Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie nowości izotropowej platformy rozciągającej, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone deformacje mechaniczne oraz do ilościowego określenia właściwości mechanicznych tkanek biologicznych. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie elastycznej membrany i zamontowanie jej na zestawie zacisków. Drugim krokiem jest hodowla C dwóch komórek C 12 na membranie przez noc, a następnego dnia zamontowanie zacisków na platformie rozciągającej.

Następnie, w drugim zestawie eksperymentów, tkanki aorty piersiowej są odrzucane z modelu mysiego i oczyszczane z wszelkich tkanek łącznych. Następnie tkanka aorty jest montowana na platformie rozciągającej za pomocą innego zestawu klamer. Ostatecznie platforma rozciągająca służy do wywoływania deformacji komórek wzdłuż dwóch ortogonalnych kierunków, które można określić ilościowo za pomocą odwróconego mikroskopu.

Alternatywnie przetwornik siły jest zintegrowany z urządzeniem rozciągającym w celu pomiaru sztywności tkanki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak jednomyślne lub dwuosiowe rozciąganie komórek, jest to, że pozwala nam niezależnie kontrolować deformację w dwóch ortogonalnych kierunkach w przezroczystej membranie, do której przyczepione są komórki, a tym samym pozwala na obrazowanie żywych komórek. Mikroskopia to także staranne zaprojektowanie innego zestawu zacisków.

Dzięki integracji czterostrunowego użytkownika na platformie, pozwala nam na wykonanie 10 testów komórkowych na tkance biologicznej w celu ilościowego określenia ich właściwości mechanicznych. Ten film przedstawia platformę do rozciągania dwuosiowego, specjalnie zbudowane urządzenie, które może być używane do badania wpływu deformacji podłoża na poziomie komórkowym oraz wykonywania prób rozciągania na tkankach biologicznych. Konstrukcja i cechy dwuosiowej platformy rozciągającej są szczegółowo opisane w dołączonym manuskrypcie w celu zbadania wpływu mechanicznej deformacji pojedynczych komórek, najpierw należy wytworzyć elastyczne i przezroczyste podłoże, na którym komórki mogą przylegać.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy odpipetować 500 mikrolitrów fluorescencyjnego roztworu mikrosfery do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odwirować przy 16 200 Gs Przez 10 minut wyrzucić supernat i dodać 500 mikrolitrów izopropanolu, a następnie pięć minut wirowania. Odłożyć fiolkę na noc w ciemności, aby umożliwić osadzenie się dużych cząstek następnego ranka, ostrożnie przenieść SNAT do czystej fiolki z mikrowirówką. Ten roztwór kulek może być użyty do wytworzenia więcej niż pięciu substratów, ponieważ roztwór kulek będzie nadal osadzał się przez następne trzy dni.

Ważne jest, aby uniknąć zawieszenia granulatu przez Resus. Wlej 0,5 grama utwardzacza dostarczonego z zestawem PDMS do 1,5 mililitrowej fiolki z mikrowirówką. Dodaj 15 mikrolitrów koralików fluorescencyjnych i wiruj przez minutę.

Powtórz to jeszcze pięć razy, aby dodać w sumie 90 mikrolitrów koralików Odłóż na bok. Zważyć 10 gramów PDMS, dodać 0,5 grama utwardzacza, uzupełnionego kulkami fluorescencyjnymi i mieszać przez co najmniej 12 minut. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś cztery miligramy PDMS z kulkami do formy w kształcie krzyża SUH 2050, uprzednio wykonanej przy użyciu standardowych technik fotolitografii.

Forma ma wysokość 320 mikrometrów i powierzchnię 13,4 centymetra kwadratowego i może zawierać 428 mikrolitrów lub 440 miligramów PDMS, utwardza PDMS przez dwie godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po utwardzeniu oderwać podłoże od formy, podłoże można przechowywać na szalce Petriego w temperaturze pokojowej przez dwa tygodnie, nie wykazując znaczących zmian i swoich właściwości mechanicznych. Wlej kropelki PDMS na szalkę Petriego o ostatecznej wielkości około czterech milimetrów średnicy, utwardź je do góry nogami przez dwie godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza, naczynie należy trzymać do góry nogami, aby zapobiec spłaszczaniu się kropli podczas procesu utwardzania.

Te cechy zakotwiczenia mogą być przechowywane na szalce Petriego przez tygodnie. Plazma powietrzna traktuje podłoże i osiem elementów kotwiących, wiąże elementy na każdym końcu podłoża w odległości czterech milimetrów od kwadratowego wgłębienia znajdującego się na podłożu, aby zamontować membranę na zaciskach. Owiń każdy koniec podłoża wokół cylindrycznej części rowka clamps i zabezpiecz go na miejscu za pomocą dwóch ustalających od góry.

Przykręć cztery clamps na clamp uchwyt. Następnie wlej PDMS na styk między podłożem a rowkowaną częścią zacisków. Rozprowadź nieutwardzony PDMS wokół rowkowanej cylindrycznej części za pomocą klucza imbusowego o średnicy 1,5 milimetra.

Wlej PDMS do rowków, aż do całkowitego wypełnienia przez działanie kapilarne i utwardź zespół w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny przed wysianiem komórek na membranie. Plazma powietrzna. Potraktuj cały zespół w celu sterylizacji i funkcjonalizacji podłoża, aby umożliwić pokrycie kolagenem.

Funkcjonalizuj obszar podłoża, w którym komórki zostaną wysiane jednym mililitrem 0,02 molowego kwasu octowego uzupełnionego 16 mikrogramami na mililitr kolagenu z ogona szczura w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Pożądana końcowa gęstość kolagenu wynosi pięć mikrogramów na centymetr kwadratowy Po godzinie trzykrotnie spłucz podłoże buforem fosforanowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Dodać 40 mikrolitrów pożywki hodowlanej, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną.

Streptomycyna zawierająca 2000 komórek w środkowej części substratu pokrywająca powierzchnię jednego centymetra kwadratowego. W tym przykładzie gęstość komórek wynosi 20 komórek na centymetr kwadratowy. Jednak gęstość komórek można zmienić zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.

Umieść cały zespół w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z substratem skierowanym do góry, tak aby kropla pożywki hodowlanej zawierającej komórki znajdowała się na nim. Zespół musi być przechowywany z podłożem skierowanym do góry przez co najmniej trzy godziny, aby komórki mogły się do niego mocno przymocować, aby zapobiec parowaniu. Do kropli na podłożu dodaje się 30 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej.

Co 45 minut po trzech godzinach przełóż cały zestaw na szalkę Petriego wypełnioną świeżą pożywką hodowlaną, aby zanurzyć substrat w inkubacji przez noc, aby umożliwić namnażanie się komórek następnego dnia. Zamontuj zestaw na mikroskopie fluorescencyjnym z odwróconym kontrastem fazowym lub fluorescencyjnym. Zamontuj zespół podłoża zaciskowego na dwuosiowej platformie rozciągającej, a silniki napełnią szalkę Petriego wewnątrz podgrzewacza szalki Petriego świeżo przygotowanym buforowanym roztworem soli HEPs.

To fizjologiczne rozwiązanie służy do utrzymania komórek na scenie mikroskopu poprzez naśladowanie normalnego środowiska krwi w tkankach. Ta dwuosiowa platforma rozciągająca może być również używana do ilościowego określania sztywności małych próbek tkanek. W tej demonstracji zostaną użyte izolowane aorty myszy.

Usuń przeponę, klatkę piersiową i płaty płuc z myszy poddanej eutanazji, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanki. Utrzymuj serce przyczepione do aorty i unikaj bezpośredniego dotykania naczynia, ale w sposób manipulowany. Za pomocą serca.

Usuń serce, korzeń aorty i aortę piersiową, delikatnie przecinając naczynie a kręgosłupem, aby zachować nienaruszoną wewnętrzną strukturę tkanki. Należy uważać, aby nie wywołać wydłużenia naczynia podczas nacięcia. Natychmiast zanurz i trzymaj serce i aortę w roztworze Krebsa, który jest przygotowywany codziennie i utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza podczas eksperymentów.

Wytnij i ostrożnie umyj aortę w roztworze Krebsa, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi pracujące pod chirurgicznym mikroskopem preparacyjnym. Usuń tkankę łączną za pomocą mikronożyczek i pęsety. Ważne jest, aby zachować całą długość naczynia i użyć korzenia aorty do określenia orientacji naczynia.

Wymiary niezaładowanego zbiornika są wymagane do określenia sztywności zbiornika. Wytnij pierścień aorty o długości około dwóch milimetrów i dokładnie zmierz jego długość za pomocą skalibrowanego ustawienia mikroskopu. Odłóż ten segment na bok w roztworze Kreba.

Następnie wytnij dwa małe pierścienie aorty z odcinków aorty pozostałych po usunięciu dwumilimetrowego segmentu. Jeden pierścień z odcinka aorty przed odcinkiem dwumilimetrowym, a drugi pierścień z odcinka aorty. Po dwumilimetrowym segmencie umieść oba pierścienie aortalne na szkiełku mikroskopowym ze światłem skierowanym do góry i zmierz grubość ścianki za pomocą skalibrowanego ustawienia mikroskopu.

Grubość ściany aorty jest mierzona i uśredniana za pomocą tych dwóch pierścieni. Napełnij szalkę Petriego na dwuosiowej platformie rozciągającej roztworem Krebsa i włóż dwumilimetrowy segment pierścienia aorty na kołki ciągnące. W tym protokole wykorzystano dwuosiową platformę rozciągającą do zbadania odpowiedzi mechanicznej jądra w pojedynczych mysich komórkach mioblastów wystawionych na deformację substratu o 25% deformacji przemieszczenia.

Zależności wynikające z wykonywania standardowego i czystego jednoosiowego rozciągania są pokazane w tych reprezentatywnych wynikach. Koraliki fluorescencyjne są ręcznie wybierane w pierwszej klatce filmu i śledzone od jednej klatki do drugiej, aż do osiągnięcia maksymalnego rozciągnięcia w kierunku poziomym i pionowym. Skrypt MATLAB automatycznie oblicza składowe zielonego tensora odkształcenia dla każdej klatki i tworzy krzywą kalibracyjną odkształcenia w odniesieniu do przemieszczenia silnika.

Na tych wykresach niebieskie i czerwone linie odpowiadają składowej zielonego naprężenia wzdłuż odpowiednio kierunku poziomego i pionowego. Wyniki te ilustrują możliwości dwuosiowej platformy rozciągającej do wywoływania odkształcenia podłoża wzdłuż dwóch kierunków ortogonalnych. Oprócz standardowych jednoosiowych dwuosiowych pól odkształceń EQU, dwuosiowa platforma rozciągająca może indukować złożone pola odkształceń w podłożu.

Panel G pokazuje, że rozciągnięcie tego samego podłoża o cztery milimetry wzdłuż osi x i lekkie rozciągnięcie wzdłuż osi Y o 1,5 milimetra zaznaczonego na czerwono, daje czyste jednolite pole osiowe bez deformacji ściskającej podłoża. Panel, H pokazuje, że rozciągnięcie podłoża wzdłuż osi x o 3,5 milimetra powoduje odkształcenie 25% i odkształcenie ściskające 7%, gdy końce podłoża wzdłuż osi pionowej są zamocowane, podświetlone na czerwono Z możliwością wykonywania obrazowania mikroskopowego żywych komórek podczas rozciągania jądra zostały wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym żywej komórki, który wiąże DNA, a następnie rozciągnięte o 25% wzdłuż każdej ortogonalnej osi rozciągania jako Zilustrowane tutaj pomiędzy każdą fazą cyklu rozciągania uzyskano obrazy kontrastowe i epifluorescencyjne obrazy nieuformowanego i zdeformowanego jądra. Długości głównej i mniejszej osi jądrowej wzdłuż stanu nieuformowanego oraz gdy jądro było sekwencyjnie rozciągane wzdłuż swojej głównej i mniejszej osi, zostały określone za pomocą wtyczki obrazu J i wykorzystane do obliczenia względnej zmiany długości.

Wzdłuż każdej osi na tym wykresie słupkowym oś X lub oś główna jest pokazana na niebiesko, a oś y lub oś pomocnicza jest pokazana na czerwono. Zdolność jądra do odkształcania wykazuje anizotropię mechaniczną, ponieważ wykazuje znacznie wyższą zdolność do odkształcania wzdłuż swojej osi mniejszej w porównaniu z osią główną, rola cytoszkieletu aktyny i mikrotubul w regulacji zdolności do deformacji jądrowej została zbadana przez depolimeryzację, filamenty lub mikrotubule aktyny selektywnie przy użyciu odpowiednio depolimeryzacji cyto D i neolu. Stwierdzono, że filamenty aktynowe lub mikrotubule indukują utratę anizotropowej de formowalności jądra.

Wyniki te potwierdzają ustalenia, że składniki cytoszkieletu przenoszą siły do jądra z substratu, a także są niezbędne do zachowania naturalnego zachowania mechanicznego jądra. Podczas deformacji dwuosiowa platforma rozciągająca została również wykorzystana do oceny wpływu przewlekłej nadekspresji białka szoku cieplnego 27 lub HP 27 na sztywność naczyń HSP nad ekspresją. W modelu myszy podatnym na miażdżycę, homozygotyczny ujemny POE modyfikuje skład histologiczny zmian miażdżycowych poprzez zwiększenie komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej i zawartości kolagenu.

Aby określić wpływ tej histologicznej przebudowy na właściwości mechaniczne naczynia, do pomiaru sztywności aorty wykorzystano platformę rozciągającą. Ten wykres przedstawia typową krzywą naprężenia i odkształcenia uzyskaną w wyniku rozciągania naczynia aortalnego, podczas gdy sztywność jest obliczana przy 30% odkształcenia. Sztywność jest nachyleniem stycznej wskazywanym przez czerwoną linię do krzywej.

Stwierdzono, że sztywność odcinków aorty HSP 27 u myszy wykazujących ekspresję była znacznie zwiększona o 41% w porównaniu z mysim modelem kontrolnym. Podsumowując, ocena mechaniczna w połączeniu z histologią naczynia i płytki nazębnej wykazała, że nadekspresja HSP 27 charakteryzuje się zwiększoną sztywnością naczyń i zawartością komórek mięśni gładkich kolagenu. Wyniki te sugerują, że HSP 27 może potencjalnie zwiększać stabilność zmian miażdżycowych, a tym samym zmniejszać ryzyko pęknięcia płytki miażdżycowej po jej rozwinięciu.

Technika ta stanowi nowy sposób dla naukowców w dziedzinie bioinżynierii w celu zbadania odpowiedzi komórek na złożone i inotropowe deformacje mechaniczne w zastosowaniach w biologii mechanicznej, ale także w celu monitorowania biologicznej mechaniki tkanek w chorobie.