Name: Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Odkryj obrazowanie MALDI-MSI do analizy metabolitów w korzeniach roślin strączkowych. Ta technika pozwala wykrywać endogenne związki w tkankach Medicago truncatula i badać procesy metaboliczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr Jean-Michelowi Ané z Wydziału Agronomii UW-Madison za dostarczenie próbek Medicago truncatula. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze z grantu National Science Foundation (NSF) CHE-0957784, University of Wisconsin Graduate School i Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) oraz programu stypendialnego Romnes Faculty Research Fellowship (dla L.L.). E.G. potwierdza stypendium badawcze dla absolwentów NSF (DGE-1256259).

1. Oprzyrządowanie
<ol>
	<li>MALDI-TOF/TOF MSI. Do analizy małych cząsteczek należy użyć spektrometru masowego wyposażonego w źródło MALDI (patrz Tabela materiałów/sprzętu). Wykonuj akwizycje w trybie jonów dodatnich lub ujemnych w zależności od interesujących analitów. Określ interesujący nas zakres masowy i zbierz 500 strzałów laserowych na plamkę w odstępach 50 μm zarówno w wymiarach x, jak i y na powierzchni próbki, aby wygenerować obrazy jonów. Szerokość rastra i liczbę strzałów lasera można regulować, aby uzyskać odpowiednio wyższą rozdzielczość przestrzenną i maksymalne natężenie sygnału. Do kalibracji widm masowych należy użyć pików matrycy DHB lub wzorców wewnętrznych nałożonych na szkiełko lub bezpośrednio na tkankę.</li>
	<li>LC-MS o wysokiej rozdzielczości. (patrz Tabela Materiałów/Wyposażenia) Przeprowadzić ekstrakcje próbek za pomocą LC-MS przy użyciu LC z odwróconą fazą (RP) z kolumną C-18 lub fazy normalnej (NP) z kolumną HILIC, w zależności od interesujących analitów. Należy stosować ruchome fazy i gradienty odpowiednio do określonego typu próbki. Wykonywanie akwizycji w trybie jonów dodatnich lub ujemnych w zależności od typu próbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przytnij guzek korzeniowy z rośliny, pozostawiając 3-4 mm korzenia przyczepionego do guzka.</li>
	<li>Bezpośrednio po rozbiorze należy za pomocą kleszczy umieścić tkankę w kubku kriostatu i zalać żelatyną (100 mg/ml w wodzie dejonizowanej). Istotne jest, aby tkanka była przyklejona do dna kubka bez pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Błyskawicznie zamroź tkankę, umieszczając kubek w kąpieli z suchym lodem/etanolem, aż żelatyna stwardnieje i stanie się nieprzezroczysta. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C, odciąć plastikowy kubek na kriostat i odciąć nadmiar żelatyny. Zamontuj osadzoną tkankę na uchwycie kriostatu za pomocą ilości pożywki o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) wielkości dziesięciocentówki, nie pozwalając OCT dotknąć tkanki. Umieścić w pudełku kriostatu, aż OCT zestala się.</li>
	<li>Pozostawić karkówkę i żelatynę do zrównoważenia w pojemniku kriostatu (ustawionym na -20 lub -25 °C) przez około 15 minut.</li>
	<li>Użyj kriostatu (patrz Tabela materiałów/sprzętu), aby przeciąć tkankę w przybliżeniu na grubość jednej komórki (8-20 μm w zależności od rodzaju tkanki) i rozmrozić każdy plasterek na szkle pokrytym ITO, ogrzewając tył (strona niepokryta ITO) szkiełka podstawowego z powłoką ITO na grzbiecie dłoni. Umieść stronę podgrzanego szkiełka pokrytą ITO w pobliżu zamrożonego plastra chusteczki i pozwól, aby plasterek przykleił się do szkiełka. Umieszczenie sekcji blisko siebie na suwaku zapewni lepsze wyrównanie podczas MSI.</li>
</ol>
3. Aplikacja Matrix
<ol>
	<li>Aplikacja aerografem MALDI Matrix
	<ol>
		<li>Wszystkie zabiegi aerografem powinny być wykonywane w dygestorium.</li>
		<li>Dokładnie oczyść pojemnik z roztworem aerografu i dyszę (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) metanolem i napełnij pojemnik roztworu roztworem matrycy DHB (150 mg/ml w 50% metanolu/0,1% TFA v/v).</li>
		<li>Trzymaj aerograf w odległości około 35 cm od próbki i nałóż 10-15 warstw matrycy na powierzchnię szkiełka z czasem natryskiwania 10 sekund i 30 sekund schnięcia między każdą warstwą.</li>
		<li>Po zakończeniu dokładnie wyczyść aerograf metanolem, aby uniknąć zatkania roztworu matrycy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Automatyczne natryskowanie aplikacji MALDI Matrix
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami uruchamiania dostarczonymi przez producentów automatycznego systemu opryskiwacza.</li>
		<li>Dla MSI metabolitów w brodawkach korzeniowych, stosując 40 mg/ml (w 50% metanolu/0,1% TFA v/v) DHB jako matrycę, należy ustawić temperaturę na ~80 °C, prędkość na 1 250 mm/min, natężenie przepływu na 50 μl/min, a liczbę przejść na 24. Aby uzyskać najlepsze pokrycie, zaleca się obrócenie dyszy o 90° i/lub przesunięcie dyszy o 1.5 mm między każdym przejściem. Uruchom metodę opryskiwacza. 
		Na marginesie, zastosowany tutaj specjalny system opryskiwacza podgrzewa dyszę w celu szybszego odparowania rozpuszczalnika. Gdy rozpuszczalnik odparowuje, stężenie matrycy szybko wzrasta. Matryca nałożona na próbkę za pomocą aerografu i automatycznego rozpylacza ma porównywalne stężenia.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami wyłączania dostarczonymi przez producentów automatycznego systemu opryskiwacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie sublimacji matrycy MALDI
	<ol>
		<li>Odważyć 300 mg DHB na dno komory sublimacyjnej (patrz Tabela Materiałów/Wyposażenia).</li>
		<li>Przyklej szkiełko szklane do zimnego palca (górna część komory sublimacyjnej) skrawkami tkanki skierowanymi w dół dwustronną taśmą przewodzącą. Zakryj cały tył szkiełka taśmą dwustronną, aby uzyskać równomierną przewodność, zapewniając równomierne osadzanie matrycy.</li>
		<li>Zacisnąć górną i dolną połówkę komory sublimacyjnej razem z zaciskiem C. Podłącz odkurzacz i dodaj lód i zimną wodę do górnego zbiornika.</li>
		<li>Umieść komorę sublimacyjną w płaszczu grzewczym o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Włącz pompę próżniową. Odczekaj 15 minut i włącz płaszcz grzewczy. Płaszcz grzewczy powinien osiągnąć temperaturę 120 °C w ciągu 10 minut.</li>
		<li>Po 10 minutach wyłącz ogrzewanie, zamknij zawór na podciśnienie (aby wnętrze komory pozostało pod próżnią) i wyłącz pompę próżniową.</li>
		<li>Pozwól, aby komora osiągnęła temperaturę pokojową, otwórz zawór uwalniający podciśnienie i usuń próbkę. Wielkość komory sublimacyjnej będzie determinować ilość matrycy sublimowanej do szkiełka podstawowego. Większe komory sublimacyjne (wielkości zlewki o pojemności 400 ml) zużywają około 300 mg DHB, podczas gdy mniejsze komory (wielkości zlewki 150 ml) zużywają około 100 mg DHB i będą wymagały przycięcia szkiełka tak, aby zmieściło się w komorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zaznacz wzór + na każdym rogu próbki za pomocą pisaka w płynie korekcyjnym WiteOut, który ma być używany jako "punkty uczenia". Umieść szkiełko podstawowe w płytce adaptera suwaka MALDI i wykonaj obraz optyczny próbki za pomocą skanera.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta urządzenia należy skonfigurować plik akwizycji obrazu o rozmiarze kroku 50 μm i średnicy lasera równej lub mniejszej niż rozmiar kroku rastra. W tym konkretnym instrumencie minimalne ustawienie lasera daje średnicę lasera około 10 μm, a małe ustawienie lasera ma średnicę 40-50 μm.</li>
	<li>Załaduj obraz optyczny do oprogramowania i wyrównaj płytkę z obrazem optycznym.</li>
	<li>Skalibruj przyrząd przed rozpoczęciem akwizycji, używając wspólnych jonów klastrowych matrycy, wzorców wewnętrznych lub mieszanki kalibracyjnej.</li>
	<li>Określ obszary tkanki, które mają być analizowane za pomocą MSI, w tym plamkę czystej matrycy na szkiełku, która ma być użyta jako "ślepa próba".</li>
	<li>Rozpocznij nabywanie.</li>
</ol>
5. Generowanie obrazów
<ol>
	<li>Otwórz plik obrazowania w komercyjnie dostępnym oprogramowaniu dostarczonym przez dostawcę i wyodrębnij obrazy jonów. Inne oprogramowanie typu open source jest dostępne do przetwarzania danych MSI19.</li>
</ol>
6. Identyfikacja metabolitów
<ol>
	<li>Wybierz konkretną m/z interesującego Cię ze spektrum mas za pomocą oprogramowania specyficznego dla dostawcy (patrz Tabela materiałów/wyposażenia). Analit można odróżnić od jonu matrycowego, gdy pik analitu jest wybierany ze spektrum masowego, a obrazy jonów są generowane specjalnie zlokalizowane w sekcji tkanki.</li>
	<li>Wygeneruj listę interesujących Cię analitów i przeprowadź eksperymenty MS/MS. Wykazy próbek analitów znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2 w Reprezentatywnych wynikach.</li>
	<li>Wykonaj ukierunkowaną analizę LC-MS na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości (lub MALDI-MS o wysokiej rozdzielczości, jeśli jest dostępny), aby uzyskać dokładne pomiary masy analitów będących przedmiotem zainteresowania, a także wykonaj LC-MS/MS docelowych analitów w celu uzyskania charakterystycznych wzorców fragmentacji.</li>
	<li>Przeszukaj bazę danych w celu określenia przypuszczalnych identyfikacji docelowych analitów. Przykłady baz danych metabolitów obejmują: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG i HMDB.</li>
	<li>Aby potwierdzić domniemane identyfikacje na podstawie dokładnego masowego przeszukiwania baz danych, dopasuj MS/MS z docelowych analitów do widm MS/MS standardów, literatury i/lub oprogramowania do przewidywania fragmentacji.</li>
</ol>

<ol><li>Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Intact+Tissue+Sections%3A+Moving+beyond+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope.</a> J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).</li>
<li>van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+review+of+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A concise review of mass spectrometry imaging.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).</li>
<li>Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+drugs+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75, 130-145 (2013).</li>
<li>Ye, H., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+better+health%3A+mass+spectrometry+imaging+for+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics.</a> Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).</li>
<li>Wei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+Its+Practical+Value+in+Pharmaceutical+Industry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry.</a> Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Serum+Metabolomics-Based+Diagnostic+Approach+to+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidem.+Biomar%22%5BJournal%5D)">A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).</li>
<li>West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+human+developmental+toxicity+of+pharmaceuticals+using+human+embryonic+stem+cells+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).</li>
<li>Spegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+metabolomics+analysis+of+beta-cells+implicates+the+pentose+phosphate+pathway+in+the+control+of+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release.</a> Biochem. J. 450, 595-605 (2013).</li>
<li>Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+neuroAIDS%3A+The+widening+scope+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics.</a> J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).</li>
<li>Prell, J., Poole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+of+rhizobia+in+legume+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes of rhizobia in legume nodules.</a> Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).</li>
<li>Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+analysis+of+neuropeptides+by+MALDI+FTMS+in-cell+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation.</a> Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li>
<li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+%28APSGFLGMRamide%2C+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide%29+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li>
<li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+signaling+peptides+in+single+mammalian+cells+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).</li>
<li>Neupert, S., Predel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+single+identified+neurons+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li>
<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li>
<li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li>
<li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption%2Fionization-imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li>
<li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids%3A+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1%2C5-diaminonapthalene+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3%2C4%2C5-Tetrakis%283%27%2C4%27-dihydroxylphenyl%29thiophene%3A+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li>
<li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li>
<li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+sponge%3A+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li>
<li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+%28m%2Fz+616%29+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom.+Soc.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li>
<li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li>
<li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omniSpect%3A+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jak wspomniano powyżej, przygotowanie próbki jest najbardziej krytycznym krokiem w przepływie pracy MSI. Nierównomierne osadzenie tkanki spowoduje, że w niektórych przypadkach cięcie będzie trudne lub niemożliwe. Rozmiar przekroju i odpowiedni czas równowagi mają kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności tkanki i uniknięcia fałdowania i rozdarć. Wybór matrycy i techniki aplikacji będzie odgrywał rolę w określaniu rodzajów analitów, które mają być wykrywane, rozdzielczości przestrzennej i odtwarzalności wyników. Zas...

Rozwijająca się dziedzina metabolomiki ma wiele ważnych zastosowań biologicznych, w tym odkrywanie biomarkerów, rozszyfrowywanie szlaków metabolicznych w roślinach i innych systemach biologicznych oraz profilowanie toksykologiczne4,6-10. Głównym wyzwaniem technicznym podczas badania systemów biologicznych jest badanie szlaków metabolomicznych bez ich zakłócania11. MALDI-MSI pozwala na bezpośrednią analizę nienaruszonych tkanek, co umożliwia czułe wykrywanie analitów w pojedynczych narządach12,13, a nawet w pojedynczych komórkach14,15.
Przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem w tworzeniu powtarzalnych i wiarygodnych obrazów widma masowego. Jakość obrazów w dużej mierze zależy od takich czynników, jak podłoże do zatapiania tkanek, grubość warstwy, matryca MALDI i technika nakładania matrycy. W zastosowaniach obrazowania idealna grubość przekroju to szerokość jednej komórki (8-20 μm w zależności od typu próbki). MALDI wymaga osadzenia organicznego, krystalicznego związku matrycowego, zwykle słabego kwasu, na próbce w celu wspomagania ablacji i jonizacji analitu. 16 Różne matryce zapewniają różne intensywności sygnału, jony zakłócające i skuteczność jonizacji różnych klas związków.
Technika aplikacji matrycy również odgrywa rolę w jakości obrazów widma masowego, a różne techniki są odpowiednie dla różnych klas analitów. W protokole tym przedstawiono trzy metody aplikacji matrycy: aerograf, automatyczny opryskiwacz i sublimacja. Aplikacja matrycy aerografu jest szeroko stosowana w obrazowaniu MALDI. Zaletą aplikacji matrycy aerografu jest to, że jest stosunkowo szybka i łatwa. Jednak jakość aplikacji matrycy aerografu w dużej mierze zależy od umiejętności użytkownika i zwykle jest mniej powtarzalna i powoduje dyfuzję analitów, zwłaszcza małych cząsteczek17. Automatyczne systemy natryskiwania mają podobną mechanikę do aplikacji matrycy aerografu, ale zostały opracowane w celu wyeliminowania zmienności obserwowanej przy ręcznym nakładaniu aerografu, dzięki czemu spray jest bardziej powtarzalny. Ta metoda może być czasami bardziej czasochłonna niż tradycyjna aplikacja matrycy aerografem. Zarówno ręczne systemy aerografu, jak i automatyczne systemy natryskiwania są metodami aplikacji matrycy opartej na rozpuszczalnikach. Sublimacja to technika aplikacji suchej matrycy, która staje się coraz bardziej popularna w obrazowaniu widma mas metabolitów i małych cząsteczek, ponieważ zmniejsza dyfuzję analitu; Brakuje w nim jednak rozpuszczalnika niezbędnego do ekstrakcji i obserwacji związków o większej masie18.
Pewna identyfikacja metabolitów zazwyczaj wymaga dokładnych pomiarów masy, aby uzyskać przypuszczalne identyfikacje, a następnie eksperymentów z masą tandemową (MS/MS) w celu walidacji, przy czym widma MS/MS są porównywane ze standardami, literaturą lub widmami teoretycznymi. W tym protokole o wysokiej rozdzielczości (zdolność rozdzielcza masy 60 000 przy m/z 400), chromatografia cieczowa (LC)-MS jest sprzężona z MALDI-MSI w celu uzyskania zarówno informacji przestrzennych, jak i pewnej identyfikacji endogennych metabolitów, wykorzystując korzenie i guzki korzeniowe Medicago truncatula jako system biologiczny. Eksperymenty MS/MS mogą być przeprowadzane bezpośrednio na tkance za pomocą MALDI-MSI lub na ekstraktach tkankowych za pomocą LC-MS i wykorzystywane do walidacji identyfikacji metabolitów.
Ten protokół dostarcza prostą metodę mapowania endogennych metabolitów w M. truncatula, która może być dostosowana i zastosowana do MSI małych cząsteczek w różnych typach tkanek i systemach biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>podgrzać do rozpuszczenia</td></tr><tr><td>kriostatu- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td> Szkiełka szklane <td></td></tr><tr><td>powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO)&nbsp;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (szerokość x długość x grubość)</td></tr><tr><td>Matryca kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB)</td><td>ICN Biomedicals</td><td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx? ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>Airbrush</td><td>Paasche Airbrush Company</td><td>TG-100D</td><td>w połączeniu z 75 ml stalowym pojemnikiem</td></tr><tr><td>Automatyczny system opryskiwania matrycowego - TM-Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX. TMSP. H021-U</td><td>Szczegółowe instrukcje dotyczące uruchamiania i wyłączania zostaną podane po zainstalowaniu przyrządu</td></tr><tr><td>Aparatura do sublimacji&nbsp;</td><td>Chemglass Life Science</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>Pompa próżniowa- <td></td></tr><tr><td>Alcatel 2008 Idealne</td><td>produkty próżniowe</td><td>P10976</td><td>Ciśnienie końcowe = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>Jeden przykład "oprogramowania specyficznego dla sprzedawców"</td></tr><tr><td>MALDI LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>Instrument MALDI o wysokiej rozdzielczości do dokładnych pomiarów masy</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Wysokorozdzielczy przyrząd LC-MS do dokładnych pomiarów masy</td></tr></tbody></table>

obrazowanie metodą spektrometrii mas maldi, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych medicago truncatula

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Większość technik używanych do badania małych molekuł, takich jak leki farmaceutyczne lub endogenne metabolity, wykorzystuje ekstrakty tkankowe, które wymagają homogenizacji tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, co może potencjalnie spowodować zmiany w badanych szlakach metabolicznych1. Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie analityczne, które może dostarczyć informacji przestrzennych o analitach w nienaruszonych wycinkach próbek tkanek biologicznych1-5. Technika ta jest szeroko stosowana do badania różnych rodzajów związków, w tym białek, peptydów, lipidów i małych cząsteczek, takich jak endogenne metabolity. Dzięki matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej (MALDI)-MSI można jednocześnie wykrywać rozkłady przestrzenne wielu metabolitów. W niniejszym artykule przedstawiono metodę opracowaną specjalnie do przeprowadzania nieukierunkowanych eksperymentów metabolomicznych MSI na korzeniach roślin strączkowych i guzkach korzeniowych, które mogą ujawnić wgląd w zachodzące procesy biologiczne. Przedstawiona tutaj metoda pokazuje typowy przepływ pracy MSI, od przygotowania próbki do akwizycji obrazu, i koncentruje się na etapie aplikacji matrycy, demonstrując kilka technik aplikacji matrycy, które są przydatne do wykrywania małych cząsteczek. Po wygenerowaniu obrazów stwardnienia rozsianego omawiana i demonstrowana jest analiza i identyfikacja metabolitów będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiony tutaj standardowy przepływ pracy można łatwo zmodyfikować dla różnych typów tkanek, gatunków molekularnych i oprzyrządowania.

Przegląd eksperymentalny MSI przedstawiono na Rysunku 1. Na samym początku eksperymentu kluczowym etapem jest przygotowanie próbek. Guzki są wycinane z korzenia rośliny i zatapiane w żelatynie. Tkanka musi zostać dociśnięta płasko do kasetki kriostatu, bez pęcherzyków powietrza, podczas zamrażania; zapewni to łatwiejsze i prawidłowe ustawienie tkanki podczas krojenia. Podczas krojenia tkanki istotne jest zachowanie odpowiedniej grubości przekrojów; zbyt cienkie sekcje będą się rozrywać, co naruszy integr...

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie rzetelnego, wielokrotnego obrazowania spektrometrycznego małocząsteczkowych związków w tkance korzenia rośliny. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie próbek tkanki do odpowiedniej wielkości, a w drugim kroku poprzez optymalizację i naniesienie matrycy MALDI na próbkę tkanki.Następnie próbkę poddaje się analizie MALDI MSI, a widma są zbierane z całej tkanki. Ostatnim etapem jest przetwarzanie danych, w ramach którego można zidentyfikować istotne biologicznie anality. Ostatecznie MALDI MSI służy do wykrywania endogennych metabolitów obecnych w brodawkach korzeniowych roślin strączkowych.Ta metoda pozwala na analizę metabolitów obecnych w tkance korzeniowej roślin, ale może być również zastosowana do badania małych cząsteczek i tkanek z innych systemów modelowych, w tym ssaków, skorupiaków, owadów i innych. Najpierw wyjmij wcześniej przygotowane próbki tkanek roślinnych z zamrażarki o temperaturze -80°C. Następnie odetnij plastikowy kubek do kriosztatu i usuń nadmiar żelatyny, a następnie przymocuj zatopioną tkankę do uchwytu kriosztatu, używając niewielkiej ilości (wielkości monety) medium OCT (optimal cutting temperature), d

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie spektrometryczne MALDI w badaniu metabolitów w węzłach korzeniowych Medicago truncatula

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Spektrometria mas w sprayu z liści to technika bezpośredniej analizy chemicznej, która minimalizuje przygotowanie próbki i eliminuje chromatografię, pozwalając na szybkie wykrywanie małych cząsteczek z tkanek roślinnych.

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Ta metoda wykorzystuje obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) do zrozumienia procesów metabolicznych w liściach S. alba po wystawieniu na działanie ksenobiotyków. Metoda pozwala na przestrzenną lokalizację interesujących związków i ich przewidywanych metabolitów w określonych, nienaruszonych tkankach.

Badanie metabolizmu ksenobiotyków w liściach Salix alba za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

W tym badaniu przedstawiono szereg metod przygotowania próbek DESI-MSI z roślin, a procedura instalacji montażu DESI, pozyskiwania i przetwarzania danych MSI jest szczegółowo opisana. Protokół ten może być stosowany w kilku warunkach do pozyskiwania informacji o metabolomie przestrzennym u roślin.

Wizualizacja metabolitów zidentyfikowanych w metabolomie przestrzennym tradycyjnej medycyny chińskiej przy użyciu DESI-MSI

Ten protokół miał na celu opisanie szczegółowych wytycznych dotyczących przygotowania sekcji próbek twardych nasion o niskiej zawartości wody do analizy MALDI-IMS, utrzymania pierwotnego rozkładu i obfitości analitów oraz zapewnienia wysokiej jakości sygnału i rozdzielczości przestrzennej.

Przygotowanie twardych nasion palmy do analizy spektrometrii mas metodą desorpcji laserowej/jonizacji wspomaganej matrycowo

Opracowano zaawansowaną metodę obrazowania organoidów mózgowych za pomocą spektrometrii mas (MSI), która pozwala na mapowanie rozkładów metabolitów w tych modelach. Technologia ta oferuje wgląd w szlaki metaboliczne mózgu i sygnatury metabolitów we wczesnym okresie rozwoju i choroby, obiecując głębsze zrozumienie funkcji ludzkiego mózgu.

Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu z wykorzystaniem spektrometrii mas

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Opisano preparację ex vivo do izolacji największych tętniczek oporowych mięśnia smukłego w celu badania zarówno reakcji naczyniowych na bodźce naczyniokurczące, jak i oceny podstawowych właściwości strukturalnych za pomocą pasywnej mechaniki ścian.

ex vivo Preparacja izolowanych szkieletowych mikronaczyń do badania reaktywności naczyniowej

Odkryj obrazowanie MALDI-MSI do analizy metabolitów w korzeniach roślin strączkowych. Ta technika pozwala wykrywać endogenne związki w tkankach Medicago truncatula i badać procesy metaboliczne.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Przeglądaj więcej filmów