Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie translujących polisomów rybosomów w celu zbadania zmian w aktywności translacyjnej mRNA w komórce. Osiąga się to poprzez dodanie cyklo hexy do pożywki wzrostowej w celu zamrożenia rybosomów na mRNA, zapobiegając w ten sposób spływowi rybosomów w drugim etapie. Rybosomy są ekstrahowane z komórek i rozdzielane na podstawie ich gęstości przez wirowanie w gradionym spadku gęstości sacharozy w celu ilościowego określenia i wyizolowania wolnych podjednostek rybosomalnych 40 s i 60 s stref mono a DS oraz translujących rybosomów polisomów.

Następnie RNA lub białka można wyekstrahować z frakcji sacharozy w celu analizy Mr NA i obfitości białek odpowiednio we frakcjach pre i polisomalnych. Wyniki pokazują ilościowe i jakościowe zmiany w translacji mRNA, które można badać na poziomie całego genomu za pomocą mikromacierzy lub sekwencjonowania RNA nowej generacji i analizować za pomocą algorytmu NoDa. Metoda profilowania trucizn może być wykorzystana do odpowiedzi na główne pytania, jeśli chodzi o regulację ekspresji genów na poziomach po transkrypcji, takich jak monitorowanie zmian w mRNA, translacja na poziomie całego genomu, a także asocjacja białek z rybosomami i poliami.

Pracownik naukowy Valentina Gand w naszym laboratorium zademonstruje tę technikę Na początek przygotuj 100 mililitrów roztworu sacharozy o sile 60% wagowej na objętość w dejonizowanej wodzie destylowanej, a następnie przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrometra. Następnie rozcieńczyć 60% roztwór sacharozy w jednym buforze gradientowym sacharozy X, aby uzyskać 40 mililitrów 5% i 50% roztworów sacharozy. Użyj bloku znacznika dostarczonego z jednostką gradientu, aby zaznaczyć połowę pełnego punktu na sześciu probówkach ultrawirówek poly aamer.

Następnie użyj urządzenia do nakładania warstw, aby dodać 5% roztwór sacharozy do połowy pełnego punktu. Następnie dodaj 50% roztwór sacharozy na dno probówki, aż interfejs dwóch roztworów dotrze do połowy pełnych rurek uszczelniających z nasadkami strefowymi i umieść rurki uszczelniające w uchwycie probówki na ekspresie gradientowym. Uruchom kreator gradientów, aby uzyskać gradient liniowy od 5% do 50%Kreator gradientów obraca rury pod dużym kątem nachylenia, aby w ciągu kilku minut utworzyć sześć gradientów liniowych.

W dniu eksperymentu komórki powinny być w około 80% zlewne. Potraktuj komórki 100 mikrogramami na mililitr cyklo hexa w pożywce wzrostowej i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla Umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego PBS zawierającego 100 mikrogramów na mililitr cyklo hexa. Następnie dodaj dodatkowe pięć mililitrów lodowatego roztworu PBS.

Zeskrobać komórki i przenieść zawiesinę komórek do 50 mililitrów, aby odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 425 mikrolitrach hipotonicznego buforu do lizy. Następnie dodaj pięć mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr cyklo hexa, jeden mikrolitr jednego molowego DTT i 100 jednostek inhibitora RNA do zawiesiny komórki.

Następnie wiruj roztwór przez pięć sekund. Uzupełnij zawiesinę komórek 25 mikrolitrami 10% tritton X 125 mikrolitrów 10% deoksycoatu sodu, a następnie wiruj przez dodatkowe pięć sekund. Następnie odwiruj lizaty w temperaturze 16 000 razy G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś super natynę do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zaoszczędź 10% lizatu jako kontrolę do pomiaru poziomów MR.mRNA w stanie ustalonym. Zmierz OD przy 260 nanometrach dla każdej próbki lizatu, a następnie dostosuj do tego samego OD w hipotonicznym buforze do lizy o końcowej objętości 500 mikrolitrów. Usuń 500 mikrolitrów z górnej części gradientów sacharozy i załaduj dostosowane próbki lizatu na wierzch każdego gradientu.

Następnie zważ i zważ każdą rurkę gradientową. Umieść probówki w wirniku SW 41 TI i przełącz wirówkę ultra w tryb niskiego złamania. Następnie odwirować próbki w temperaturze 222, 228 razy G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu ultra wirowania ostrożnie wyjmij rurki gradientowe z wirnika i umieść je na lodzie. Najpierw napełnij kolektor frakcji dwiema mililitrowymi probówkami zbiorczymi. Następnie włącz pompę komputerową, detektor UV i kolektor frakcji na pół godziny przed pobraniem frakcji.

Ustaw pompę tak, aby pracowała z prędkością trzech mililitrów na minutę, a następnie napełnij rurkę roztworem do spulchniania, aby usunąć powietrze z systemu. Przepuść roztwór do ścigania przez rurkę, aż kropla wypłynie z igły. Otwórz oprogramowanie do analizy.

Następnie ustaw czułość na plus lub minus 10 milielektronowoltów, a podstawę czasu na 100 sekund. Umieść probówkę ultrawirówki w detektorze UV i upewnij się, że probówka jest w pozycji prostopadłej. Następnie przekręć pokrętło poniżej uchwytu probówki, aby przekłuć rurkę igłą.

Dostosuj natężenie przepływu pompy na 1,5 mililitra na minutę i ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał frakcje co 30 sekund, co odpowiada 750 mikrolitrom w każdej frakcji. Ustaw pompę w pozycji zdalnej. Następnie uruchom pompę i kolektor frakcji i rozpocznij nagrywanie za pomocą znacznika DAQ w tym samym czasie.

Gdy pierwsza kropla roztworu do ścigania wpadnie do probówki zbiorczej, zatrzymaj pompę i znacznik DAQ. W tym samym czasie dodaj 750 mikrolitrów triolu do każdej zebranej frakcji i flashuj. Zamrozić frakcje w ciekłym azocie.

Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyizolować z próbek związany z polisomami i cytozolowy RNA. Frakcjonowanie polisomów zastosowano do oceny aktywności translacyjnej komórek raka piersi C 7 leczonych insuliną. Udział polisomu zwiększał się wraz z leczeniem insuliną w porównaniu z komórkami kontrolnymi i tymi leczonymi inhibitorem mTOR, Torin one.

Wynik ten wskazuje, że insulina stymuluje globalne tempo inicjacji translacji w komórkach mc seven. Wyniki czterech niezależnych badań eksperymentu z insuliną wykorzystano do oceny odtwarzalności tej metody frakcjonowania polisomów. Próbki z tych samych warunków traktowania i pochodzenia RNA są ściśle umieszczone na tym wykresie, co wskazuje na wysoką odtwarzalność.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak lizować komórki, przygotowywać sacharozy, gradienty i wreszcie zbierać frakcjonowane rybosomy. Protokół ten pozwoli Ci analizować ekspresję genów na poziomie po transkrypcji.