Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów
26 lipca 2014
Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbki do krio-TEM poprzez ekstrakcję skupionej blaszki wiązki jonów z kriogenicznie zamrożonej próbki zbiorczej. Osiąga się to poprzez pierwsze zanurzenie, zamrożenie próbki w ciekłym azocie i umieszczenie jej w krioogniskowej wiązce jonów SEM. Drugim krokiem jest wycięcie cienkiego LA Melo z wiązką jonów i przeniesienie go na siatkę TEM za pomocą chłodzonego nano manipulatora.
Następnie siatka TEM jest przenoszona z uchwytu SEM do uchwytu TEM w stacji przesyłowej. Ostatnim krokiem jest przeniesienie uchwytu TEM do krio-TEM w celu dalszej analizy. Ostatecznie cryo TEM służy do wyświetlania obrazów o wysokiej rozdzielczości, tomo Grahamów lub map rentgenowskich wydobytej blaszki.
Technika ta umożliwi nam analizę miękkiej materii z najwyższą rozdzielczością w transmisyjnym mikroskopie elektronowym poprzez wstępny wybór miejsca analizy za pomocą innych mikroskopów, takich jak mikroskopia świetlna lub elektromikroskopia skaningowa. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikrotomia kriogeniczna Mac, jest to, że unika się artefaktów preparacji, takich jak kompresja i tworzenie def próbki. Najpierw zamontuj dwie siatki TEM dla próbek skupionej wiązki jonów.
Na uchwycie transferowym SEM zabezpiecz kratki, dokręcając odpowiednie śrubokrętem i zamknij żaluzje, zamontuj króciec próbki odpowiedni dla próbki i dodaj część próbki. Na przykład użyj pipety, aby osadzać kropelki na płaskim klocku. Następnie zamontuj uchwyt transferowy SEM na urządzeniu do transferu próżniowego lub VTD.
Po dodaniu ciekłego azotu do stacji slushingu i odpompowaniu, otwórz stację i zanurz ponownie zamrozić pompę uchwytu transferowego SEM, aż do zakończenia wrzenia i ponownego uzyskania błota pośniegowego. Następnie wsuń uchwyt transferowy SEM do komory próżniowej VTD i uszczelnij go. Odpowietrzyć stację spłukania i komorę przygotowania krio, odpowietrzyć śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę.
Następnie dopasuj uszczelkę VTD do śluzy powietrznej komory przygotowania kriogenicznego i pompy. Po osiągnięciu dobrego poziomu podciśnienia zmierz trzpień śluzy powietrznej, aby otworzyć uszczelkę VTD i zewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie włóż uchwyt transferowy SEM.
Następnie użyj zimnego noża, aby otworzyć pokrywy ochronne szczelin siatki TEM. Wyłączyć wysokie napięcie skupionej wiązki jonów SEM i otworzyć wewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie za pomocą VTD przenieś uchwyt SEM do komory na próbkę.
Gdy uchwyt SEM znajdzie się w zimnym stage, odłącz VTD, popychając i obracając. Wsuń pręt VTD do końca do komory próżniowej VTD i zamknij wewnętrzną śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę powietrzną i uszczelkę VTD. W tym momencie podgrzej gaz prekursorowy do temperatury od 24 do 26 stopni Celsjusza i umieść system wtrysku gazu lub igłę GIS na wysokości około jednego milimetra nad powierzchnią próbki.
Podczas obrazowania wiązką elektronów otwórz zawór gazowy na kilka sekund. Następnie utwardź osad w obszarze zainteresowania lub ROI za pomocą wiązki jonów o mocy 1000 pico ampire w małym powiększeniu. Po utwardzeniu przechylić próbkę pod kątem 52 stopni, tak aby powierzchnia była prostopadła do wiązki jonów.
Młyn daleko. Dwa okopy terrorystyczne. Po obu stronach ROI przechyl próbkę z powrotem do zera stopni i użyj wiązki jonów, aby odciąć boki i spód blaszki, upewniając się, że ślady cięcia przechodzą przez całą blaszkę.
Po wkłuciu igły GIS manewruj nanomanipulatorem, aż jego końcówka znajdzie się w fizycznym kontakcie z blaszką, najlepiej z boku. Otwórz zawór GIS na kilka sekund i monitoruj osadzanie kriogeniczne poprzez ciągłe obrazowanie wiązką elektronów. Po osadzeniu kriogenicznym warstwy platyny o grubości od jednego do dwóch mikrometrów, zamknij zawór po tym utwardzeniu platyny tylko w odległości kilku mikrometrów wokół punktu, w którym nanomanipulator styka się z blaszką.
Następnie użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć blaszkę. Ostrożnie manewruj nanomanipulatorem, aby wydobyć blaszkę z rowów i przesunąć ją na co najmniej 500 mikrometrów nad powierzchnię próbki. Po schowaniu igły obniż stolik próbki o kilka milimetrów i przesuwaj go, aż jedna z siatek TEM znajdzie się w zasięgu wzroku.
Przesuń obszar mocowania na siatce do pozycji roboczej i włóż igłę GIS. Następnie ostrożnie manewruj nanomanipulatorem, aby doprowadzić dołączoną lamelę do fizycznego kontaktu z obszarem mocowania na siatce TEM, otwórz zawór gazowy na kilka sekund i kriogenicznie zdeponuj dodatkową warstwę platyny o grubości od jednego do dwóch mikrometrów, utwardź platynę tylko w ciągu kilku mikrometrów wokół punktu styku lameli z siatką TEM. Następnie użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę od nano manipulatora.
Przechyl próbkę pod kątem 52 stopni i użyj wiązki jonów, aby rozrzedzić ją do przezroczystości elektronów. Po przepłukaniu stacji kriotransferowej suchym azotem gazowym, włóż uchwyt TEM do kriotransferu w odpowiednie szczeliny stacji kriotransferowej i napełnij ciekłym azotem. Następnie zanurz śrubokręt, narzędzie do zaciskania próbki TEM i pęsetę w kubku kriogenicznym wypełnionym ciekłym azotem, aby schłodzić ich końcówki do żądanej temperatury.
Po dopasowaniu VTD do zewnętrznej śluzy powietrznej, doprowadzić zimny stopień do wysokości transferu 16 milimetrów. Po wyłączeniu wysokiego napięcia otwórz uszczelkę VTD, zewnętrzną śluzę powietrzną i wewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie użyj pręta VTD, aby zablokować się w uchwycie transferowym SEM, popychając i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
W tym momencie wsuń uchwyt transferowy SEM do komory kriopreparacji. Użyj zimnego noża, aby zamknąć pokrywy ochronne kratek TEM. Następnie za pomocą pręta VTD przenieś próbkę do komory próżniowej VTD, zamknij i uszczelnij śluzę powietrzną.
Następnie odpowietrzyć zewnętrzną śluzę powietrzną i odłączyć VTD. Dopasuj VTD do portu SEM stacji kriotransferowej. Podczas płukania suchym azotem użyj kołka na stacji, aby otworzyć uszczelkę VTD i wsuń uchwyt transferowy SEM do doera stacji kriotransferowej.
Za pomocą schłodzonego śrubokręta otwórz jedną z pokryw i poluzuj odpowiednią, utrzymując siatkę TEM na miejscu. Następnie podnieś siatkę TEM i umieść ją w uchwycie TEM za pomocą schłodzonej pęsety. Następnie przymocuj siatkę TEM do uchwytu TEM.
Za pomocą chłodzonego pierścienia sześciokątnego zamknij przesłonę uchwytu kriotransferu TEM i odłącz stację kriotransferową od układu pompowego. Przetransportować stację i sterownik grzałki uchwytu TEM w pobliże TEM i podłączyć je ponownie. Ustaw stolik próbki TEM na nachylenie ujemne 70 stopni.
Następnie ustaw najkrótszy czas pompowania śluzy z tylko jednym cyklem przedmuchiwania suchym azotem gazowym. Wyjmij uchwyt TEM ze stacji kriotransferowej i włóż go do pierwszego stopnia przechylonego goniometru, który rozpocznie cykl pompowania. Po zakończeniu cyklu ustaw goniometr tak, aby odchylał się do tyłu do zera stopni, trzymając uchwyt TEM, aby nie obracał się wraz z goniometrem.
Następnie włóż uchwyt przez goniometr całkowicie do TEM. Na koniec napełnij uchwyt TEM do kriotransferu ciekłym azotem. W tej metodzie zarodniki aspergillus Niger są najpierw obrazowane za pomocą SEM w celu identyfikacji miejsca ekstrakcji.
Wystarczający jest przekrój poprzeczny dowolnego zarodnika, ale możliwe jest ustawienie ROI do ekstrakcji z precyzją submikrometrową, aby przeciąć określoną komórkę w określonej odległości od błony komórkowej. Po zidentyfikowaniu interesującej cechy wdrażany jest pierwszy etap osadzania kriogenicznego Aby chronić próbkę przed uszkodzeniem wiązki podczas mielenia jonowego, próbka jest nachylana pod kątem 52 stopni, a następnie napylana jest dwa rowy po obu stronach melli. Próbka jest następnie odchylana do tyłu i dalej mielona, pozostawiając tylko dwa małe mostki łączące ją z masą.
Schłodzony nanomanipulator styka się z mellą, a kolejne kriogeniczne osadzanie platyny lutuje je ze sobą. Małe mostki łączące są frezowane, a nanomanipulator przesuwa lamelę w pobliże obszaru mocowania klasy TEM, gdzie jest lutowana z końcowym krioosadzaniem platyny. Nanomanipulator jest następnie oddzielany od blaszki, która jest rozrzedzona do przezroczystości elektronów.
Za pomocą wiązki jonów blaszka jest przenoszona do TEM, gdzie można zastosować spektroskopię obrazowania o wysokiej rozdzielczości, tomografię i inne techniki. Metoda ta przyczyni się do lepszego zrozumienia granic faz miękkiej materii serca w systemach takich jak sondy neurologiczne czy implanty kostne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki cryo TM, które są artefaktem trzecim i które można pobrać z określonego obszaru próbki robaka z precyzją submikrometrową.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę przygotowywania próbek biologicznych do krio-transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM) z wykorzystaniem technik skupionej wiązki jonów (FIB). Metoda ta umożliwia obrazowanie materii miękkiej z wysoką rozdzielczością przy jednoczesnym zminimalizowaniu artefaktów powstających podczas przygotowania próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie biologiczne
- Krio-mikroskopia elektronowa
Wprowadzenie
- Kriomikroskopy elektronowe są niezbędne do analizy próbek biologicznych.
- Techniki skupionej wiązki jonów (FIB) usprawniają przygotowanie próbek do kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM).
- Minimalizacja artefaktów jest kluczowa dla uzyskania dokładnych obrazów.
- Metoda ta umożliwia wstępny wybór obszarów analizy przy użyciu innych technik mikroskopowych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody przygotowania próbek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-TEM).
- Uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości dla miękkich materiałów biologicznych.
- Uniknięcie artefaktów przygotowania, które mogą zniekształcić wyniki.
Zastosowane metody
- Wizualizacja próbek poprzez szybkie mrożenie w ciekłym azocie.
- Wykorzystanie skupionej wiązki jonów do wycinania cienkich lameli.
- Przenoszenie lameli na siatki TEM za pomocą chłodzonego nanomanipulatora.
- Obrazowanie i analiza wysokiej rozdzielczości przy użyciu cryo-TEM.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja i transfer lameli do obrazowania.
- Wykazanie możliwości obrazowania wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-TEM.
- Zminimalizowanie artefaktów przygotowania próbek w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Umożliwienie szczegółowej analizy struktur materii miękkiej.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w przygotowywaniu próbek do cryo-TEM.
- Zapewnia ona obrazy o wysokiej rozdzielczości przy jednoczesnym ograniczeniu artefaktów.
- Technika ta usprawnia analizę próbek biologicznych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjne przygotowanie próbek do kryo-TEM z minimalizacją artefaktów poprzez wycinanie cienkich lameli z zamrożonych preparatów biologicznych przy użyciu skupionej wiązki jonów (FIB). Wspiera ona walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych fazach odkryć, zapewniając submikrometrową precyzję wyboru obszaru zainteresowania, co redukuje niejednoznaczność w analizie strukturalnej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w dalszych etapach procesów badawczych poprzez zachowanie natywnej ultrastruktury oraz umożliwienie obrazowania o wysokiej rozdzielczości interfejsów materii miękkiej istotnych dla neurobiologii i materiałów implantacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednią wizualizację struktur subkomórkowych w stanie natywnym.
- Wartość operacyjna: Redukuje artefakty przygotowawcze, które mogłyby zakłócić badania nad angażowaniem celu lub mechanizmem działania.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych strukturalnych do oceny wiodących kandydatów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do procesów korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek w celu zapewnienia powtarzalnej analizy ultrastrukturalnej w ramach kampanii przesiewowych.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu klas celów wymagających walidacji strukturalnej w nanoskali.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrycia z walidacją przedkliniczną, umożliwiając spójną ocenę ultrastrukturalną w różnych systemach modelowych.
- Dostrojenie biomarkerów: Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych poprzez mapowanie kompleksów białkowych lub domen błonowych w wysokiej rozdzielczości.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), minimalizując liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z artefaktów przygotowania próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania – od walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne – dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych ultrastrukturalnych, które umożliwiają zrozumienie mechanizmów działania oraz ocenę związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy struktur komórkowych w konkretnych miejscach.
- Przesiewy: Poprawia gotowość do przeprowadzania testów, dostarczając próbki wolne od artefaktów do wiarygodnych przesiewów fenotypowych indukowanych związkami chemicznymi.
- Analityka: Generuje pomiary ilościowe, takie jak grubość lamelli, krzywizna błony i gęstość białek, w celu porównawczej analizy warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zachowaniu cech ultrastrukturalnych istotnych dla modeli chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda walidacji strukturalnej w wielu projektach i klasach celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki obrazowaniu natywnych stanów biologicznych w wysokiej rozdzielczości z zminimalizowaną liczbą artefaktów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność przygotowania próbek kriogenicznych w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz ograniczenie niepowodzeń na późnych etapach wynikających z błędnej interpretacji biologicznej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja oparta na ryzyku, ugruntowana w zwalidowanych danych strukturalnych, a nie w podatnych na artefakty zamiennikach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kriomikroskopii elektronowej, obsługi skupionego strumienia jonów oraz technik nanomanipulacji.
- Zależne od dostępu do systemów cryo-FIB/SEM, stacji kriotransferu oraz chłodzonych nanomanipulatorów.
- Wymaga standaryzacji obsługi próbek, protokołów mrożenia i przygotowania siatek pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zanieczyszczeń.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują typ preparatu, geometrię siatki oraz parametry wiązki jonowej dla różnych systemów biologicznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od umiejętności operatora w celu uniknięcia zanieczyszczeń podczas ekstrakcji i transferu lamelli.
