Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie zmian w zachowaniach lokomotorycznych lub napadowych u Drosophila. Osiąga się to poprzez najpierw rozdzielenie much na poszczególne fiolki za pomocą znieczulenia. Następnie prosta kamera internetowa służy do nagrywania ruchu much.

Dane są następnie importowane do obrazu J w celu rozpoczęcia analizy. Wreszcie, niestandardowe oprogramowanie do analizy much służy do określania odległości, prędkości i czasu trwania ruchu w okresie rejestrowania. Ostatecznie test ten może wykazać zmiany w zachowaniu lokomotorycznym lub napadowym, które są związane z manipulacjami genetycznymi i farmakologicznymi.

Ta tania technika nagrywania, którą zamierzamy opisać, może być wykorzystana zarówno do analizy zachowań napadowych, jak i lokomocji u muszek owocowych. W szczególności użyliśmy go do identyfikacji manipulacji genetycznych i farmakologicznych, które modyfikują zachowanie napadowe u tych muszek. Ale dzisiaj Chris Burner, asystent naukowy w moim laboratorium, zademonstruje tę technikę Aby rozpocząć konfigurację kamery internetowej, która będzie rejestrować muchy podczas testów lokomotorycznych i napadowych.

Po umieszczeniu kamery na miejscu otwórz poręczny program a VI. Aby dostosować ustawienia nagrywania, wybierz opcję zdjęć poklatkowych na karcie przechwytywania, a gdy otworzy się nowe okno, wybierz kamerę internetową jako urządzenie przechwytujące. W przypadku większości eksperymentów rozmiar klatki wideo sześć 40 na cztery 80 jest odpowiedni W ramach opcji kompresji wybierz kodek Intel IUV i ustaw sekundy na klatkę zgodnie z testem.

Na karcie Zaawansowane utwórz plik obrazu bitmapowego dla każdego przechwycenia i wybierz folder, w którym program ma przechowywać stos obrazów po nagraniu. Następnie umieść martwą muchę na kartce papieru. Kliknij pole ustawień wideo i na karcie ustawień urządzenia dostosuj ustawienia, aż jasne białe tło będzie wyraźnie kontrastować z ciemniejszą muchą.

Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu okresu nagrywania kliknij przycisk zatrzymania. Stos obrazów powinien teraz znajdować się w folderze wybranym, aby rozpocząć test aktywności lokomotorycznej.

Przenieść muchy do pojedynczych fiolek zakończonych bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju przez 20 do 30 minut przed kontynuowaniem. Po upływie tego czasu delikatnie postukać w muchę, która ma być poddana testowi, z fiolki i pod pokrywką szalki Petriego.

Osłona powinna zawierać małe szczeliny, aby umożliwić przepływ powietrza, ustaw rozporek pod wcześniej ustawioną kamerą. Gdy będziesz gotowy, naciśnij start, aby rozpocząć rejestrowanie aktywności lokomotorycznej. Pierwszym krokiem testu napadowego jest karmienie dwudniowych much wrażliwych na napady, albo standardową pożywką, albo pożywką zmieszaną z badanym lekiem.

Po dwóch dniach karmienia przenieś muchy, delikatnie stukając w pojedyncze puste fiolki i zakryj fiolki bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju przez 20 minut przed obserwacją. Gdy będziesz gotowy, wiruj fiolkę na wirze laboratoryjnym lub używając najwyższych ustawień przez 10 sekund.

Natychmiast umieść unieruchomioną muchę na białej kartce papieru bezpośrednio pod kamerą internetową. Po umieszczeniu na miejscu rozpocznij nagrywanie. To leci aktywność.

Mucha będzie przechodzić szybkie, nieskoordynowane ruchy przeplatane okresami paraliżu. Nagrywanie zostaje zakończone, gdy mucha się wyprostuje. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz bezpłatne oprogramowanie do przetwarzania obrazu obraz J po otwarciu.

Zaimportuj żądany stos obrazów, klikając najpierw kartę pliku, a następnie wybierając import. I wreszcie sekwencja obrazów. Wybierz folder zawierający stos obrazów i otwórz obraz.

Po otwarciu okna dialogowego opcji sekwencji wybierz pozycję sortuj nazwy numerycznie, a następnie wybierz. Porządku. Stos obrazów zostanie teraz załadowany do obrazu J.Następnie wybierz kartę obrazu i ustaw typ wartości na osiem bitów. Kliknij ponownie zakładkę obrazu i wybierz próg pod opcją dostosuj.

Spowoduje to ustawienie progu na wszystkich obrazach tak, aby każdy z nich składał się z białego tła, a mucha jest przekształcana w czarną kropkę. Spowoduje to również otwarcie okna dialogowego próg, w którym można dostosować punkty odcięcia. Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić, czy nie zawierają dodatkowych czarnych kropek lub czy brakuje miejsca.

W razie potrzeby dostosuj próg, aby złagodzić wszelkie problemy. Po wprowadzeniu zmian wybierz opcję Zastosuj w oknie dialogowym progu. Gdy otworzy się okno dialogowe konwertowania na maskę, kliknij przycisk OK, aby określić próg stosu obrazów.

Aby zmierzyć ruch muchy w pikselach, wybierz wtyczkę multi tracker w zakładce wtyczek. Gdy pojawi się okno dialogowe śledzenia obiektów, kliknij wszystkie cztery podane opcje i wybierz. Porządku. Wtyczka multi tracker dołączy następnie współrzędne do czerni.

w każdym wycinku i wymień je w oknie wyników, a także całkowitą długość w pikselach. Okno ścieżek wyświetla graficznie ścieżkę, którą przebyła mucha. Skopiuj listę współrzędnych X i Y z okna wyników i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego Excel.

Jeśli którykolwiek slajd w stosie nie ma w nim koloru czarnego, program Multi Tracker zatrzyma się na tym slajdzie. Jeśli tak się stanie, ponownie proguj stos, aby upewnić się, że mucha rejestruje się jako.

na danym slajdzie. Aby przekonwertować długości ścieżek z pikseli na centymetry, zrób obraz dwóch kropek oddalonych od siebie o znaną odległość na pustej białej kartce papieru. Określ współrzędne pikseli XY dla dwóch kropek i użyj tych informacji do określenia liczby pikseli odpowiadającej jednemu centymetrowi, aby uzyskać dokładniejsze wyniki.

Usuń szum z obrazów, importując współrzędne XY do niestandardowego programu do analizy much. Po otwarciu zaimportuj dane z każdego genotypu lub leczenia do oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych. Następnie wybierz kartę arkusza podsumowania i kliknij przycisk kliknij mnie.

Wybierz wartość progową zgodnie z typem analizy, kliknij OK, a program obliczy prędkość, czas i odległość ruchu. Te reprezentatywne ścieżki wykazują aktywność podobną do napadów u zmutowanych much z leczeniem metforminą i bez niej. Aktywność napadowa zmniejszyła się wraz z leczeniem u dwóch badanych mutantów.

Metformina istotnie zmniejszyła zarówno odległość przebytą podczas testu napadowego, jak i całkowity czas trwania aktywności podobnej do napadu. Nie zaobserwowano natomiast zmiany średniej prędkości w tych poszczególnych torach ruchu. Ścieżka dzikiej muchy CS pokazuje koncentrację na obrzeżach okrągłej areny.

Podczas gdy ścieżka zmutowanej muchy BSS wykazuje taką samą koncentrację, ale ogólnie z mniejszym ruchem. Podczas testów pod kątem lokomocji w nowym środowisku, mutanty BSS wykazały znaczne skrócenie długości ścieżki w porównaniu z muchami CS. Test wykrył również zmiany w prędkości ruchu, podczas gdy mucha CS badała podczas testu lokomotorycznego.

Mucha BSS pozostała stosunkowo nieaktywna przez cały czas trwania próby, z wyjątkiem kilku wybuchów aktywności. Jedną z najważniejszych rzeczy, o których należy pamiętać podczas wykonywania któregokolwiek z tych testów behawioralnych za pomocą tej techniki, jest upewnienie się, że nie znieczulasz much przed wykonaniem nagrań. Okazuje się, że znieczulenie wpłynie zarówno na zachowanie napadowe, jak i zachowanie lokomotywy i może znacznie zmienić wyniki.