Name: Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj tanią metodę analizy aktywności ruchowej i napadów u Drosophila melanogaster z wykorzystaniem kamery internetowej oraz oprogramowania ImageJ. Technika ta umożliwia badanie wpływu modyfikacji genetycznych i farmakologicznych na zachowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną również wyrazić podziękowania dla Kris Burner, Stephena McKinney, Laury Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer i Megan Hyde za ich pracę nad dopracowaniem tego testu.

1. Przygotowanie poszczególnych much do testu lokomocji
<ol>
	<li>Przenieść muchy, delikatnie stukając w poszczególne puste fiolki i zakręcając fiolki bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju 20-30 minut przed obserwacją. Ważne jest, aby nie znieczulać much w ciągu kilku godzin przed obserwacją behawioralną, ponieważ poprzednie badania wykazały, że ekspozycja na znieczulenie może zmienić zachowanie w porównaniu z muchami nieznieczulonymi.</li>
	<li>Delikatnie wystuknąć muchę z fiolki i umieścić pojedyncze muchy pod pokrywą szalki Petriego o średnicy 5 cm (o wysokości 5 mm) z małymi szczelinami umożliwiającymi przepływ powietrza. Oświetl od dołu i obserwuj muchy za pomocą kamery internetowej zamontowanej nad szalką Petriego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie poszczególnych much do testu padaczkowego
<ol>
	<li>Nakarm dwudniowe muchy wrażliwe na napady albo standardowymi drożdżami/mąką kukurydzianą/pożywką agarową, albo standardową pożywką zmieszaną bezpośrednio z lekiem. W przypadku przedstawionych tutaj danych, muchom podawano 1 g standardowej pożywki lub 1 g standardowej pożywki zmieszanej z 25 mg metforminy.</li>
	<li>Po tym, jak muszki będą karmione przez dwa dni pożywką lub pożywką z lekiem, przenieś je, delikatnie stukając w poszczególne puste fiolki i zakryj fiolki bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju przez 20 minut przed obserwacją. Ważne jest, aby nie znieczulać much w ciągu kilku godzin przed obserwacją behawioralną, ponieważ poprzednie badania wykazały, że ekspozycja na znieczulenie może zmienić zachowanie w porównaniu z muchami nieznieczulonymi.</li>
	<li>Wiruj pojedyncze fiolki zawierające pojedynczą muchę na wirowniku laboratoryjnym, używając najwyższego ustawienia przez 10 sekund. Umieść unieruchomioną muchę na czystej białej kartce papieru bezpośrednio pod kamerą internetową zamontowaną nad papierem.</li>
</ol>
3. Nagrywanie wideo
<ol>
	<li>Nagraj ruch lub SLA za pomocą oprogramowania HandyAvi <a href="http://www.azcendant.com/download.htm">http://www.azcendant.com/download.htm</a>. Ten program wykorzystuje kamerę internetową do przechwytywania obrazów w oparciu o ustawienia użytkownika.</li>
	<li>Wybierz opcję Zdjęcia poklatkowe na karcie Przechwytywanie, Gdy otworzy się okno, wybierz kamerę internetową jako urządzenie przechwytujące. W przypadku większości eksperymentów rozmiar klatki wideo 640 x 480 jest wystarczający.</li>
	<li>Wybierz kodek Intel IYUV dla kompresji i wybierz 0,1 s/klatkę dla testu napadu lub wybierz 0,1-0,5 s/klatkę dla testu ruchu. Na karcie Zaawansowane wybierz opcję utwórz plik obrazu .bmp dla każdego przechwycenia i wybierz folder, w którym program ma przechowywać wykonane obrazy (stos obrazów).</li>
	<li>Umieść martwą muchę na kartce papieru. Kliknij pole Ustawienia wideo i dostosuj ustawienia na karcie Ustawienia urządzenia, aby uzyskać jasne białe tło i wyraźny kontrast z ciemniejszą muchą.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu okresu nagrywania kliknij przycisk zatrzymania. Stos obrazów powinien teraz znajdować się w wybranym folderze. Uwaga: Przed nagraniem upewnij się, że folder wybrany dla stosu obrazów jest pusty.</li>
</ol>
4. Analiza danych za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Otwórz bezpłatne oprogramowanie do przetwarzania obrazów NIH ImageJ, które można pobrać ze strony <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.</a> Uwaga: Oprócz pobrania programu, wtyczka Multitracker musi zostać pobrana i zainstalowana w sposób wskazany na stronie <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html</a>.</li>
	<li>Zaimportuj stos obrazów do ImageJ, klikając kartę Plik, a następnie wybierając opcję Importuj → sekwencję obrazów.
	<ol>
		<li>Wybierz folder zawierający stos obrazów, podświetl jeden z obrazów i wybierz pozycję Otwórz. Otworzy się okno dialogowe Opcje sekwencji. Kliknij przycisk Sortuj nazwy numerycznie, a następnie wybierz przycisk OK, a stos obrazów zostanie załadowany do ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proguj wszystkie obrazy tak, aby każdy z nich składał się z białego tła, a mucha została przekształcona w czarną kropkę. Aby rozpocząć ten proces, przekonwertuj obraz na format 8-bitowy, wybierając opcję Typ → 8 bitów na karcie Obraz.
	<ol>
		<li>Kliknij ponownie kartę Obraz i wybierz Dostosuj próg →. Spowoduje to otwarcie okna dialogowego Próg, w którym można dostosować punkt odcięcia progu.</li>
		<li>Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić, czy są dodatkowe czarne kropki lub czy w plasterku brakuje czarnej kropki. W takim przypadku dostosuj próg, aby złagodzić problem. Zazwyczaj próg nie musi być dostosowywany, ponieważ program domyślnie ustawia odpowiednią wartość. 
		Uwaga: Każdy slajd w stosie powinien mieć tylko jedną czarną kropkę reprezentującą pozycję muchy.</li>
		<li>Wybierz opcję Zastosuj w oknie dialogowym Próg, a otworzy się okno dialogowe Konwertuj na maskę. Nie klikaj żadnej z opcji, ale po prostu kliknij OK, aby przekroczyć próg stosu obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po progowaniu stosu obrazów, wybierz wtyczkę Multitracker w zakładce Wtyczki, aby zmierzyć ruch muchy w pikselach. Pojawi się okno dialogowe Object Tracker (Śledzenie obiektów).
	<ol>
		<li>Kliknij wszystkie cztery opcje podane w oknie dialogowym, a następnie wybierz przycisk OK. Wtyczka Multitracker dołączy współrzędne do czarnej kropki w każdym wycinku i wyświetli je w oknie Wyniki, a także całkowitą długość ścieżki w pikselach. Okno Ścieżki przedstawia graficznie ścieżkę, którą przebyła mucha.</li>
		<li>Skopiuj listę współrzędnych x i y z okna Wyniki i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Jeśli na którymkolwiek slajdzie w stosie nie ma czarnej kropki, program Multitracker zatrzyma się na tym slajdzie. W takim przypadku należy wrócić do kroku 4.2 i ponownie progować stos, aby upewnić się, że mucha rejestruje się jako kropka na danym slajdzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przekonwertować długości ścieżek z pikseli na cm, zrób osobny obraz dwóch kropek oddalonych od siebie o jeden cm na czystej białej kartce papieru.
	<ol>
		<li>Wykonaj powyższe kroki (3.1-4.4.2), aby określić współrzędne pikseli x, y dla dwóch kropek i wykorzystać te informacje do określenia liczby pikseli odpowiadającej cm. Ten współczynnik konwersji jest używany w kroku piątym do generowania danych o ruchu w cm. Uwaga: Po wykonaniu tej czynności ważne jest, aby kamera była nieruchoma dla wszystkich przyszłych nagrań. Za każdym razem, gdy kamera jest przesuwana lub dostosowywana, należy powtórzyć ten krok, aby przekonwertować piksele na cm.</li>
		<li>Długość ścieżki generowana przez wtyczkę Multitracker zawyża ruch, ponieważ niewielkie wahania pozycji ciała i natężenia/odbicia światła wpłyną na rozmiar i środek czarnej kropki, która jest generowana podczas progowania obrazów. Szum ten musi zostać usunięty, aby uzyskać dokładne oszacowanie ruchu muchy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych za pomocą Excela
<ol>
	<li>Usuń szum z zarejestrowanych danych, importując serię współrzędnych x, y wygenerowanych przez program Multitracker do Fly Analysis, programu Excel Visual Basic stworzonego przez autorów. (Program jest dostępny po skontaktowaniu się z autorami.)</li>
	<li>Kliknij przycisk Kliknij mnie i wybierz wartość progową. Wybierz wartość progową 0,5 cm/s dla analizy SLA lub wybierz wartość z zakresu 0,1-0,3 cm/s dla analizy ruchu. Kliknij OK, a program obliczy prędkość, czas i odległość ruchu. Uwaga: Program wykorzystuje analizę okna przesuwnego do oceny danych w sekwencyjnych przedziałach 0,5-1,0 s i oblicza prędkość w tym oknie. Wszystko, co znajduje się powyżej zdefiniowanego przez użytkownika punktu odcięcia, jest traktowane jako ruch muchy.</li>
</ol>

<ol><li>Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+manipulations+that+alter+metabolism+suppress+seizure-like+activity+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in.</a> 1496, 94-103 (2013).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Video+Tracking+of+Locomotion+in+Adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li>
<li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EthoVision+video+tracking+systema+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).</li>
<li>Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iFly+tracking+system+for+an+automated+locomotor+and+behavioural+analysis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster.</a> Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, (2002).</li>
<li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portrait+of+locomotor+behaviour+in+Drosophila+determined+by+a+video-tracking+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Processes%22%5BJournal%5D)">A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm.</a> Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).</li>
<li>Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+behaviour+and+locomotor+activity+by+takeout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).</li>
<li>Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+variability+of+sleep+and+activity+as+biomarkers+of+ageing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila.</a> Biogerontology. 13, 489-499 (2012).</li>
<li>Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+modulation+of+Drosophila+sleep-wake+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+%27%27Tracker%27%27+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program.</a> PLos ONE. 7, (2012).</li>
<li>Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+a+long-term+movement+abnormality+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+classic+galactosemia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia.</a> Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).</li>
<li>Seiger, M. B., Kink, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+anesthesia+on+the+photoresponses+of+four+sympatric+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Genet%22%5BJournal%5D)">The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila.</a> Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).</li>
<li>Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+easily+shocked+gene%3A+a+mutation+in+a+phospholipid+synthetic+pathway+causes+seizure%2C+neuronal+failure%2C+and+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis.</a> Cell. 79, 2333 (1994).</li>
<li>Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tko+locus%2C+site+of+a+behavioral+mutation+in+D.+melanogaster%2C+codes+for+a+protein+homologous+to+prokaryotic+ribosomal+protein+S12%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12.</a> Cell. 51, 165-173 (1987).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. , 187-534 (2011).</li>
<li>Hardie, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMP-activated+protein+kinase+in+the+metabolic+syndrome+and+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease.</a> FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharma%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badając wzorce lokomotoryczne lub ruchowe u Drosophila, przydatna jest możliwość wydobycia informacji dotyczących przebytej odległości, prędkości ruchu i wzorca ruchu. Aby wydobyć te informacje, tradycyjnie stosuje się drogi sprzęt, który często jest zaporowy dla mniejszych laboratoriów lub laboratoriów, które chcą oszczędnie korzystać z takich testów4,8,9.
Opisany tutaj test może być wykorzystany do określenia przebytej odległości (rysunki 2 i 6</s...

Biorąc pod uwagę jego krótką żywotność i solidne narzędzia genetyczne, Drosophila melanogaster jest doskonałym modelowym systemem do badania etiologii różnych chorób i leżącej u podstaw fizjologii różnych procesów biologicznych. W wielu przypadkach korzystne jest zmierzenie wpływu, jaki manipulacje behawioralne, genetyczne lub farmakologiczne wywierają na lokomocję w tych organizmach modelowych1,2.
Istnieje wiele metod, które są powszechnie używane do pomiaru ruchu muchy w dwóch wymiarach3-7. Systemy te mogą obsługiwać śledzenie wielu much jednocześnie i mogą mierzyć prędkość, rejestrować długość ścieżki i rejestrować procent czasu, jaki mucha spędziła w ruchu. Zostały one wykorzystane do badania ruchu w różnych kontekstach, w tym wpływu leków na lokomocję i dymorficznej natury płciowej ruchu muchy6-9. Główną wadą tych systemów jest koszt systemu śledzenia lub odpowiedniego oprogramowania i kamery. W niektórych przypadkach może to być tysiące dolarów. Koszt jest szczególnym problemem dla laboratorium, które potrzebowałoby jedynie ograniczonego wykorzystania takiego systemu, na przykład ilościowego określenia wzorców lokomotyw nowo wyizolowanego mutanta.
Prostszą, ale mniej solidną metodą jest użycie systemów, które rejestrują ruch na podstawie tego, ile razy mucha przecina ścieżkę wiązki światła podczerwonego, która jest umieszczona w środku zamkniętej rury10,11. Chociaż takie systemy mogą dostarczyć cennych informacji na temat ruchu i cykli snu i czuwania, mogą zawyżać lub zaniżać ruch, ponieważ nie są w stanie uchwycić rzeczywistej ścieżki muchy. Na przykład muchy, które wykazują znaczny ruch na końcach rurki, zostaną zarejestrowane jako muchy o niskim ruchu, chociaż zastosowano dodatkowe metody o wysokiej rozdzielczości, aby spróbować obejść te ograniczenia12.
Jeszcze prostsze i tańsze są urządzenia do wspinaczki, które mierzą geotaksję, ruch much w górę, przez pojedynczą rurę lub serię rur2,13. Chociaż takie systemy są tanie i mogą łatwo zidentyfikować wady geotaksji, nie są w stanie uchwycić wielu innych aspektów ruchu, które mogłyby być interesujące dla badaczy.
Dla wielu laboratoriów, tani, solidny system analizy, który jest prosty w konfiguracji i obsłudze, byłby korzystnym narzędziem do charakteryzowania różnic behawioralnych u szczepów D. melanogaster. Tutaj opisujemy test, który można ustawić za mniej niż dwieście dolarów i jest w stanie dostarczyć informacji o ścieżce, prędkości i czasie trwania ruchu muchy. Aby wykazać skuteczność testu, przedstawiamy dane pokazujące, że można go wykorzystać do identyfikacji; 1) wada ruchowa u mutanta wrażliwego na napady (BS), który jest podatny na napady padaczkowe oraz 2) zdolność leku metforminy, który jest powszechnie stosowany w leczeniu cukrzycy typu II, do zmniejszania intensywności aktywności podobnej do napadu (SLA) u dwóch mutantów BS.

<table><tbody><tr><td>Kamera internetowa</td><td>Logitech</td><td>Pro900</td><td>Wystarczy każda wysokiej jakości kamera internetowa.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie poklatkowe HandiAVI</td> Oprogramowanie <td></td><td>Azcendant</td><td>Najnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://www.azcendant.com/</td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Najnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Multiracker Plug-In</td><td>NIH</td><td></td><td>Najnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Wystarczą większość wirów o standardowych rozmiarach, takich jak Vortex Genie 2.</td></tr><tr><td>Pokrywa szalki Petriego 5 cm</td><td>LabM Limited</td><td>D011</td><td>Mniejsze lub większe osłony szalki Petriego mogą być używane do areny w teście ruchu.</td></tr><tr><td>Kaseton świetlny</td><td>wykonany na</td><td></td> zamówienie <td>Zbudowany ze złomu. Oświetlenie służy do testu lokomocji. W zależności od oświetlenia pomieszczenia możliwe jest wykonanie testu bez kasetonu.</td></tr></tbody></table>

tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u drosophila

A Low-cost Method for Analyzing Seizure-like Activity and Movement in Drosophila

Systemy śledzenia wideo były szeroko stosowane do analizy ruchów Drosophila melanogaster i wykrywania różnych nieprawidłowości w zachowaniu lokomotywy. Chociaż systemy te mogą dostarczać wielu informacji behawioralnych, koszt i złożoność tych systemów mogą być zaporowe dla wielu laboratoriów. Opracowaliśmy tani test do pomiaru zachowania lokomotywy i ruchu zatarciowego w D. melanogaster. System wykorzystuje kamerę internetową do przechwytywania obrazów, które można przetwarzać za pomocą połączenia niedrogiego i bezpłatnego oprogramowania do śledzenia przebytej odległości, średniej prędkości ruchu i czasu trwania ruchu w określonym przedziale czasu. Aby zademonstrować użyteczność tego systemu, zbadaliśmy grupę D. mutanty melanogastrowe, paralitycy wrażliwi na huk (BS), które są 3-10 razy bardziej podatne na aktywność podobną do napadów padaczkowych (SLA) niż muchy typu dzikiego. Korzystając z tego nowatorskiego systemu, byliśmy w stanie wykryć, że zmutowany BS bang senseless (bss) wykazuje niższy poziom lokomocji eksploracyjnej w nowym środowisku niż muchy typu dzikiego. Ponadto system został wykorzystany do określenia, że lek metformina, który jest powszechnie stosowany w leczeniu cukrzycy typu II, zmniejsza intensywność SLA u mutantów BS.

Opisana tutaj technika była wcześniej wykorzystywana do analizy różnic w SLA u mutantów BS Drosophila1. Przedstawione tutaj wyniki dotyczą szczepów BS easily shocked (eas), bang senseless (bss) oraz technical knockout (tko). Locus eas koduje kinazę etanolaminy zaangażowaną w syntezę fosfatydyloetanolaminy15, a locus tko koduje mitochondrialną ryboproteinę16. Mutacja bss jest allelem napięciowo zależn...

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Video tracking systems have been used widely to analyze Drosophila melanogaster movement and detect various abnormalities in locomotive behavior. While ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie zmian w zachowaniach lokomocyjnych lub napadach drgawkowych u drosophila. Osiąga się to poprzez początkowe rozdzielenie much do poszczególnych fiolek z wykorzystaniem anestezji. Następnie, do rejestracji ruchu much używana jest zwykła kamera internetowa.Następnie dane są importowane do programu Image J w celu rozpoczęcia analizy. W końcowym etapie wykorzystuje się specjalistyczne oprogramowanie do analizy ruchu much, aby wyznaczyć dystans, prędkość oraz czas trwania ruchu w okresie rejestracji. Ostatecznie test ten pozwala wykazać zmiany w zachowaniach lokomotorycznych lub napadach drgawek związanych z manipulacjami genetycznymi i farmakologicznymi.Opisana poniżej niskokosztowa technika rejestracji może być wykorzystana zarówno do analizy zachowań konwulsyjnych, jak i lokomocji u muszek owocówek. W szczególności wykorzystaliśmy ją do identyfikacji manipulacji genetycznych i farmakologicznych, które modyfikują zachowania konwulsyjne u tych much. Dzisiaj Chris Burner, student i asystent badawczy w moim laboratorium, zademonstruje tę technikę. Na początek należy przygotować kamerkę internetową, która będzie rejestrować muszki podczas testów lokomocyjnych i konwulsyjnych.Po ustawieniu kamery uruchom program oprogramowania handy a VI. Aby dostosować ustawienia nagrywania, wybierz opcję obrazów time-lapse w karcie przechwytywania, a po otwarciu nowego okna wybierz kamerkę internetową jako urządzenie przechwytujące. Dla większości eksperymentów rozmiar klatki wideo 640 na 480 jest odpowiedni. W opcji kompresji wybierz kodek Intel IUV i ustaw liczbę sekund na klatkę zgodnie z procedurą analizy.W karcie ustawień zaawansowanych (advanced) utwórz plik obrazu rastrowego dla każdego ujęcia i wybierz folder, w którym program ma zapisywać stos obrazów po nagraniu. Następnie umieść martwą muchę na kartce papieru. Kliknij pole ustawień wideo, a w karcie ustawień urządzenia dostosuj parametry tak, aby jasne, białe tło wyraźnie kontrastowało z ciemniejszą muchą.Kliknij przycisk start, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu okresu nagrywania kliknij przycisk stop. Stos obrazów powinien znajdować się teraz w folderze wybranym do rozpoczęcia analizy aktywności lokomotorycznej.Przenieś muchy do oddzielnych probówek zamkniętych watowanym korkiem. Pozostaw muchy w spokoju na 20–30 minut przed kontynuacją. Po tym czasie delikatnie wystukaj muchę przeznaczoną do badania z probówki pod przykrycie szalki Petriego.Pokrywa powinna posiadać małe nacięcia umożliwiające przepływ powietrza; umieść muchę pod wcześniej przygotowaną kamerą internetową. Po przygotowaniu naciśnij start, aby rozpocząć rejestrację aktywności lokomotorycznej. Pierwszym krokiem testu drgawek jest podanie dwudniowym muchom wrażliwym na drgawki standardowej pożywki lub pożywki zmieszanej z badanym lekiem.Po dwóch dniach karmienia przenieś muchy, delikatnie opukując probówki, do pojedynczych pustych fiolek i zamknij je za pomocą watowego czopa. Pozostaw muchy w spokoju na 20 minut przed rozpoczęciem obserwacji. Następnie wymieszaj zawartość fiolki w wstrząsaczu laboratoryjnym (vortex), używając najwyższych ustawień przez 10 sekund.Natychmiast umieść unieruchomioną muchę na białej kartce papieru bezpośrednio pod kamerą internetową. Po umieszczeniu owada rozpocznij nagrywanie aktywności muchy.Mucha będzie wykonywać gwałtowne, nieskoordynowane ruchy przeplatane okresami paraliżu. Rejestrację kończy się w momencie, gdy mucha odzyska równowagę. Aby rozpocząć analizę danych, należy uruchomić bezpłatny program do przetwarzania obrazów ImageJ.Zaimportuj wybrany stos obrazów, klikając najpierw kartę File, a następnie wybierając Import, a na koniec Image Sequence. Wybierz folder zawierający stos obrazów i otwórz obraz.Po otwarciu okna dialogowego opcji sekwencji wybierz opcję sortuj nazwy numerycznie, a następnie kliknij OK. Stos obrazów zostanie teraz załadowany do programu Image J. Następnie wybierz zakładkę Image i ustaw typ wartości na 8-bit. Ponownie kliknij zakładkę Image i w opcji Adjust wybierz Threshold.Operacja ta ustawia próg dla wszystkich obrazów w taki sposób, aby każdy z nich składał się z białego tła, przy czym mucha zostaje przekształcona w czarną kropkę. Otwiera to również okno dialogowe progu, w którym można dostosować punkty odcięcia. Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić, czy którykolwiek z nich zawiera dodatkowe czarne kropki lub czy plamka jest nieobecna.W razie potrzeby należy dostosować próg, aby rozwiązać ewentualne problemy. Po wprowadzeniu korekt należy wybrać opcję apply w oknie dialogowym progu. Gdy otworzy się okno dialogowe convert to mask, należy kliknąć okay, aby przeprowadzić progowanie stosu obrazów.Aby zmierzyć ruch muchy w pikselach, wybierz wtyczkę multi tracker w zakładce plugins. Gdy pojawi się okno dialogowe object tracker, zaznacz wszystkie cztery dostępne opcje i kliknij Okay. Wtyczka multi tracker przypisze następnie współrzędne do czarnego obszaru.w każdym przekroju, a następnie wyświetl je w oknie wyników wraz z całkowitą długością w pikselach. Okno ścieżek (paths window) zapewnia graficzną prezentację trasy, którą przebyła mucha. Skopiuj listę współrzędnych X i Y z okna wyników i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego Excel.Jeśli jakikolwiek preparat w stosie nie zawiera obszaru czarnego, program multi tracker zatrzyma się na tym preparacie. W takim przypadku należy ponownie ustawić próg dla stosu, aby upewnić się, że mucha jest rejestrowana jako obszar czarny.na analizowanym preparacie. Aby przeliczyć długość ścieżek z pikseli na centymetry, należy wykonać zdjęcie dwóch kropek oddalonych od siebie o znaną odległość na czystej, białej kartce papieru. Wyznacz współrzędne XY w pikselach dla obu kropek i wykorzystaj te informacje do określenia liczby pikseli odpowiadającej jednemu centymetrowi, aby uzyskać dokładniejsze wyniki.Usuń szum z obrazów, importując współrzędne XY do specjalistycznego programu do analizy much. Po otwarciu programu zaimportuj dane dla każdego genotypu lub grupy badawczej do osobnych arkuszy kalkulacyjnych. Następnie wybierz kartę arkusza podsumowania i kliknij przycisk „click me”.Wybierz wartość progu w zależności od rodzaju analizy, kliknij OK, a program obliczy prędkość, czas i dystans ruchu. Te reprezentatywne ścieżki pokazują aktywność przypominającą napady u much mutantów z zastosowaniem i bez zastosowania metforminy. Aktywność napadowa u obu badanych mutantów została zmniejszona po zastosowaniu leczenia.Metformina znacząco zredukowała zarówno dystans pokonany podczas testu drgawek, jak i całkowity czas trwania aktywności przypominającej drgawki. W przeciwieństwie do tego, nie odnotowano zmian w średniej prędkości na tych poszczególnych ścieżkach lokomocyjnych. Ścieżka muchy CS typu dzikiego wykazuje koncentrację wokół obrzeży kolistej areny.Podczas gdy ścieżka lotu mutantów BSS wykazuje taką samą koncentrację, ale z mniejszą całkowitą ruchliwością. Podczas badania lokomocji w nowym środowisku mutanty BSS wykazały znaczną redukcję długości ścieżki w porównaniu z muchami CS. Test wykazał również zmiany w prędkości poruszania się much CS podczas eksploracji w trakcie badania lokomocyjnego.Mucha BSS pozostawała stosunkowo nieaktywna przez cały czas trwania próby, z wyjątkiem kilku krótkich okresów aktywności. Jedną z najważniejszych kwestii, o której należy pamiętać podczas przeprowadzania któregokolwiek z tych testów behawioralnych przy użyciu tej techniki, jest upewnienie się, że muchy nie zostały zanestetyzowane przed dokonaniem pomiarów. Okazuje się, że znieczulenie wpływa zarówno na zachowanie podczas napadów, jak i na lokomocję, co może znacząco zmienić uzyskane wyniki.

a-low-cost-method-for-analyzing-seizure-like-activity-movement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Taniejsza metoda analizy aktywności przypominającej napady i ruch w Drosophila

Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.

Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Za pomocą elektrycznej stymulacji o wysokiej częstotliwości w organizmach Drosophila można wywołać aktywność przypominającą napady drgawkowe. Aktywność ta jest łatwo rejestrowana z systemu włókien olbrzymich.

Analizy obwodów neuronowych w celu badania napadów u mutantów Drosophila z epilepsją

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Test wyspowy jest stosunkowo nowym, opłacalnym testem, który może być użyty do oceny podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster. W tym manuskrypcie opisano algorytmy automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji danych z testów wyspowych, dzięki czemu test ten jest czułym, wysokowydajnym odczytem dla dużych badań genetycznych lub farmakologicznych.

Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie larw Drosophila do identyfikacji unikalnych związków przeciwpadaczkowych w leczeniu padaczki.

Aktywność napadowa wywołana elektrowstrząsami u larw Drosophila

Poznaj tanią metodę analizy aktywności ruchowej i napadów u Drosophila melanogaster z wykorzystaniem kamery internetowej oraz oprogramowania ImageJ. Technika ta umożliwia badanie wpływu modyfikacji genetycznych i farmakologicznych na zachowanie.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów