Name: Heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj heterotopową procedurę wszczepienia błony śluzowej nosa u myszy, umożliwiającą bezpośrednie dostarczanie leków do mózgu. Ta metoda pokonuje barierę krew-mózg i wspiera badania nad terapiami układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane przez Mcihael J. Fox Foundation for Parkinson's Research 2011 Rapid Response Innovations Awards Program. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Przed operacją upewnij się, że wszystkie procedury do wykonania są zatwierdzone przez IACUC i wszelkie dodatkowe etyczne lub prawne autorytety i stosuj humanitarne praktyki leczenia zwierząt. Obejmuje to stosowanie sterylnych warunków chirurgicznych, znieczulenie myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC, smarowanie oczu myszy maścią weterynaryjną podczas operacji oraz zapewnienie opieki pooperacyjnej. Nie przystępuj do operacji, jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości, czy aspekty procedury są zatwierdzone. Wszystkie procedury wykonane w tym dokumencie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Bostońskiego.
1. Przygotowanie zwierząt i materiały chirurgiczne
<ol>
	<li>Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, które będą używane podczas operacji.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie techniki, które mają być wykonane, są zatwierdzone przez agencje regulacyjne ds. zwierząt.</li>
</ol>
2. Pobieranie przeszczepu błony śluzowej
<ol>
	<li>Wybierz genetycznie identyczną mysz w podobnym wieku co mysz eksperymentalna i poddaj ją eutanazji metodą zatwierdzoną przez IACUC (tutaj: uduszenie izofluranem, a następnie zwichnięcie szyjki macicy).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę wokół nosa głowy myszy, odsłaniając czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą wiertarki pneumatycznej zaznacz trzema liniami, z których dwie bocznie flankują obszar nosa, a trzecia w linii z oczami, która łączy dwie linie prostopadle.</li>
	<li>Wiercić brzusznie, aby oddzielić przegrodę nosową od otaczającej tkanki. Szersza ścieżka zapobiegnie uszkodzeniu błony śluzowej, ale utrudni również odizolowanie błony. Zalecane jest wąskie cięcie bliżej linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij przegrodę z przylegającej do niej tkanki i przechowuj ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. W tym czasie przeszczep można oczyścić, aby usunąć wszelką połączoną tkankę. Idealną sytuacją jest odsłonięcie nieuszkodzonych błon śluzowych po obu stronach przegrody chrzęstnej. Jeden przeszczep może dostarczyć błonę dwóm myszom, pod warunkiem, że powierzchnia błony jest wystarczająca do pokrycia miejsc kraniotomii. Zaleca się, aby przeszczep został użyty tak szybko, jak to możliwe, a badacz przechodzi do kroku 3, gdy tylko przeszczep zostanie odizolowany.</li>
</ol>
3. Chirurgiczne wszczepienie przeszczepu błony śluzowej
<ol>
	<li>Korzystając ze standardowych, aseptycznych zabiegów chirurgicznych na myszach, znieczulij i zamontuj mysz w ramce stereologicznej. Użyj około 2% izofluranu w czystym tlenie za pomocą urządzenia do znieczulania gryzoni.</li>
	<li>Unieruchom mysz w aparacie stereotaktycznym z nausznikami i uchwytem na nos. Nałóż maść okulistyczną na oczy i szoruj skórę głowy betadyną i 75% etanolem przez trzy rundy. Za pomocą nożyczek lub trymera do włosów usuń sierść na głowie. Odsłoń czaszkę żyletką i wypoziomuj głowę. Wykonaj kraniotomię powyżej miejsca mózgu, które zostanie podane. Na przykład, celując w prążkowie, wytnij okrągły otwór o średnicy 1,25 mm w czaszce (wyśrodkowany na AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) za pomocą wiertarki pneumatycznej. Zwilż wiercony obszar sterylną solą fizjologiczną i użyj żyletki, aby usunąć czaszkę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą końcówki igły. Dodatkowo można to osiągnąć poprzez nałożenie minimalnej ilości kleju tkankowego na wilgotną powierzchnię opony twardej. Gdy ta warstwa stwardnieje, można użyć ruchu bocznego za pomocą końcówki żyletki, aby usunąć membranę.</li>
	<li>Umieść błonę śluzówkową nad powierzchnią mózgu, zwracając szczególną uwagę, aby strona nabłonka była skierowana z dala od rany. Najlepiej zrobić to, przenosząc całą przegrodę na powierzchnię czaszki przylegającą do miejsca kraniotomii za pomocą pęsety. Za pomocą końcówki nożyczek chirurgicznych ściągnij błonę z chrząstki na powierzchnię czaszki i mózgu. Nie pozwól, aby membrana wyschła ani nie dotykaj jej żadnym materiałem chłonnym. Przeszczep powinien obficie zachodzić na wszystkie kostne krawędzie miejsca kraniotomii.</li>
	<li>Przykryj przeszczep sterylnym kawałkiem nitrylu. Zapobiega to przyleganiu skóry do przeszczepu podczas gojenia. Nitryl musi być wystarczająco duży, aby pokryć całą błonę śluzówkową. W razie potrzeby przyciąć nadmiar membrany. Unikaj jakiegokolwiek ruchu nitrylu po jego kontakcie z przeszczepem.</li>
	<li>Zamknij skórę sterylnym szwem 5-0 i pozwól myszy dojść do siebie przez 3-7 dni przed przejściem do następnego kroku. Należy uważać, aby nie zaburzyć bariery nitrylowej ani przeszczepu błony śluzowej podczas zamykania skóry.</li>
</ol>
4. Podawanie roztworu dozującego
<ol>
	<li>Po zabezpieczeniu znieczulonej myszy w ramie stereotaktycznej należy przeciąć szew nożyczkami i usunąć nadmiar skóry wokół czaszki.</li>
	<li>Usuń barierę nitrylową i oczyść powierzchnię czaszki. Użyj sterylnych wacików z solą fizjologiczną i bawełnianymi wacikami, aby oczyścić obszar, aż przeszczep będzie widoczny. Może być konieczne przecięcie przeszczepu brzytwą, jeśli urósł większy niż pożądana powierzchnia.</li>
	<li>Jeśli eksperyment będzie trwał dłużej niż kilka dni, rozsądnie jest wszczepić co najmniej dwie czaszki, aby wzmocnić implant głowy.</li>
	<li>Umieść studzienkę nad przeszczepem tak, aby krawędzie stykały się z czaszką. Nałóż klej cyjanoakrylowy na styku studni i czaszki. Napełnij studzienkę sterylną solą fizjologiczną i sprawdź, czy nie ma wycieków. Studzienki wykonane są z ciętych igieł strzykawkowych.</li>
	<li>Nałóż cement kostny na czaszkę, aby zabezpieczyć studnię na miejscu.</li>
	<li>Usuń sól fizjologiczną ze studzienki za pomocą pipety. Umyj studzienkę kilka razy, aby sprawdzić, czy klej nie wyciekł do środka. Dodaj żądane rozwiązanie; W tym przypadku stosuje się 50 μl dekstranu fluorescencyjnego. Oczekuje się, że rozpuszczalne w wodzie związki o podobnej polarności będą zachowywać się tak samo jak dekstran. Dostarczanie związków hydrofobowych lub zawiesin nie zostało zbadane tą metodą.</li>
	<li>Zakryj górną część studzienki za pomocą okrągłego kawałka nitrylu przymocowanego do góry za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Upewnij się, że klej nie styka się z zawartością studzienki.</li>
</ol>
5. Analiza dostarczania przezśluzówkowego
<ol>
	<li>Po upływie pożądanego czasu znieczulij mysz i zamień zawartość studzienki na roztwór niebieskiego barwnika Evana. Ten barwnik służy do sprawdzenia, czy przeszczep był nienaruszony.</li>
	<li>Po 30 minutach mocno znieczulij mysz, usuń roztwór barwnika i poddaj eutanazji poprzez dekapitację.</li>
	<li>Ręcznie usuń implant i usuń mózg za pomocą nożyczek chirurgicznych. Uważaj, aby utrzymać przeszczep na miejscu.</li>
	<li>Po usunięciu mózgu należy błyskawicznie zamrozić w roztworze izobutanu schłodzonym w suchej kąpieli lodowej.</li>
	<li>Zanurz mózg w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój na plasterki o wielkości 50 μm.</li>
	<li>Umieść żądane plasterki bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Zobrazuj plasterek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, gdy tylko roztwór OCT wyschnie.</li>
</ol>

<ol><li>Cardoso, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+Molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Drug transport across the blood-brain barrier.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).</li>
<li>Chen, Y., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+methods+for+delivery+of+drugs+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).</li>
<li>Cheng, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+protects+against+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine+%28MPTP%29-induced+neurotoxicity+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).</li>
<li>Grondin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((controlled+GDNF+infusion+promotes+structural+and+functional+recovery+in+advanced+parkinsonian+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys.</a> Brain. 125, 2191-2201 (2002).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+striatal+delivery+of+GDNF+as+a+treatment+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease.</a> Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+gene+targeting+to+the+brain+with+molecular+trojan+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery+of+protein+and+non-viral+gene+therapeutics+with+molecular+Trojan+horses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses.</a> J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).</li>
<li>Bellavance, M. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+blood-brain+barrier+disruption+as+a+CNS+delivery+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy.</a> AAPS J. 10, 166-177 (2008).</li>
<li>Merkus, F. H. M., Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+nasal+drug+delivery+bypass+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+R.+D%22%5BJournal%5D)">Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier.</a> Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).</li>
<li>Dhuria, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system%3A+Mechanisms+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations.</a> J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).</li>
<li>Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+drug+delivery-possibilities%2C+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions.</a> J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).</li>
<li>Craft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+insulin+therapy+for+alzheimer+disease+and+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+A+pilot+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial.</a> Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).</li>
<li>Freiherr, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+insulin+as+a+treatment+for+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+review+of+basic+research+and+clinical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence.</a> CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).</li>
<li>Gill, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+brain+infusion+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease.</a> Nat. Med. 9, 589-595 (2003).</li>
<li>Love, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+induces+neuronal+sprouting+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain.</a> Nat. Med. 11, 703-704 (2005).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> BioTechniques. 43, 195-204 (2007).</li>
<li>Bleier, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+blood-brain+barrier+via+mucosal+engrafting%3A+implications+for+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bernal-Sprekelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closure+of+cerebrospinal+fluid+leaks+prevents+ascending+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis.</a> Rhinology. 43, 277-281 (2005).</li>
<li>Bleier, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+cerebrospinal+fluid+leak+repair%3A+An+animal+model+to+test+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).</li>
</ol>

Dr Benjamin S. Bleier jest głównym wynalazcą tymczasowego patentu obejmującego metody dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego.

Najtrudniejszym etapem opisanej w niniejszym dokumencie procedury jest pomyślne przeniesienie odpowiednio dobranej błony śluzowej na powierzchnię mózgu. Ten krok jest znacznie łatwiejszy, jeśli pobrana przegroda nosowa jest wystarczająco duża i dobrze oczyszczona. Jeśli brzuszna część przegrody jest ścięta, należy uzyskać nowy przeszczep. Kąt wiercenia powinien być prostopadły do głowy myszy, aby zapewnić, że błona śluzówkowa nie zostanie uszkodzona przez wiertło. Jeśli zostanie wybrana szersza niż zalecana ścieżka wierc...

Leczenie chorób neurologicznych i psychiatrycznych jest poważnie utrudnione przez obecność bariery krew-mózg (BBB), która uniemożliwia ponad 95% wszystkich potencjalnych środków farmaceutycznych dotarcie do ośrodkowego układu nerwowego1-3. Na przykład wykazano, że czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF) jest skuteczny w leczeniu choroby Parkinsona, gdy jest wstrzykiwany bezpośrednio do mózgu, jednak jest nieskuteczny, gdy jest dostarczany ogólnoustrojowo, ponieważ nie może przeniknąć do barierykrew-mózg 4-6.
Powstało wiele prób obejścia tego problemu. Wykazano poprawę w ogólnoustrojowym podawaniu neuroterapeutyków poprzez zastosowanie koniugatów leków zawierających przeciwciała selektywne dla białek transportowych zlokalizowanych na śródbłonku naczyń włosowatych mózgu; Nie wykazano jednak, aby metoda ta miała zastosowanie do szerokiego zakresu produktów farmaceutycznych7,8. Dodatkowo, osmotyczne otwarcie BBB było stosowane klinicznie, jednak metoda ta cierpi z powodu ogólnoustrojowego dawkowania leków, w przeciwieństwie do bardziej bezpośredniego dostarczania do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania9. Duży wysiłek włożono w optymalizację dostarczania przeznosowego w nadziei na bezpośrednie ukierunkowanie na mózg10-12. Chociaż osiągnięto pewne sukcesy, ostateczne wyniki uzyskano tylko w przypadku leków, które posiadają endogenne receptory, takich jak insulina13,14. Co więcej, mechanizm dostarczania przez nos jest kontrowersyjny, a dowody sugerują pośrednie przenikanie do mózgu poprzez wychwyt neuronów węchowych lubprzez krwioobieg. Udało się uzyskać bezpośredni, przezczaszkowy poród za pomocą wszczepialnych cewników, jednak zabieg ten jest wysoce inwazyjny i wiąże się z licznymi powikłaniami15,16. Do tej pory nie ma ogólnej, minimalnie inwazyjnej metody dostarczania związków o dużej masie cząsteczkowej do mózgu.
Prezentowany tutaj jest mysi zabieg chirurgiczny, który tworzy półprzepuszczalny interfejs z mózgiem. Osiąga się to poprzez wszczepienie eksplantatu błony śluzowej17 na chirurgiczny ubytek kraniotomii u myszy. Za pomocą tej procedury wykazano, że związki rozpuszczalne o masie do 500 kDa mogą być dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego (bezpośrednio do miąższu mózgu, a także do płynu mózgowo-rdzeniowego) zarówno w sposób zależny od czasu, jak i masy cząsteczkowej18. Ta metoda omijania bariery krew-mózg jest modelem naprawy ubytków podstawy czaszki u ludzi, który wykorzystuje unaczynione przeszczepy błony śluzowej do naprawy otworów w czaszce po przeznosowej operacji endoskopowej19,20.

<table><tbody><tr><td>Myszy</td><td>Taconic</td><td>C57BL/6</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki studenckie</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka pneumatyczna</td><td>MTI Dental</td><td>333-CB</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań USP</td><td>Abbott Laboratories</td><td>4925</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td>do tymczasowego przechowywania przeszczepu</td></tr><tr><td>Sterylizator koralików</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>System tlenu/izofluranu</td> System kontroli temperatury <td>SurgiVet</td><td>V720100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>KOPF</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Maść do</td><td></td><td></td><td></td>oczu</tr><tr><td>Golarka</td><td></td><td></td><td></td>elektryczna</tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher</td><td>23-400-106</td><td></td></tr><tr><td>7,5% Providone</td><td></td><td></td> jod <td>Betadine peeling chirurgiczny</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne nierdzewny</td><td>Feather</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>3% nadtlenek</td><td></td><td></td> Hydogen <td>do czyszczenia czaszki</td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305176</td><td>końcówka igły odcięta i używana również</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>G4162</td><td>do zamykania studni i ochrony przeszczepu</td></tr><tr><td>5-0 Nylonowa nić</td><td></td><td></td><td></td>do szwów</tr><tr><td>Uchwyt na igłę Student Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td></td><td></td> cyjanoakrylowy dostępny <td>specjalnie super klej</td></tr><tr><td>Zestaw cementu dentystycznego, 1 lb, różowy nieprzezroczysty</td><td>Stoelting</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Izobutan (2-metylobutan)</td><td>Aldrich</td><td>M32631</td><td>do kąpieli w suchym lodzie</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Dostarczanie środków terapeutycznych do mózgu jest utrudnione przez obecność bariery krew-mózg (BBB), która ogranicza przepływ związków polarnych i o wysokiej masie cząsteczkowej z krwiobiegu do tkanki mózgowej. Pewien sukces w bezpośrednim dostarczaniu u ludzi osiągnięto dzięki implantacji cewników przezczaszkowych; Metoda ta jest jednak wysoce inwazyjna i wiąże się z licznymi powikłaniami. Mniej inwazyjną alternatywą byłoby dawkowanie mózgu przez chirurgicznie wszczepioną, półprzepuszczalną błonę, taką jak błona śluzowa nosa, która jest używana do naprawy ubytków podstawy czaszki po endoskopowej operacji przeznosowego usunięcia guza u ludzi. Przenoszenie leku przez tę błonę skutecznie ominęłoby barierę krew-mózg i dyfundowałoby się bezpośrednio do mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego. Zainspirowani tym podejściem, opracowano podejście chirurgiczne u myszy, które wykorzystuje błonę śluzową przegrody dawcy wszczepioną na pozaczaszkowy chirurgiczny ubytek BBB. Wykazano, że model ten skutecznie umożliwia przenikanie związków o dużej masie cząsteczkowej do mózgu. Ze względu na to, że wiele potencjalnych leków nie jest w stanie przekroczyć bariery krew-mózg, model ten jest cenny dla przeprowadzania badań przedklinicznych nowych terapii chorób neurologicznych i psychiatrycznych.

Uzyskanie wystarczająco dużego eksplantu przegrody nosowej jest kluczowe dla kolejnych etapów. Można to osiągnąć poprzez wiercenie w miejscu na czaszce myszy dawcy wskazanym na Rysunku 1a. Cięcie wzdłuż tej ścieżki pozwoli uzyskać eksplant o odpowiedniej wielkości, jak pokazano na Rysunku 1b. Jeśli głębokość wiercenia będzie niewystarczająca, przeszczep zostanie ucięty, co utrudni pozyskanie błony o rozmiarze wystarczającym do pokrycia powierzchni mózgu. Odradza się wiercenie bardziej bo...

Mysi model ludzkiej endoskopowej rekonstrukcji podstawy czaszki został opracowany, który tworzy półprzepuszczalny interfejs między mózgiem a nosem za pomocą przeszczepów błony śluzowej nosa. Metoda ta pozwala naukowcom badać dostarczanie do ośrodkowego układu nerwowego leków o dużej masie cząsteczkowej, które w przeciwnym razie są wykluczane przez barierę krew-mózg, gdy są podawane ogólnoustrojowo.

Heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne przeprowadzenie zabiegu heterotroficznego przeszczepu błony śluzowej w celu dostarczenia związków do mózgu. Osiąga się to poprzez wyizolowanie w pierwszym kroku przeszczepu przegrody nosowej od myszy dawcy. Drugim krokiem jest transplantacja błony śluzowej z przegrody na ubytek w czaszce myszy biorcy.Następnie przez przeszczep podaje się dawkę do mózgu przez wybrany czas. Ostatnim krokiem jest analiza skutków procedury dawkowania do mózgu z wykorzystaniem fluorescencji, mikroskopii lub immunohistochemii, aby wykazać dyfuzję dostarczonych związków do miąższu mózgowego. Wykorzystanie leków neuropfarmaceutycznych jest mocno ograniczone ze względu na obecność bariery krew-mózg.Opracowaliśmy technikę opartą na ludzkiej endoskopowej operacji przeznosowej, w której przeszczepiamy błonę śluzową do otworu w barierze krew-mózg i wykorzystujemy ją jako kanał do dostarczania leków bezpośrednio do mózgu. Poniżej Richie Komen, stażysta postdoctoralny w laboratorium Hana na Uniwersytecie w Bostonie, zaprezentuje tę technikę na modelu mysim. Rozpocznij procedurę od usunięcia skóry wokół obszaru nosa u uśpionej myszy, aby odsłonić czaszkę.Następnie zaznacz trzy linie za pomocą wiertarki pneumatycznej. Dwie linie flankują bocznie obszar nosa, a trzecia przebiega w linii z oczami i łączy dwie pozostałe linie prostopadle. Następnie wykonaj wiercenie w kierunku brzusznego.Aby oddzielić przegrodę nosową od otaczających ją tkanek, odetnij przegrodę od wszelkich przywarłych do niej tkanek. Następnie umieść ją w jałowym roztworze soli fizjologicznej pod mikroskopem, oczyść przeszczep i usuń wszelkie połączone tkanki. Idealnym wynikiem jest skuteczne usunięcie całej tkanki łącznej bez uszkodzenia błon śluzowych obecnych po obu stronach chrząstki przegrody.Po znieczuleniu myszy zgodnie ze standardowymi aseptycznymi procedurami chirurgicznymi i zamocowaniu jej w stereotaktycznej ramie, należy nałożyć maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie należy odsłonić czaszkę i wypoziomować głowę. Potem, używając wiertarki pneumatycznej, należy wywiercić w czaszce otwór okrągły o średnicy 1,25 mm.Podczas celowania w obszar atu, zwilż miejsce nawiercenia sterylną solą fizjologiczną i użyj żyletki, aby usunąć czaszkę. Następnie ręcznie usuń oponę twardą, używając końcówki igły o rozmiarze 30 G. W dalszej kolejności umieść błonę śluzową nad powierzchnią mózgu, zachowując szczególną ostrożność, aby strona nabłonkowa była skierowana w stronę przeciwną do rany.Używając końcówki nożyczek chirurgicznych, odsuń błonę od chrząstki i dociśnij ją do powierzchni czaszki i mózgu, tak aby szeroko zakrywała wszystkie kostne krawędzie miejsca kraniotomii. Następnie przykryj przeszczep sterylnym kawałkiem nitrylu. Zapobiega to przyleganiu skóry do przeszczepu podczas procesu gojenia.W razie potrzeby odetnij nadmiar membrany i unikaj jakiegokolwiek przemieszczania nitrylu po tym, jak zetknie się on z graftem. Następnie zamknij skórę za pomocą szwów i pozostaw mysz do rekonwalescencji na okres od trzech do siedmiu dni przed przejściem do następnego kroku. Upewnij się, że zastosowano odpowiednie zabiegi pooperacyjne oraz regularnie podawano leki przeciwbólowe w dawce dostosowanej do zwierzęcia.Po unieruchomieniu znieczuplonej myszy w aparacie stereotaksycznym, przetnij nożyczkami szew i usuń nadmiar skóry wokół czaszki. Usuń barierę nitrylową i oczyść powierzchnię czaszki. Użyj sterylnej soli fizjologicznej i patyczków bawełnianych, aby oczyścić obszar aż do momentu, gdy graft stanie się widoczny.Jeśli przeszczep wyrośnie do rozmiarów przekraczających pożądaną powierzchnię, może być konieczne przycięcie go żyletką. Następnie należy umieścić studzienkę nad przeszczepem w taki sposób, aby jej krawędzie stykały się z czaszką. Wówczas w miejscu połączenia studzienki z czaszką należy nanieść klej cyjanoakrylowy.Napełnij studzienkę sterylną solą fizjologiczną i sprawdź, czy nie występują żadne nieszczelności. Następnie nałóż cement na czaszkę, aby unieruchomić studzienkę w miejscu implantacji. Po tym kroku usuń sól fizjologiczną ze studzienki za pomocą pipety.Kilkukrotnie przemyj dołek, aby upewnić się, że klej nie wyciekł do środka. Następnie dodaj 50 µL fluorescencyjnego dekstranu. Zamknij otwór dołka, używając okrągłego kawałka nitrylu przymocowanego do góry za pomocą kleju cyjanoakrylowego, upewniając się, że klej nie ma kontaktu z zawartością dołka.Po upływie pożądanego czasu przeprowadź eutanazję zwierzęcia, a następnie wyjmij implant oraz mózg. Należy uważać, aby nie przesunąć przeszczepu. Po wyjęciu mózgu należy go błyskawicznie zamrozić w roztworze izobutanu chłodzonym w kąpieli z suchego lodu, a następnie zatopić mózg w roztworze OCT i wykonać skrawki o grubości 50 µm.Umieść wybrane skrawki bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Następnie, gdy tylko roztwór OCT wyschnie, wykonaj obrazowanie skrawka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jest to obraz skrawka mózgu myszy wykonany pod mikroskopem fluorescencyjnym po podaniu dawki drogą przezśluzówkową.Po 24-godzinnym konjugowaniu dekstranu z tetraetylo-rutyną o masie 40 kilodaltonów, przeszczep błony śluzowej jest widoczny na powierzchni mózgu. Po opanowaniu, prawidłowe wykonanie tej techniki powinno zająć łącznie cztery godziny czasu operacyjnego. Po obejrzeniu tego filmu użytkownik powinien być w stanie wyizolować przegrodę nosową i przenieść błonę śluzową na miejsce kraniotomii w celu dostarczenia leku do mózgu.

heterotopic-mucosal-engrafting-procedure-for-direct-drug-delivery-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Heterotopowe Przeszczepienie Śluzowe do Bezpośredniego Wprowadzania Leków do Mózgu u Myszy

Źródło: Zamboni, M., et al., Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie do wnętrzełka. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę dostarczania induktora leku do cisterna magna znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie selektywnie indukuje ekspresję markerów fluorescencyjnych w komórkach powierzchni mózgu dostępnych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego, co potwierdza obrazowanie fluorescencyjne.

Celowane dostarczanie leków w modelu mysim za pomocą iniekcji Cisterna Magna

W tym filmie opisujemy procedurę dostarczania komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego do cisterna magna mózgu myszy. Ortotopowy model myszy może być wykorzystany do badania przerzutowego rozprzestrzeniania się raka do opon mózgowo-rdzeniowych.

Chirurgiczne wstrzyknięcie Cisterna Magna: metoda podawania komórek nowotworowych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego modelu mysiego

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

Ten film przedstawia procedurę implantacji kaniuli wewnątrzczaszkowej w mysim modelu guza mózgu, w celu ułatwienia podania środka immunoterapeutycznego. Dostarczenie limfocytów T receptora antygenu chimerycznego specyficznych dla glipikan-2 w mikrośrodowisku guza wyzwala aktywację limfocytów T, powodując lizę guza i regresję guza.

Wewnątrzczaszkowa implantacja kanularna u myszy w celu dostarczenia środków terapeutycznych do guzów mózgu

Źródło: Leda, A. R., et al. Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę mikrochirurgiczną mającą na celu ułatwienie celowanej infuzji substancji badanej do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Zabieg polega na precyzyjnym szyciu i manipulacji naczyniami krwionośnymi w celu czasowego ograniczenia przepływu krwi, zapewniając kontrolowane dostarczanie. Rurka...

Celowane dostarczanie substancji do mózgu myszy poprzez infuzję do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Obecny protokół opisuje technikę infuzji mikrochirurgicznej u myszy, która skutecznie dostarcza substancje bezpośrednio do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną.

Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Konwekcja wspomagana dostarczaniem (CED) to metoda umożliwiająca skuteczne dostarczanie leków do mózgu poprzez bezpośrednią perfuzję dużych objętości tkanek. Zabieg wymaga użycia cewników i zoptymalizowanej procedury iniekcji. Protokół ten opisuje metodologię CED przeciwciała w mózgu myszy.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Tutaj opisujemy model mysiego ksenoprzeszczepu, który funkcjonalnie przypomina rezerwuar Ommaya u pacjentów. Opracowaliśmy mysi Ommaya w celu zbadania nowych metod leczenia powszechnie śmiertelnej choroby opon mózgowo-rdzeniowych.

Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Poznaj heterotopową procedurę wszczepienia błony śluzowej nosa u myszy, umożliwiającą bezpośrednie dostarczanie leków do mózgu. Ta metoda pokonuje barierę krew-mózg i wspiera badania nad terapiami układu nerwowego.

Heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy

Przeglądaj więcej filmów