenopus stanowi bezkomórkowy układ biochemiczny, w którym można analizować regulację białek na poziomie białkowym, a dodatkowo nie obciąża on

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Regeneracja degradacji β-kateniny w Xenopus ekstrakt z jajka

Surowe i frakcjonowane ekstrakty z jaj Xenopus mogą służyć do pozyskiwania składników niezbędnych do rekonstrukcji procesów komórkowych w celu analizy morfologicznej i biochemicznej. Do przygotowania surowego ekstraktu wykorzystuje się lizę jaj oraz wirowanie różnicowe, który z kolei służy do sporządzenia ekstraktów frakcjonowanych oraz preparatów lekkich błon.

Przygotowanie i frakcjonowanie ekstraktów z jaj Xenopus laevis

Montaż otoczki jądrowej jest kluczowym etapem cyklu podziału komórkowego; proces ten można zreplikować in vitro, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytosol oraz lekkie frakcje błonowe. Powstają w pełni uformowane jądra, zawierające otoczki jądrowe z kompleksami porów, a tak zrekonstytuowane jądra są zdolne do przeprowadzania prawidłowych procesów jądrowych.

Montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj Xenopus

Niniejszy protokół wideo prezentuje metodę generowania transgenicznych Xenopus laevis poprzez wprowadzanie transgenów do jąder plemników, a następnie transplantację jąder do niezapłodnionych komórek jajowych.

Produkcja transgenicznych Xenopus laevis poprzez integrację za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i transplantację jąder

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Poznaj metodę analizy degradacji białek w bezkomórkowym ekstrakcie z jaj Xenopus, wykorzystującą β-kateninę. Technika umożliwia identyfikację modulatorów obrotu białek w warunkach in vitro.

Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Przeglądaj więcej filmów