Name: Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania polisomów w komórkach ssaków przy użyciu gradientu sacharozy. Technika ta pozwala analizować aktywność translacyjną mRNA na poziomie całego genomu w badaniach nad regulacją ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR MOP-115195) oraz FRQ-S dla I.T., który jest również laureatem CIHR Young Investigator Award; oraz przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych i Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne dla O.L.

1. Przygotowanie gradientu sacharozy
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml 60% (m/v) roztworu sacharozy w ddH2O. Roztwór należy przefiltrować przez filtr 0,22 μm, aby zapobiec zatkaniu rurki podczas etapu frakcjonowania (krok 3.5).</li>
	<li>Przygotuj 5 ml 10x buforu gradientu sacharozy: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl2, 100 μg/ml cykloheksymidu, 1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA), 100 jednostek/ml inhibitora RNazy.</li>
	<li>Używając 60% roztworu przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.1, przygotować 40 ml 5% i 50% roztworów sacharozy w 1x buforze gradientowym sacharozy.</li>
	<li>Użyj bloku znacznika dostarczonego z ekspresem gradientu, aby zaznaczyć do połowy pełny punkt na każdej probówce do ultrawirowania polialomeru do nakładania warstw (w sumie 6 probówek do ultrawirowania). Korzystając z urządzenia do nakładania warstw dostarczonego z ekspresem do gradientów, dodaj 5% roztwór sacharozy, aż osiągnie połowę pełnego punktu. Następnie dodaj 50% roztworu sacharozy od dołu, aż interfejs między dwoma roztworami osiągnie punkt napełnienia. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, aby gradienty były jak najbardziej podobne, ponieważ jest to niezbędne do uzyskania wysokiej odtwarzalności (patrz poniżej).</li>
	<li>Uszczelnij probówki za pomocą nasadek strefowych dostarczonych z ekspresem gradientowym i przenieś uszczelnione probówki do uchwytu probówki na maszynie gradientowej.</li>
	<li>Uruchom kreator gradientów, aby uzyskać gradient liniowy od 5% do 50%. 6 gradientów liniowych zostanie utworzonych w ciągu kilku minut przez obrót pod dużym kątem nachylenia. 
	Uwaga: Gradienty sacharozy można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Izolacja i sedymentacja polisomów
<ol>
	<li>W zależności od typu komórki, komórki nasienne na 1-5 15-centymetrowych szalek Petriego (~15 x 106 komórek) co najmniej jeden dzień przed lizą. W dniu eksperymentów komórki powinny być zlewające się w ~80%. <!-- Uwaga: Optymalna konfluencja ma kluczowe znaczenie, ponieważ tempo translacji i proliferacji jest wprost proporcjonalne8, a zatem polisomy powinny być analizowane w aktywnie proliferujących komórkach (tj. tempo translacji znacznie spadnie w komórkach nadmiernie zlewających się, podczas gdy niska konfluencja komórek może nie dostarczyć wystarczającego materiału do dalszej analizy). Wyjątki od tej reguły mogą być zrobione, jeśli na przykład eksperymentator jest zainteresowany badaniem wpływu hamowania kontaktu na translację. Komórki nie powinny być jednak zbyt długo trzymane w warunkach nadmiernego zlewania się, ponieważ może to mieć niezamierzony wpływ na translatom. 
	Jeśli wymagana jest transfekcja, większość dostępnych na rynku zestawów nie wpływa na poziomy polisomów. Ponieważ w dniu transfekcji komórki muszą być w 80-90% zlewane, zaleca się rozmnażanie komórek 24 godziny po transfekcji i izolowanie polisosomów 48 godzin po transfekcji z komórek ~80% zlewających się.</li>
	<li>Inkubować komórki z cykloheksymidem w końcowym stężeniu 100 μg/ml w pożywce wzrostowej przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ; i dwukrotnie przemyć komórki 10 ml lodowatego 1x PBS zawierającego 100 μg/ml cykloheksymidu. Cykloheksymid jest inhibitorem wydłużenia translacji, który "zamraża" rybosomy na mRNA, zapobiegając w ten sposób odpływowi rybosomów 20.</li>
	<li>Delikatnie zeskrobać komórki w 5 ml lodowatego 1x PBS zawierającego 100 μg/ml cykloheksymidu i zebrać je w probówce o pojemności 50 ml. Ważne jest, aby ten krok został wykonany w miarę szybko, ponieważ pozostawienie komórek na lodzie przez dłuższy czas drastycznie obniży jakość preparatu polisomu.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 425 μl hipotonicznego buforu [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCl i 1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)], dodać 5 μl 10 mg/ml CHX, 1 μl 1 M DTT, 100 jednostek inhibitora RNAzy i wirować przez 5 sekund, a następnie dodać 25 μl 10% Triton X-100 (stężenie końcowe 0,5%) i 25 μl 10% Deoksycholan Sodu (stężenie końcowe 0,5%) i wirować przez 5 sek. Ze względu na pęcznienie komórek, bufor hipotoniczny przerwie błonę plazmatyczną, podczas gdy łagodne warunki detergentowe są używane do rozpuszczania rybosomów związanych z retikulum cytozolowym i endoplazmatycznym bez naruszania otoczki jądrowej.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 16 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant (~500 μl) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Zmierz OD przy 260 nm dla każdej próbki za pomocą spektrofotometru i zachowaj 10% lizatu jako dane wejściowe, które zostaną wykorzystane do określenia cytozolowych poziomów mRNA w stanie stacjonarnym. Rozcieńczyć wsad do 750 μl w H2O wolnym od RNAzy, dodać 750 μl Trizolu i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.</li>
	<li>Przenieść probówki ultrawirówkowe zawierające gradienty sacharozy we wstępnie schłodzonych wiadrach wirnika. Usuń 500 μl z górnej części gradientów sacharozy. Dostosuj lizaty tak, aby zawierały ten sam OD (10-20 OD przy 260 nm) w 500 μl buforu do lizy (opisanego w kroku 2.5) i załaduj je do każdego gradientu sacharozy. 
	Uwaga: Ważne jest, aby natychmiast załadować lizaty na gradienty, ponieważ znacznie poprawi to jakość preparatów polisomowych.</li>
	<li>Zważ i zrównoważ każdy gradient przed ultra-wirowaniem.</li>
	<li>Wirowanie przy 222 228 x g (36 000 obr./min), przez 2 godziny w temperaturze 4 °C przy użyciu wirnika SW41Ti. 
	Uwaga: Aby nie zakłócać gradientów sacharozy, należy wybrać opcję hamowania "niskiego".</li>
</ol>
3. Frakcjonowanie polisomów i ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Przygotuj kolektor frakcji, czyszcząc go ciepłą wodą wolną od RNAzy zawierającą RNazę ZAP (kilka psiknięć). Powtórz ten krok tylko z ciepłą wodą wolną od RNAzy. Przełącz lampę UV i poczekaj, aż pojawi się zielone światło.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij rurki z wirnika i umieść je na lodzie. Włącz komputer, pompę, detektor UV i kolektor frakcji. Ustawić pompę na 3 ml/min i napełnić rurkę roztworem do spulchniania [60% (m/v) sacharozy zawierającej 0,02% (w/v) błękitu bromofenolowego], aż dotrze do igły. Upewnij się, że z igły wypływa co najmniej jedna kropla i czy do strzykawki lub rurki z pompką nie zostały wprowadzone pęcherzyki.</li>
	<li>Umieść probówki o pojemności 2 ml w kolektorze frakcji. Uruchom program analityczny i ustaw czułość na +/- 10 mEV. Ustaw "podstawę czasu" na 100 sekund.</li>
	<li>Umieść każdą probówkę do ultrawirowania w detektorze UV, upewniając się, że probówka jest w pozycji prostopadłej. Przekłuć rurkę igłą, przekręcając pokrętło poniżej uchwytu probówki.</li>
	<li>Nastaw pompę na 1,5 ml/min i zbieraj frakcje ustawiając czas na 30 sekund na kolektorze frakcji (da to ~ 750 μl w każdej frakcji). Ustaw pompę w "pozycji zdalnej", uruchom pompę i kolektor frakcji, a jednocześnie rozpocznij nagrywanie za pomocą znacznika DAQ. Spowoduje to przemieszczenie gradientu sacharozy w górę i jednoczesne wykrycie absorbancji UV przy 254 nm. Należy przerwać zbieranie, gdy tylko pierwsza kropla roztworu do ścigania wpadnie do probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zapisz śledzenie w .csv formacie i (po wykonaniu kroku 3.7) w aplikacji arkusza kalkulacyjnego wykonaj następujące czynności, aby zidentyfikować położenie każdej frakcji w profilu absorpcji UV:
	<ol>
		<li>Wybrać kolumnę zawierającą wartości odpowiadające absorbancji przy 254 nm (kanał 0).</li>
		<li>Utwórz gładki liniowy wykres punktowy absorbancji.</li>
		<li>Ustaw główną jednostkę osi X na 300 (wartość uzyskana przez podzielenie objętości gradientu sacharozy 5%-50% (~12 ml) przez czas zbierania każdej frakcji (30 sekund).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 750 μl Trizolu do każdej frakcji i błyskawicznie zamrozić frakcje w ciekłym azocie.</li>
	<li>Wyizoluj RNA związane z polisomami i cytozolowe (od 2,6) za pomocą protokołu Trizol zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zwiększyć wydajność RNA, należy przystąpić do wytrącania RNA w temperaturze -80 °C przez 30 minut lub -20 °C przez noc. 
	Uwaga: Ponieważ ilość RNA wytrąconego z frakcji polisomilnych może nie być wyraźnie widoczna, zaleca się dodanie nośnika. Dodać 1 μl nośnika do probówki przed etapem wytrącania RNA podczas protokołu Trizol.</li>
	<li>Określ, które frakcje odpowiadają mRNA związane z rybosomem >3 (stosując podejście opisane w 3.6) i połącz te frakcje. Użyj zestawu do czyszczenia RNA, aby przeprowadzić czyszczenie puli związanego z polisomami i cytozolowego RNA (od 2.6). Prześlij próbki do placówki w celu określenia poziomów mRNA w całym genomie za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. 
	Jeśli translacja określonych mRNA musi być monitorowana za pomocą RT-qPCR, zaleca się użycie 500 ng RNA (z puli frakcji zawierających >3 rybosomy lub całkowite RNA) do syntezy cDNA. 
	Uwaga: mRNA związane z rybosomami >3 są ustawione arbitralnie tak, aby reprezentowały efektywnie translowane mRNA i zawierały ponad 80% nowo zsyntetyzowanych polipeptydów >28,29. Uwzględnienie frakcji odpowiadających lekkim (1-2), średnim (2-3) i ciężkim polisomom (>3) byłoby korzystne, ale zwiększy to liczbę próbek 2-krotnie (4 vs 2 na warunek), a tym samym koszt eksperymentu. Niezależnie od tego, że przewiduje się, że spadek kosztów głębokiego sekwencjonowania i analizy mikromacierzy w przyszłości powinien sprzyjać temu drugiemu podejściu, zaleca się, aby podczas walidacji monitorowano dystrybucję poszczególnych mRNA w każdej frakcji.</li>
</ol>
4. Analiza translacji mRNA w całym genomie
<ol>
	<li>Zainstaluj R, bioconductor i pakiet anota:
	<ol>
		<li>Zainstaluj język R (pobierz z r-project.org) i uruchom R-session. 
		Uwaga: R jest dostępny dla wszystkich systemów operacyjnych i anota będzie działać na wszystkich z nich.</li>
		<li>Zainstaluj bioprzewodnik (bioconductor.org). Kod R jest interpretowany przez terminal R (np. konsolę R w systemie Windows – która jest uruchamiana przez dwukrotne kliknięcie skrótu R). Bioconductor instaluje się, wpisując (w terminalu R): 
		 
		source("http://bioconductor.org/biocLite.R") 
		 
		biocLite() 
		 </li>
		<li>Zainstaluj pakiet anota bioconductor (i pakiet qvalue wymagany przez anotę), wpisując (w terminalu R): 
		 
		source("http://bioconductor.org/biocLite.R") 
		 
		biocLite(c("anota", "qvalue"))</li>
		<li>Sprawdź, czy pakiet został pomyślnie zainstalowany i otwórz instrukcję anota, wpisując (w terminalu R): 
		 
		biblioteka("anota") 
		 
		winieta("anota") 
		 </li>
		<li>Uwaga: Dodatkowa pomoc dla wszystkich funkcji, które są używane w pakiecie anota, można znaleźć na stronie internetowej anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) lub korzystając z funkcji pomocy w R. Na przykład, aby uzyskać pomoc dotyczącą funkcji anotaPerformQc, przejdź do terminala R i wpisz (zwróć uwagę, że działa to tylko wtedy, gdy pakiet anota został załadowany): 
		 
		library("anota") #loads pakiet anota 
		 
		?anotaPerformQc #opens pomoc dla tej funkcji 
		 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Importowanie danych do języka R:
	<ol>
		<li>Przygotowywanie danych wyrażeń do analizy. Dane powinny być wstępnie przetworzone (np. znormalizowane i poddane kontroli jakości) w odniesieniu do techniki, która została użyta do pomiaru poziomów mRNA. Wartości wejściowe muszą być przekształcone w logarytm, najczęściej jest to log2. Skompiluj jedną tabelę z danymi dla wszystkich próbek RNA związanych z polisomami i jedną dla wszystkich próbek cytozolowego RNA. Pierwsza kolumna powinna zawierać identyfikatory genów, po których następuje jedna kolumna danych na próbkę; Pierwszy wiersz powinien zawierać nazwy próbek. Bardzo ważne jest, aby tabele miały identyczną kolejność próbek i identyczną kolejność genów. Zapisz pliki jako pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami o nazwach "myPolysomeData.txt" i "myCytosolicData.txt".</li>
		<li>W tym przykładzie używane są dwie klasy próbek (kontrolna lub chora) z 3 powtórzeniami na klasę, generując w ten sposób 6 próbek w tej kolejności: C1, C2, C3, D1, D2, D3 zarówno w plikach myCytosolicData.txt, jak i myPolysomeData.txt. Anota wymaga co najmniej 3 powtórzeń na warunek, gdy istnieją dwie klasy próbek. Powinny to być niezależne kontrpróby biologiczne.</li>
		<li>Utwórz katalog zawierający pliki wejściowe danych (myPolysomeData.txt i myCytosolicData.txt). Otwórz język R z tego katalogu. W systemie Windows/Mac można to zrobić, kopiując skrót R do tego katalogu i uruchamiając R za pomocą tego skrótu (bezpośrednie działanie można również zmienić za pomocą menu rozwijanych).</li>
		<li>Utwórz plik o nazwie myCode.R w nowo utworzonym katalogu i otwórz go za pomocą oprogramowania do edycji tekstu. Napisz kod w tym pliku.</li>
		<li>Aby załadować dane do języka R, napisz następujący kod do pliku myCode.R (pamiętaj, aby ponownie zapisać ten plik po każdym dodaniu kodu). Poniżej znajduje się wyjaśnienie kodu krok po kroku, ale cały kod może być również napisany na początku, a funkcja źródłowa (która uruchamia kod, patrz poniżej) jest używana tylko raz: 
		 
		##this wczytuje bibliotekę ANOTA 
		 
		biblioteka(anota) 
		 
		##This ładuje dane wejściowe do R 
		 
		dataCyto <- as.matrix(read.table("myCytosolicData.txt", header=TRUE, row.names=1, sep="\t")) 
		 
		dataPoly <- as.matrix(read.table("myPolysomeData.txt", header=TRUE, row.names=1, sep="\t")) 
		 </li>
		<li>Uruchom kod w języku R, wpisując go bezpośrednio w terminalu języka R: 
		 
		source("mójKod.R") 
		 </li>
		<li>Sprawdź, czy dane zostały pomyślnie załadowane, wpisując (do terminala R): 
		head(dataCyto) #will pokazuje początek tabeli dataCyto 
		head(dataPoly) 
		 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja genów ulegających zróżnicowanej translacji:
	<ol>
		<li>Wygeneruj wektor opisujący przykładowe kategorie (wektor to typ obiektu w R). Wektor ten powinien odzwierciedlać kolejność próbek w myPolysomeData.txt i myCytosolicData.txt tak, aby wszystkie trzy obiekty miały identyczną kolejność próbek. Wektor zostanie użyty podczas instruowania anota, które próbki należy porównać. Dodaj następujące elementy do pliku myCode.R: 
		 
		##Note, że powtórzone próbki mają identyczną klasę próbki 
		 
		##descriptions (tj. "C" lub "D")w owym wektorze. 
		 
		myFenotypy <- c("C", "C", "C", "D", "D", "D") 
		 </li>
		<li>Przeprowadzanie kontroli jakości zestawu danych. Istnieje szereg miar jakości, które należy ocenić, zanim anota będzie mogła być wykorzystana do analizy. Są one szczegółowo omówione w podręczniku anota. Dodaj ten kod do pliku myCode.R i zapisz: 
		 
		anotaQcOut <- anotaPerformQc(dataT=dataCyto, dataP=dataPoly, phenoVec=mojeFenotypy) 
		 
		anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest(anotaQcObj=anotaQcOut) 
		 </li>
		<li>Uruchom kod, wpisując w R-terminal: 
		 
		source("mójKod.R") 
		 
		Spowoduje to wygenerowanie pewnej liczby plików wyjściowych, które można sprawdzić zgodnie z instrukcją zawartą w podręczniku anota. 
		 </li>
		<li>Zidentyfikuj geny ulegające zróżnicowanej translacji. Próbki będą porównywane w oparciu o porządek alfabetyczny nazw podanych do parametru "phenoVec" (tj. wektora "myPhenotypes"), chyba że zostaną one określone przez użytkownika (za pomocą parametru "contrasts"). Dodaj następujący kod do pliku myCode.R i zakończ za pomocą polecenia "source" wewnątrz terminala R, jak opisano powyżej: 
		 
		anotaSigOut <- anotaGetSigGenes(dataT=dataCyto, dataP=dataPoly, phenoVec=mojeFenotypy, anotaQcObj=anotaQcOut)</li>
		<li>Skorzystaj z pomocy dla anotaGetSigGenes, aby zrozumieć, jak sformatowane są dane wyjściowe i zobaczyć, jak wybrać przykładowe kategorie do porównania, wpisując (w terminalu R): 
		 
		?anotaGetSigGenes 
		 </li>
		<li>Filtruj i wykreślaj geny, które są różnie translowane. Istnieje wiele progów, które można zastosować w funkcji anotaPlotSigGenes, a korzystanie z pomocy uprości niestandardową kombinację takich progów. Aby wybrać geny do wiarygodnej analizy, należy zastosować ustawienia minSlope (-0,5), maxSlope (1,5) i slopeP (0,01). 
		Uwaga: Ponadto ustawienia dotyczące wskaźnika fałszywych odkryć RVM23,26,30 (FDR) (0,15) i zmian krotności (log2[1,5]) mogą być np. używane do identyfikacji genów ulegających zróżnicowanej translacji. Inne filtry, takie jak "selDeltaPT", mogą być przydatne do bardziej rygorystycznego filtrowania (np. ustawienie selDeltaPT na log2[1.5]). Konieczne jest również określenie, które porównanie powinno być filtrowane (za pomocą argumentu selCont). Zastosuj opisane ustawienia, dodając następujący wiersz do pliku myCode.R: 
		 
		anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes(anotaSigObj=anotaSigOut, selContr=1, minSlope=(-0.5), maxSlope=1.5, slopeP=0.01, maxRvmPAdj=0.15, minEff=log2(1.5), selDeltaPT=log2(1.5)) 
		 </li>
		<li>Przeprowadź analizę za pomocą funkcji source z terminala R, jak opisano powyżej. Spowoduje to również wygenerowanie graficznego wyniku. Analiza tych danych wyjściowych jest dobrym punktem wyjścia do oceny wydajności analizy i zidentyfikowania wszelkich niezbędnych zmian w ustawieniach.</li>
		<li>Wygeneruj tabelę wyjściową. Dodaj następujący kod do pliku myCode.R: 
		 
		write.table(anotaSigFiltered$selectedRvmData, file="MySignificantGenes.txt", sep="\t") 
		 </li>
		<li>Uruchom kod za pomocą funkcji source w R-terminalu. Kolumny w tabeli wynikowej są wyjaśnione w pomocy funkcji anotaPlotSigGenes.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes%3A+a+systems+biology+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li>
<li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li>
<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li>
<li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer%3A+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li>
<li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li>
<li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+neurodegeneration%3A+role+and+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li>
<li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li>
<li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li>
<li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1%2Fc-Jun+N-Terminal+Kinase%2FEukaryotic+Elongation+Factor+1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li>
<li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li>
<li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li>
<li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li>
<li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li>
<li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li>
<li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li>
<li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li>
<li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+translational+control+in+CD4%2B+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13(2013).</li>
<li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li>
<li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li>
<li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li>
<li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W artykule opisano dobrze znany protokół frakcjonowania polisomów, po którym następuje opracowana przez nas metoda analizy w celu wychwycenia jakościowych i ilościowych zmian w aktywności translacyjnej w skali całego genomu w komórkach ssaków. W celu pomyślnego zakończenia realizacji tego protokołu należy zwrócić szczególną uwagę na: 1) konfluencję komórek (ponieważ tempo proliferacji i dostępność składników odżywczych korelują z aktywnością translacyjną mRNA i mogą wpływać na skład translatomu, konfluencja komórek powinna być spójna we wszystkich powtórzeniach i warunkach eksperymentalnych), 2) szybka liza komórek (niezależnie od obecności inhibitorów cykloheksymidu i RNAzy w, liza powinna być szybka, a ekstrakty komórkowe powinny być nakładane na gradienty sacharozy natychmiast po lizie, aby zapobiec degradacji RNA i dysocjacji polisomów), 3) Przygotowanie gradientu (aby zapewnić wysoką odtwarzalność danych, gradienty sacharozy należy przygotować przy użyciu ekspresu do gradientów i należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z nimi).
Oprócz badania zmian w aktywności translacyjnej, protokół ten może być stosowany do izolowania kompleksów białkowych związanych z rybosomami i ustalania ich funkcji fizjologicznych. W tym celu poziomy i status fosforylacji różnych białek związanych z rybosomami można określić za pomocą wytrącania TCA, a następnie Western blot, podczas gdy kompleksy białkowe związane z rybosomami mogą być immunoprecypitowane z frakcji gradientowych i analizowane za pomocą Western blotting lub spektrometrii mas. Wadą tej techniki jest to, że metoda frakcji o wolnym gradiencie może spowodować dysocjację nawet ściśle związanych białek, których kinetyka wiązania jest w szybkiej asocjacji/dysocjacji. Typowymi przykładami są czynniki związane z nowo zsyntetyzowanymi polipeptydami. Nowo zsyntetyzowane polipeptydy powstające z rybosomów mogą być unieruchomione na kompleksach białkowych związanych z rybosomami za pomocą chemicznych środków sieciujących, takich jak 3,3'-ditiobis [sulfosuccinimidylopropionian] (DTSSP)31. Podejście to ujawniło, że kompleks receptora aktywowanej kinazy C 1 (RACK1) / kinazy N-końcowej c-Jun (JNK) / eukariotycznego czynnika wydłużenia translacji 1A2 (eEF1A2) reguluje degradację nowo zsyntetyzowanych polipeptydów w odpowiedzi na stres27. Ponadto podobną metodologię zastosowano w badaniach, z których wynika, że kinaza białkowa C bII (PKCbII) jest rekrutowana do rybosomów przez RACK132 oraz że aktywacja kompleksu mTOR 2 (mTORC2) zachodzi na rybosomach, gdzie fosforyluje nowo zsyntetyzowane polipeptydy AKT i reguluje ich stabilność33,34.
Głównymi ograniczeniami metody frakcjonowania polisomów, po której następuje analiza anota, są: 1) wymóg stosunkowo dużej liczby komórek (~15 x 106 komórek), 2) brak informacji o położeniu dotyczącym lokalizacji rybosomu na danej cząsteczce mRNA oraz 3) kwestie związane z niejednorodnością komórkową i molekularną tkanek prawidłowych i nowotworowych. Problemy związane z wymaganą liczbą komórek można rozwiązać, dostosowując piki widm absorbancji odpowiadające monosomom (80S) komórek, których ilości są ograniczone do tych uzyskanych z komórek o wysokiej liczebności (np. komórek HeLa) 35. Technika profilowania rybosomów (patrz poniżej) może być wykorzystana do określenia dokładnego położenia rybosomu na danej cząsteczce mRNA, podczas gdy kwestie związane z zakłócającym wpływem heterogeniczności tkanek na interpretację zmian w ekspresji genów uzyskanych ze złożonych systemów, takich jak tkanki ludzkie, zostały szczegółowo omówione w publikacji Leeka i Storeya 36.
Niedawno opracowano nową technikę profilowania rybosomów, w której fragmenty chronione rybosomem (RPF) są generowane przez leczenie RNAzą I i analizowane przez głębokie sekwencjonowanie22. Technika ta pozwala na określenie pozycji rybosomu w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, zapewniając w ten sposób niespotykany dotąd wgląd w biologię rybosomów. Na przykład profilowanie rybosomów można wykorzystać do określenia gęstości rybosomów w danej cząsteczce mRNA lub identyfikacji elementów wpływających na szybkość inicjacji translacji, takich jak alternatywne miejsca inicjacji, inicjacja w kodonach innych niż AUG i elementy regulatorowe, takie jak uORF. Istnieje jednak kilka ograniczeń metodologicznych, które ograniczają zdolność profilowania rybosomów do dokładnego oszacowania wydajności translacji mRNA. Należą do nich niezależne odchylenia wprowadzone przez losową fragmentację i trawienie RNAzy I, błędy wprowadzone przez inhibitory translacji (np. inhibitory elongacji, takie jak emetyna i cykloheksymid, prawdopodobnie indukują akumulację rybosomów w miejscach inicjacji translacji), duża liczba wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych związanych z wynikami TE, a także ich niedokładność w przewidywaniu odczytów pochodzących z mRNA kodujących białka37. Być może najważniejsze jest to, że podczas gdy profilowanie rybosomów umożliwia bezpośrednią identyfikację położenia rybosomów na danej cząsteczce mRNA, liczba rybosomów związanych z danym mRNA jest pośrednio szacowana przez normalizację częstotliwości odczytów w RPF (mRNA związanym z rybosomami) w stosunku do tych obserwowanych w losowo fragmentowanych mRNA (całkowite mRNA). Na przykład w prostym otoczeniu, w którym cztery cząsteczki mRNA "B" (Ba, Bb, Bc i Bd) są zajęte przez cztery rybosomy w pozycjach 1, 2, 3 i 4, nieodłączna wada techniki profilowania rybosomów nie pozwoli na rozróżnienie między scenariuszem, w którym wszystkie 4 rybosomy kojarzą się tylko z mRNA Ba w pozycjach 1, 2, 3 i 4 oraz scenariusz, w którym mRNA Ba, Bb, Bc i Bd są zajęte przez pojedynczy rybosom odpowiednio w pozycji 1, 2, 3 i 4. W przeciwieństwie do tego, podczas frakcjonowania polisomów, integralność polisomów jest zachowana, umożliwiając w ten sposób izolację pul mRNA związanych z określoną liczbą rybosomów (ryc. 1). To ważne rozróżnienie między frakcjonowaniem polistyomów a profilowaniem rybosomów sugeruje, że podczas gdy pierwsza metoda może być stosowana do bezpośredniego porównywania mRNA w mRNP, lekkich i ciężkich frakcjach polisomów, druga metoda prawdopodobnie nie uchwyci zmian w translatomie, które są spowodowane przez mRNA, które przechodzą z lekkich do ciężkich polisomów, jednocześnie przeceniając wkład tych, które przechodzą z frakcji mRNP do ciężkich polisomów. Biologiczne znaczenie tych rozbieżności między wyżej wymienionymi metodami jest podkreślone przez dużą ilość danych pokazujących, że aktywacja translacyjna podzbioru mRNA, takich jak te, które są wrażliwe na eIF4E, przechodzi z lekkich do ciężkich polisomów, podczas gdy inne, takie jak te zawierające pierwiastki 5'TOP, są rekrutowane do ciężkich polisomów bezpośrednio z pul mRNA wolnego od rybosomów6. Co ciekawe, wykazano, że szlak mTOR jednocześnie moduluje translację "eIF4E-wrażliwych" i 5'TOP mRNA11. W związku z tym różnice metodologiczne, które zostały omówione powyżej, mogą wyjaśniać pozorną rozbieżność wniosków między badaniami wykorzystującymi profilowanie rybosomów38,39 i frakcjonowanie polisomów24 w celu oceny wpływu hamowania mTOR na translatom.
Podsumowując, frakcjonowanie polisomów i profilowanie rybosomów są uzupełniającymi się metodami, które przede wszystkim dostarczają informacji dotyczących odpowiednio liczby rybosomów związanych z mRNA i położenia rybosomu na mRNA. Co ważne, niezależnie od wad i zalet tych metod, istotne jest, aby dane dotyczące całego genomu uzyskane za pomocą obu procedur były odpowiednio analizowane oraz walidowane funkcjonalnie i biochemicznie.

Sieci regulacyjne kontrolujące ekspresję genów były intensywnie badane w ciągu ostatnich dwóch dekad. Zdecydowana większość tych wysiłków badawczych koncentrowała się na regulacji transkrypcji, przy czym zmiany poziomów mRNA w stanie stacjonarnym w skali całego genomu wykorzystano do określenia tak zwanych profili "ekspresji genów". Ostatnie badania pokazują, że poziomy mRNA w stanie stacjonarnym tylko luźno odpowiadają składowi proteomu1,2, co wskazuje, że mechanizmy potranskrypcyjne, w tym translacja mRNA, odgrywają główną rolę w regulacji ekspresji genów3,4. Rzeczywiście, oszacowano, że ~ 50% poziomów białka jest określanych na poziomie translacji mRNA w unieśmiertelnionych fibroblastach myszy5.
translacja mRNA to wysoce regulowany proces, podczas którego mRNA są przekształcane w białka poprzez zaaranżowane działanie rybosomów, transferowych RNA (tRNA) i czynników pomocniczych, powszechnie określanych jako czynniki translacyjne (TF)6. Synteza białek jest najbardziej energochłonnym procesem w komórkach ssaków7 i dlatego globalne tempo translacji mRNA jest dostosowywane do dostępności składników odżywczych i tempa proliferacji komórek8. Oprócz zmian w globalnych szybkościach translacji mRNA, różne bodźce zewnątrzkomórkowe (np. hormony i czynniki wzrostu), sygnały wewnątrzkomórkowe (np. poziomy aminokwasów) i różne rodzaje stresu (np. stres ER) indukują selektywne zmiany w pulach mRNA, które są poddawane translacji (translatomowi)6. W zależności od rodzaju bodźca, aktywność translacyjna niektórych, ale nie wszystkich mRNA jest dramatycznie zaburzona, Powoduje to zmiany w proteomie, które są wymagane do uzyskania szybkiej odpowiedzi komórkowej6. Uważa się, że te jakościowe i ilościowe zmiany w translatomie są pośredniczone przez wzajemne oddziaływanie między czynnikami transakcyjnymi (np. składnikami maszynerii translacyjnej, czynnikami pomocniczymi lub miRNA) a elementami cis-elementami (elementami lub cechami RNA) obecnymi w wybranych podzbiorach mRNA6,9. Na przykład zmiany poziomów i/lub aktywności ograniczających szybkość czynników inicjacji translacji eIF4E i eIF2 selektywnie modulują translację transkryptów w oparciu o specyficzne cechy 5'UTR6. eIF4E i eIF2 są wymagane do rekrutacji mRNA i inicjującego tRNA do rybosomu, odpowiednio:6. Wzrost aktywności eIF4E selektywnie wzmacnia translację mRNA zawierających długie i wysoce ustrukturyzowane 5'UTR, w tym te kodujące białka stymulujące proliferację i przeżycie, w tym cykliny, c-myc i Bcl-xL10. Z kolei inaktywacja eIF2 prowadzi do globalnego wyłączenia syntezy białek, przy jednoczesnej selektywnej regulacji w górę translacji mRNA zawierających krótkie hamujące otwarte ramki odczytu (uORF) w ich 5'UTR, takich jak te kodujące główne regulatory transkrypcji odpowiedzi niesfałdowanego białka (np. ATF4). W odpowiedzi na różne bodźce, w tym składniki odżywcze, czynniki wzrostu i hormony, mechanistyczny/ssaczy cel szlaku rapamycyny (mTOR) stymuluje aktywność eIF4E poprzez inaktywację rodziny supresorów translacji białka wiążącego 4E (4E-BP), podczas gdy szlak MAPK bezpośrednio fosforyluje eIF4E6,11. Z kolei kinazy eIF2α (tj. PERK, PKR, HRI i GCN2) hamują eIF2 poprzez fosforylację jego podjednostki regulatorowej eIF2α w odpowiedzi na niedobór składników odżywczych, stres ER i infekcję wirusową6,12. Zmiany w aktywności i/lub ekspresji TF, innych składników maszynerii translacyjnej i czynników regulacyjnych, w tym miRNA, zaobserwowano w różnych stanach patologicznych, w tym w raku, zespołach metabolicznych, zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych oraz chorobach nerek i układu krążenia13-19. Podsumowując, dane te wskazują, że mechanizmy translacyjne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy komórek i że ich zniesienie odgrywa kluczową rolę w etiologii różnych chorób człowieka.
Tutaj, opisany jest protokół frakcjonowania polisomów przez wirowanie w gradionym gradicynie gęstości sacharozy w komórkach ssaków, który służy do oddzielania polisomów od monosomów, podjednostek rybosomalnych i informacyjnych cząstek rybonukleoproteiny (mRNP). Umożliwia to rozróżnienie między mRNA efektywnie translacyjnymi (związanymi z ciężkimi polisomami) a słabo ulegającymi (związanymi z lekkimi polisomami). W tym teście rybosomy są unieruchamiane na mRNA za pomocą inhibitorów wydłużania translacji, takich jak cykloheksymid20, a ekstrakty cytozolowe są rozdzielane na 5-50% liniowych gradientach gęstości sacharozy przez ultrawirowanie. Późniejsze frakcjonowanie gradientów sacharozy umożliwia izolację mRNA w zależności od liczby rybosomów, z którymi się wiążą. RNA wyekstrahowane z każdej frakcji można następnie wykorzystać do określenia zmian w rozkładach mRNA w gradiencie między różnymi warunkami, przy czym wydajność translacyjna wzrasta od góry do dołu gradientu. Northern Blotting lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) są używane do określania poziomów mRNA w każdej frakcji.
Alternatywnie, frakcje zawierające ciężkie polisomy (zazwyczaj więcej niż 3 rybosomy) są łączone, a poziomy mRNA związane z całym genomem są określane za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Niezwykle ważne jest podkreślenie, że na poziomy mRNA związanych z polisomami, oprócz translacji, wpływają mechanizmy transkrypcyjne i potranskrypcyjne, które wpływają na poziomy cytozolowych mRNA21. Dlatego, aby określić różnice w translacji przy użyciu danych obejmujących cały genom z mRNA związanego z polisomami, konieczne jest skorygowanie wpływu etapów szlaku ekspresji genów, które są przed translacją21. Aby umożliwić taką korektę, cytozolowy RNA jest przygotowywany równolegle z RNA związanym z polisomami z każdej próbki i określa się poziomy mRNA w stanie ustalonym w całym genomie21. Obecnie tak zwane wyniki "efektywności translacji" (TE) (tj. stosunek logarytmu między danymi mRNA związanymi z polisomami a danymi mRNA cytozolowego) są często stosowane do korygowania wpływu zmian poziomów cytozolowego mRNA na wydajność translacji danego mRNA22. Jednak użycie wyników TE do identyfikacji translacji różnicowej wiąże się ze znaczną liczbą wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych ze względu na matematyczną właściwość wyników TE, powszechnie określaną jako fałszywa korelacja27. Rzeczywiście, przegląd zestawów danych z wielu laboratoriów wykazał, że takie fałszywe korelacje wydają się być nieuniknione podczas analizy zmian w translatomach23. Skłoniło to do opracowania algorytmu "analizy translacji różnicowej" (anota), który nie cierpi na wyżej wymienione niedociągnięcia23. Podczas analizy anota stosuje się model regresji w celu wyprowadzenia miar aktywności translacyjnej niezależnie od poziomów cytozolowego RNA. Takie miary są następnie porównywane między warunkami i obliczana jest statystyka. Użytkownik ma możliwość zastosowania metody skurczu wariancji, która poprawia moc statystyczną i zmniejsza występowanie wyników fałszywie dodatnich w badaniach z niewielką liczbą powtórzeń 24. Co istotne, niedawno wykazano, że zaburzenia w translatomie wychwyconym przez anota, ale nie wyniki TE, korelują ze zmianami w proteomie25. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie analizy anota do identyfikacji zmian w translacji w skali całego genomu. Podczas gdy teoretyczne podstawy algorytmu anota zostały szczegółowo omówione wcześniej21,23,26, tutaj skupiono się na tym, jak zastosować go w praktyce.
Oprócz badania zmian w aktywności translacji mRNA w komórce, ten protokół frakcjonowania rybosomów może być wykorzystany do izolacji i biochemicznej i funkcjonalnej charakterystyki kompleksów białkowych związanych z rybosomami i polisomami. Podejście to zostało z powodzeniem wdrożone w przeszłości w celu identyfikacji kompleksów, które regulują stabilność nowo zsyntetyzowanych polipeptydów27 i/lub są zaangażowane w fosforylację składników maszynerii translacyjnej. To zastosowanie metody frakcjonowania polisomów zostanie również pokrótce omówione.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Biobasic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>CABDH4532</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Biobasic</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biobasic</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Nośnik wytrącania RNA</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04693132001</td><td>Tabletki (wolne od EDTA)</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy&nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m System filtracyjny 150 ml</td><td>Corning</td><td>431155</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Zestaw do czyszczenia RNA</td></tr><tr><td>Cienkościenne ultrawirówki poliallomerowe&nbsp;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti Pakiet z akcesoriami</td> Wirówka <td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100 XP ultra</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-9340A</td><td></td></tr><tr><td>ISCO&nbsp;</td><td>Detektor Brandel</td><td>FC-176-R1</td><td></td></tr><tr><td>typu II z rejestratorem wykresów</td><td>Detektor UV Brandel</td><td>UA-6</td><td></td></tr><tr><td>Przekłuwacz rurowy z komórką przepływową i pompą strzykawkową</td> detektora <td>Brandel</td><td>BR-A86-5</td><td></td></tr><tr><td>UA-6 komunikacyjny</td><td>Brandel</td><td>60-1020-211</td><td></td></tr><tr><td>FC-176</td><td></td><td></td> Gradient <td></td></tr><tr><td>Master Base Unit</td><td>Biocomp</td><td>108-1</td><td>Gradient Maker</td></tr><tr><td>Przystawki do formowania gradientów</td><td>Biocomp</td><td>105-914A-1R</td><td>Przystawka do tworzenia gradientów</td></tr><tr><td>Pomiar Obliczenia 8-kanałowe urządzenie do akwizycji danych 50 kHz</td><td>MicroDAQ</td><td>USB-1208FS</td><td>Załącznik do oprogramowania analitycznego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych obliczeniowych</td><td>MicroDAQ</td><td>TracerDAQ Pro</td><td>Analysis (tylko pobieranie)</td></tr><tr><td>10x bufor dla gradientów sacharozy:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM HEPES (pH7,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; g/ml cykloheksymid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 jednostek/ml inhibitor</td><td></td><td></td><td></td>RNazy</tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td>do lizy</tr><tr><td>5 mM Tris-HCl (pH 7,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mM KCl&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Następnie dodaj cykloheksymid (CHX), DTT, inhibitor RNAzy, tryton i deoksycholan sodu, jak wskazano w tekście</td><td></td><td></td><td></td> głównym</tr></tbody></table>

frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

translacja mRNA odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów i reprezentuje najbardziej energochłonny proces w komórkach ssaków. W związku z tym uważa się, że rozregulowanie translacji mRNA odgrywa główną rolę w różnych stanach patologicznych, w tym w raku. W rybosomach znajdują się również białka opiekuńcze, które ułatwiają fałdowanie powstających polipeptydów, modulując w ten sposób funkcję i stabilność nowo zsyntetyzowanych polipeptydów. Ponadto pojawiające się dane wskazują, że rybosomy służą jako platforma dla repertuaru cząsteczek sygnałowych, które są zaangażowane w różne modyfikacje potranslacyjne nowo zsyntetyzowanych polipeptydów, gdy wyłaniają się one z rybosomu i/lub składników maszynerii translacyjnej. W tym artykule opisano dobrze znaną metodę frakcjonowania rybosomów za pomocą wirowania w gradieniu gęstości sacharozy. W połączeniu z opracowanym przez nas algorytmem "anota", metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie różnicowej translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Co więcej, ten wszechstronny protokół może być wykorzystany w różnych badaniach biochemicznych mających na celu analizę funkcji kompleksów białkowych związanych z rybosomami, w tym tych, które odgrywają kluczową rolę w fałdowaniu i degradacji nowo zsyntetyzowanych polipeptydów.

mTOR jest głównym węzłem sieci komórkowej, która koordynuje globalne tempo syntezy białek z dostępnością składników odżywczych19. Translacja mRNA jest regulowana głównie na ograniczającym tempo etapie inicjacji6. Odsetek rybosomów zaangażowanych w polisomy koreluje dodatnio z tempem inicjacji translacji28. Przedstawiono przykład zastosowania metody frakcjonowania polisomów w celu zbadania roli sygnalizacji mTOR w pośredniczeniu efektów insuliny w translacji mRNA. W tym celu komórki raka piersi człowieka MCF7 utrzymywano w niskim stężeniu surowicy, a następnie stymulowano samą insuliną lub insuliną w połączeniu z Torin1, inhibitorem miejsca aktywnego mTOR. Komórki niestymulowane, które były stale utrzymywane w niskim stężeniu surowicy, służyły jako kontrola. Frakcje mRNP, monosomów (80S) i polisomów rozdzielono za pomocą metody frakcjonowania polisomów. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, insulina wywołała wzrost absorbancji w frakcjach gradientu odpowiadających polisomom, któremu towarzyszył jednoczesny spadek absorbancji we frakcji monosomów (Rycina 1). Wyniki te pokazują, że odsetek rybosomów zaangażowanych w polisomy jest zwiększony w komórkach traktowanych insuliną w porównaniu z komórkami kontrolnymi, co wskazuje zatem, zgodnie z oczekiwaniami, że insulina stymuluje globalne tempo inicjacji translacji. Torin1 odwrócił wpływ insuliny na profile absorbancji (Rycina 1), potwierdzając tym samym ustalenia, że sygnalizacja mTOR odgrywa główną rolę w pośredniczeniu efektów insuliny w obrębie aparatu translacyjnego19.
Opierając się na założeniu, że niespójności w przygotowywaniu gradientów są nieuniknione, pojawiły się pytania dotyczące powtarzalności danych uzyskanych za pomocą metody frakcjonowania polisomów22. Aby empirycznie przetestować ten potencjalnie szkodliwy problem, wyizolowano RNA cytozolowe oraz RNA związane z ciężkimi polisomami (mRNA związane z 4 lub większą liczbą rybosomów) z komórek MCF7 traktowanych samą insuliną lub insuliną w połączeniu z Torin1, wykorzystując 4 niezależne powtórzenia biologiczne (Rycina 2). Wpływ insuliny i Torin1 na skład mRNA cytozolowego i związanego z ciężkimi polisomami w każdym powtórzeniu określono w skali całego genomu przy użyciu metody mikromacierzy. Aby ocenić powtarzalność metody frakcjonowania polisomów zastosowano analizę głównych składowych (PCA). Analiza ta wykazała, że próbki należące do każdego stanu badawczego były ściśle zgrupowane w obrębie dwóch pierwszych składowych, podczas gdy poszczególne stany były wyraźnie odseparowane (Rycina 2). Wyniki te dowodzą, że opisana tutaj metoda frakcjonowania polisomów jest wysoce powtarzalna, a tym samym odpowiednia do badania ilościowych i jakościowych zmian w translacji na poziomie całego genomu.
<img alt="Wykres wyników chromatografii; absorbancja UV względem numerów frakcji; analiza izolacji białek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Profile polisomalne ukazujące wpływ głodzenia surowiczego, insuliny i sygnalizacji mTOR na translację globalną w komórkach MCF7. Komórki MCF7 pozbawiono składników odżywczych (utrzymywano w 0.1% FBS) przez 16 godzin, a następnie traktowano 5 nM insuliny (Ins) samodzielnie lub w połączeniu z 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) przez 4 godziny. Jako kontrolę wykorzystano nieleczone komórki, które były stale pozbawione składników odżywczych (0.1% FBS). Odpowiednie ekstrakty cytozolowe sedymentowano poprzez wirowanie w gradientach sacharozy 5-50%. Oznaczono wolne podjednostki rybosomalne (40S i 60S), monosomy (80S) oraz liczbę rybosomów w frakcjach polisomalnych.
<img alt="Wykres wyników analizy głównych składowych (PCA), grupowanie danych na osiach składowych, metoda statystyczna." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Dane genomowe uzyskane za pomocą profilowania polisomów wykazują wysoką powtarzalność. Komórki MCF7 poddano działaniu czynników zgodnie z opisem w Rycini 1. RNA cytozolowe i związane z polisomami (&gt;3 rybosomy) wyekstrahowano z 4 niezależnych powtórzeń biologicznych, a poziomy mRNA w całym genomie określono przy użyciu macierzy GeneTitan (Affymetrix). Do oceny powtarzalności uzyskanych danych wykorzystano PCA. Przedstawiono dwie pierwsze składowe PCA dla wszystkich wariantów traktowania (T1 = Torin 1; ctrl = kontrola; Ins = insulina), pochodzenia RNA (C = cytozolowe; P = związane z polisomami) oraz powtórzeń. Próbki z tego samego stanu i o tym samym pochodzeniu RNA znajdują się blisko siebie, co wskazuje na wysoką powtarzalność.

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest izolacja polizomów, czyli rybosomów w trakcie translacji, w celu zbadania zmian w aktywności translacji mRNA w komórce. Osiąga się to poprzez dodanie cykloheksymidu do pożywki wzrostowej, aby zatrzymać rybosomy na mRNA, zapobiegając tym samym ich odczepianiu się (runoff) w drugim etapie. Rybosomy są ekstrahowane z komórek i rozdzielane na podstawie ich gęstości za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy, co pozwala na ilościowe oznaczenie i izolację wolnych podjednostek rybosomalnych 40 s i 60 s, monozomów oraz polizomów.Następnie z frakcji sacharozowych można wyekstrahować RNA lub białka, aby odpowiednio przeanalizować zawartość mRNA i białek w frakcjach presomalnych i polisomalnych. Wyniki wskazują na ilościowe i jakościowe zmiany w translacji mRNA, które można zbadać w skali całego genomu przy użyciu mikromacierzy lub sekwencjonowania RNA nowej generacji i przeanalizować za pomocą algorytmu NoDa. Metoda profilowania polisomów może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, takie jak monitorowanie zmian w mRNA i translacji w skali całego genomu, a także powiązań białek z rybosomami i polisomami.Valentina Gand, badaczka w naszym laboratorium, zademonstruje tę technikę. Na początek należy przygotować 100 mililitrów 60% (masa/objętość) roztworu sacharozy w odsolonej wodzie destylowanej, a następnie przefiltrować roztwór przez filtr o rozmiarze porów 0,22 mikrometra. Następnie rozcieńczyć 60% roztwór sacharozy w buforze do gradientu sacharozy 1X, aby przygotować 40 mililitrów roztworów sacharozy o stężeniu 5% i 50%. Używając bloku znacznikowego dostarczonego z urządzeniem do tworzenia gradientów, należy zaznaczyć punkt połowy objętości na sześciu probówkach do ultracentryfugi typu poly-allamer.Następnie, używając urządzenia do warstwowania, należy dodać 5% roztwór sacharozy do połowy wysokości probówki. Następnie dodaje się do dna probówki 50% roztwór sacharozy, aż granica między dwoma roztworami osiągnie poziom połowy wysokości. Probówki należy zamknąć zakrętkami do gradientów strefowych i umieścić w uchwycie na probówki w urządzeniu do tworzenia gradientów. Uruchamia się urządzenie w celu uzyskania gradientu liniowego od 5% do 50%. Urządzenie do tworzenia gradientów obraca probówki pod dużym kątem nachylenia, aby w ciągu kilku minut uformować sześć gradientów liniowych.W dniu eksperymentu komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie około 80%. Traktuj komórki 100 µg/mL cykloheksamidu w pożywce wzrostowej i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37°C i 5% CO2. Przemyj komórki dwukrotnie 10 mL lodowatego PBS zawierającego 100 µg/mL cykloheksamidu. Następnie dodaj dodatkowe 5 mL roztworu lodowatego PBS.Zeskrob komórki i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml, aby odwirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Następnie odlej nadsącz i resuspenderuj komórki w 425 µL buforu do lizy hipotonicznej. Następnie do zawiesiny komórkowej dodaj pięć µL cykloheksanidu o stężeniu 10 mg/mL, 1 µL 1 M DTT oraz 100 jednostek inhibitora RNAzy.Następnie wymieszaj roztwór w wortexie przez pięć sekund. Do zawiesiny komórkowej dodaj 25 µL 10% Triton X-100 oraz 125 µL 10% dodecylosiarczanu sodu, a następnie ponownie wymieszaj w wortexie przez pięć sekund. Następnie odwiruj lizaty przy 16 000 ×g przez siedem minut w temperaturze 4 °C.Przenieś supernatant do nowej, schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zachowaj 10% lizatu jako kontrolę do pomiaru stacjonarnego poziomu mRNA MR. Zmierz OD przy 260 nanometrach dla każdej próbki lizatu, a następnie wyrównaj OD w hipotonicznym buforze do lizy do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Usuń 500 mikrolitrów z górnej części gradientów sacharozy, a następnie nanieś wyrównane próbki lizatu na wierzch każdego gradientu.Następnie zważ i zrównoważ każdą probówkę z gradientem. Umieść probówki w rotorze SW 41 TI i ustaw ultrawirowkę w trybie niskiego hamowania (low break mode). Następnie odwiruj próbki przy 222 228 ×g przez dwie godziny w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu ultrawirowania ostrożnie wyjmij probówki z gradientem z rotora i umieść je na lodzie. Najpierw napełnij kolektor frakcji probówkami o pojemności dwóch mililitrów. Następnie, na pół godziny przed rozpoczęciem zbierania frakcji, uruchom komputer, pompę, detektor UV oraz kolektor frakcji.Ustaw pompę na przepływ trzech mililitrów na minutę, a następnie napełnij przewody roztworem płuczącym, aby usunąć powietrze z układu. Przepuszczaj roztwór płuczący przez przewody, aż z igły pojawi się kropla. Uruchom oprogramowanie analityczne.Następnie ustaw czułość na plus lub minus 10 meV, a bazę czasową na 100 sekund. Umieść probówkę do ultrawirówki w detektorze UV i upewnij się, że probówka znajduje się w pozycji prostopadłej. Następnie przekręć pokrętło pod uchwytem probówki, aby przebić probówkę igłą.Ustaw szybkość przepływu pompy na 1,5 milliliters per minute i skonfiguruj kolektor frakcji tak, aby zbierał frakcje co 30 seconds, co odpowiada 750 microliters w każdej frakcji. Przełącz pompę w tryb zdalny. Następnie uruchom pompę oraz kolektor frakcji i w tym samym czasie rozpocznij rejestrację za pomocą rejestratora DAQ.W momencie, gdy pierwsza kropla roztworu wypierającego wpadnie do probówki zbiorczej, należy zatrzymać pompę oraz rejestrator DAQ. Jednocześnie do każdej zebranej frakcji należy dodać 750 µL triolu i wymieszać. Frakcje należy zamrozić w ciekłym azocie.Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, wyizolowano RNA związany z polisomami oraz RNA cytozolowe z próbek. Do oceny aktywności translacyjnej komórek raka piersi C7 traktowanych insuliną zastosowano frakcjonowanie polisomów. Udział polisomów wzrósł po traktowaniu insuliną w porównaniu z komórkami kontrolnymi oraz komórkami traktowanymi inhibitorem mTOR, Torin 1.Wynik ten wskazuje, że insulina stymuluje globalne tempo inicjacji translacji w komórkach mc seven. Wyniki z czterech niezależnych prób eksperymentu z insuliną zostały wykorzystane do oceny powtarzalności tej metody frakcjonowania polisomów. Próbki pochodzące z tych samych warunków traktowania i tego samego źródła RNA znajdują się blisko siebie na tym wykresie, co wskazuje na wysoką powtarzalność.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób lizy komórek, przygotowania sacharozy i gradientów, a ostatecznie wyizolowania frakcjonowanych rybosomów. Protokół ten pozwoli na analizę ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym.

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Frakcjonowani i analiza polisom translatomów ssaków na skalę genomową

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Poznaj metodę frakcjonowania polisomów w komórkach ssaków przy użyciu gradientu sacharozy. Technika ta pozwala analizować aktywność translacyjną mRNA na poziomie całego genomu w badaniach nad regulacją ekspresji genów.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Przeglądaj więcej filmów