Name: Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę przygotowania próbek do krio-TEM za pomocą skupionej wiązki jonów. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości materiałów biologicznych przy minimalnym ryzyku artefaktów przygotowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie otrzymało wsparcie od http://www.qnano-ri.eu projektu QNano, który jest finansowany przez Infrastrukturę Badawczą Wspólnoty Europejskiej w ramach Programu Możliwości 7PR (Grant No. INFRA-2010-262163).
Dziękujemy również radzie badawczej Formas za wsparcie finansowe.

UWAGA: wszystkie parametry podane w tym protokole są ważne dla wskazanych tutaj instrumentów i modeli. Niektóre z tych parametrów (oznaczone w tekście gwiazdką) mogą się różnić, jeśli używany jest inny producent lub model.
1. Uruchomienie FIB/SEM
<ol>
	<li>Zamontuj specjalnie zbudowaną końcówkę zimnego nanomanipulatora (NM) bez dołączania oplotów Cu do antyskaminatora (AC). Zamiast tego upewnij się, że warkocze są połączone z resztą NM powyżej punktu izolacji, aby zapobiec ładowaniu się podczas etapu ostrzenia (1.2).
	<ol>
		<li>Zamknij komorę SEM, przepompuj do wysokiej próżni i zobrazuj końcówkę NM.</li>
		<li>Jeśli końcówka jest, wygięta lub zanieczyszczona poprzednim użyciem, naostrz ją za pomocą wiązki jonów: wybierz wielokątne wzory frezowania wzdłuż boków końcówki, tak aby po frezowaniu końcówka zwężała się do 1 μm lub mniej.</li>
		<li>Po wyfrezowaniu boków końcówki należy ręcznie obrócić o 90° cały pręt NM od zewnątrz komory SEM.</li>
		<li>Dostosuj wzory frezowania wielokątnego, aby dostosować się do obróconej końcówki i powtórz frezowanie pod innym kątem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy końcówka zostanie naostrzona na mniej niż 1 μm, wycofaj NM i włóż igłę systemu wtrysku gazu (GIS); zmień położenie igły tak, aby znajdowała się około 1 mm powyżej odległości roboczej (zamiast zwykłych 175 μm).</li>
	<li>W przypadku stosowania prekursora Pt należy zmienić jego temperaturę roboczą na 24-26 °C (zamiast zwykłych 40 °C). Te kroki są potrzebne do kriodepozycji13 z Pt.</li>
	<li>Otwórz komorę SEM i przygotuj FIB/SEM do trybu kriogenicznego, montując stolik na kriopróbkę i prąd przemienny.</li>
	<li>Przełącz NM do pozycji włożonej i podłącz jego oploty Cu do AC. Uważaj, aby przypadkowo nie dotknąć końcówki NM. System jest chłodzony z włożonym NM, aby upewnić się, że utrata elastyczności oplotu Cu w temperaturach kriogenicznych nie będzie utrudniać ruchu NM.</li>
	<li>Przedmuchiwać rury do chłodzenia suchym azotem przez kilka minut.</li>
	<li>Przepompuj komorę przygotowania kriogenicznego i główną komorę próbki do wysokiej próżni.</li>
	<li>Dodaj ciekły azot do Dewarsa, aby schłodzić obie komory. Poczekaj, aż zostanie osiągnięta żądana temperatura.</li>
</ol>
2. Zamrażanie próbki
<ol>
	<li>
	<ol>
		<li>Zamontuj dwie siatki TEM dla próbek FIB na uchwycie transferowym SEM. Zabezpiecz je, dokręcając odpowiednie śrubokrętem.</li>
		<li>Zamontuj króciec próbki odpowiedni dla próbki i dodaj część próbki. W zależności od rodzaju próbki, próbkę można utrwalić za pomocą kleju kriogenicznego lub zacisku. Używaj jak najmniejszych ilości, aby zapewnić optymalne zamrażanie.</li>
		<li>Zamontuj uchwyt transferowy SEM na urządzeniu do transferu próżniowego (VTD).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Dodaj ciekły azot do stacji błota pośniegowego i pompuj w dół, aby uzyskać błoto pośniegowe azotu.</li>
		<li>Otwórz stację spłukania i zanurz uchwyt transferowy SEM. Pompuj ponownie, aż gotowanie zostanie zakończone i ponownie uzyskasz błoto pośniegowe. Należy zauważyć, że błoto pośniegowe etan lub propan lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem są bardziej odpowiednimi technikami do uzyskania witryfikacji próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Wsunąć uchwyt transferowy SEM do komory próżniowej VTD i uszczelnić go.</li>
		<li>Odpowietrzyć stację błota pośniegowego i śluzę powietrzną komory przygotowania kriogenicznego.</li>
		<li>Dopasuj uszczelkę VTD do śluzy powietrznej komory przygotowania kriogenicznego i pompy.</li>
		<li>Po osiągnięciu dobrego poziomu podciśnienia zatrzasnąć sworzeń śluzy powietrznej, aby otworzyć uszczelkę VTD i zewnętrzną śluzę powietrzną; włożyć uchwyt transferowy SEM. Na stykach ślizgowych w komorach przygotowawczych znajdują się oznaczenia wskazujące pozycję próbki do rozpylania i pękania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby próbka może być: rozbita zimnym nożem; poddana sublimacji przez ustawienie wyższej temperatury (zwykle -100 °C); pokryta Au/Pd lub Pt za pomocą rozpylacza na zimno (300 V, 10 mA, 60 s dla nasadki Au/Pd 2-3 nm)*. Sublimacji nie należy stosować w przypadku próbek zeszklonych, aby uniknąć ich rekrystalizacji.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Użyj zimnego noża, aby otworzyć pokrywy ochronne szczelin siatki TEM.</li>
		<li>Doprowadzić zimny stolik w komorze na próbkę do wysokości odbioru (16 mm*).</li>
		<li>Wyłączyć HT w FIB/SEM i otworzyć wewnętrzną śluzę powietrzną.</li>
		<li>Użyj VTD, aby przenieść uchwyt SEM do komory na próbkę. W tym kroku może pomóc przyciemnienie oświetlenia w pomieszczeniu.</li>
		<li>Gdy uchwyt SEM znajdzie się w zimnym stage, odłącz VTD, popychając i obracając.</li>
		<li>Wsuń pręt VTD do końca do komory próżniowej VTD i zamknij wewnętrzną śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę powietrzną i uszczelkę VTD. Zewnętrzną śluzę powietrzną można teraz odpowietrzyć, aby usunąć uszczelkę VTD. Ten ostatni krok nie jest wymagany, ale jest zalecany, ponieważ pręt VTD może zostać łatwo przemieszczony przez przypadkowy, co może spowodować uszkodzenie VTD lub śluzy powietrznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mielenie jonowe
<ol>
	<li>Włącz wysokie napięcie na obu kolumnach i ustaw odpowiednie parametry obrazowania (napięcie przyspieszające: 10 kV dla wiązki elektronów, 30 kV dla wiązki jonów; wielkość plamki: 3; odległość robocza: 5 mm, prąd wiązki jonów: 10-100 pA dla obrazowania, 1-3 nA dla frezowania)*.</li>
	<li>Użyj wiązki elektronów, aby znaleźć interesującą cechę i uzyskać obrazy w celu udokumentowania stanu próbki przed ekstrakcją blaszki.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania (ROI) do ekstrakcji należy go oznaczyć za pomocą wzoru wiązki jonów, chyba że topografia samej próbki pozwala na łatwą identyfikację ROI nawet po osadzeniu Pt. Aby zwiększyć precyzję, użyj metody opisanej przez Petterssona i wsp. 14 Oznaczenia powinny być głębokie, szerokie i na tyle daleko, aby były nadal widoczne po pokryciu przez osadzanie cryo-Pt (które jest nieselektywne i obejmuje kilkamm2 powierzchni próbki).</li>
	<li>Podgrzać gaz prekursorowy do temperatury 24-26 °C i wprowadzić igłę GIS na wysokość około 1 mm powyżej powierzchni próbki (patrz również krok 1.3).</li>
	<li>Podczas obrazowania wiązką elektronów otwórz zawór gazowy na kilka sekund. Szybkość osadzania cryo-Pt wynosi 100-500 nm/s lub więcej, w zależności od odległości igły GIS, chropowatości próbki i systemu użytkownika. Wskazane jest przeprowadzenie kilku depozycji testowych w celu określenia optymalnych parametrów.</li>
	<li>Osadzanie surowego krio-Pt jest bardzo szorstkie i niejednorodne. Utwardź osad nad ROI za pomocą wiązki jonów o natężeniu 1,000 pA przy małym powiększeniu (na przykład 2,000X). W przeciwieństwie do osadzania kriogenicznego, to utwardzanie jest selektywne i powinno być wykonywane tylko na ROI. Celem tego pierwszego krioosadzania jest ochrona powierzchni próbki przed uszkodzeniem wiązki jonów i zmniejszenie zasłony podczas rozrzedzania jonów13.</li>
	<li>Przechylić próbkę pod kątem 52° tak, aby powierzchnia była prostopadła do wiązki jonów. Zmiel dwa tarasowe rowy po obu stronach ROI. Typowe wymiary wykopów to 20-30 μm w kierunku (X) równoległym do lameli do wydobycia, 10-15 μm w kierunku prostopadłym (Y) oraz o zmiennej, nachylonej głębokości (Z), przy czym najgłębszy punkt znajduje się blisko ROI. Nachylenie powinno wynosić 45-55°. W niektórych instrumentach rowy tarasowe można frezować tylko z najgłębszym punktem na górze. W takim przypadku należy frezować jeden pod ROI, a następnie obrócić obraz o 180° i frezować drugi po drugiej stronie. Głębokość frezowania można wybrać, jeśli znana jest szybkość napylania materiału. W przypadku większości próbek mrożonych uwodnionych można zastosować szybkość rozpylania lodu7.</li>
	<li>Przechylić próbkę z powrotem do 0° i użyć wiązki jonów, aby odciąć boki i spód blaszki, upewniając się, że ślady cięcia przechodzą przez całą lamelę (powinny pozostawić ślady frezowania na tarasowych zboczach wyfrezowanych w poprzednim kroku). Pozostawić tylko dwa małe mostki łączące blaszkę z resztą próbki.</li>
	<li>Włóż igłę GIS (może to nieznacznie przesunąć próbkę). Manewruj NM tak, aż jego końcówka znajdzie się w fizycznym kontakcie z blaszką, najlepiej z boku. Upewnij się, że NM nie zasłania wiązki jonów view dwóch małych mostów łączących.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Otwórz zawór GIS na kilka sekund i monitoruj osadzanie kriogeniczne poprzez ciągłe obrazowanie wiązką elektronów.</li>
		<li>Po osadzeniu kriogenicznym dodatkowej warstwy 1-2 μm Pt, zamknij zawór.</li>
		<li>Utwardzać Pt (patrz krok 2.6) tylko w kilku μm wokół punktu, w którym NM styka się z blaszką.</li>
		<li>Użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę. Dwa mostki łączące powinny zostać wyfrezowane, podobnie jak wszelki nadmiar Pt, który mógł utworzyć nowe punkty kontaktowe między blaszką a resztą próbki. Nie należy jeszcze wciągać igły GIS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie manewrować NM, aby wydobyć blaszkę z rowów i przesunąć ją co najmniej 500 μm nad powierzchnię próbki. Dopiero po tym kroku należy schować igłę GIS.</li>
	<li>Obniż stolik na próbkę o kilka mm i przesuwaj go, aż jedna z siatek TEM znajdzie się w polu widzenia. Przesuń obszar mocowania na siatce do pozycji roboczej i włóż igłę GIS.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Ostrożnie manewruj NM, aby dołączona blaszka zetknęła się fizycznie z obszarem mocowania na siatce TEM. Nie powinno być nacisku ani naprężenia między blaszką, siatką TEM i NM.</li>
		<li>Otwórz zawór gazowy na kilka sekund i krioosadzaj dodatkową warstwę Pt o grubości 1-2 μm.</li>
		<li>Utwardzać Pt (patrz krok 2.6) tylko w odległości kilku μm wokół punktu styku między blaszką a siatką TEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę od NM. Można to osiągnąć poprzez wyfrezowanie końcówki NM lub boku próbki. W pierwszym przypadku końcówka będzie musiała zostać ponownie naostrzona przed następnym użyciem, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>OPCJONALNIE: na tym etapie możliwe jest użycie VTD do pobrania uchwytu transferowego SEM i przechowania go O/N w Dewarze wypełnionym ciekłym azotem. To przenoszenie i magazynowanie O/N może spowodować tworzenie się lodu na powierzchni blaszki, jeśli kryształki lodu są już obecne i/lub jeśli ciekły azot jest wystawiony na działanie wilgotnego powietrza; Ale takie zanieczyszczenie zostanie usunięte przez następny krok w stosunkowo krótkim czasie. Z uwagi na to, że wykonanie poprzednich etapów mogło zająć kilka godzin, może to być właściwe, ponieważ po następnym kroku takie przechowywanie O/N nie jest zalecane, ponieważ nie byłoby innego sposobu na usunięcie zanieczyszczenia lodem niż sublimacja (której nie można przeprowadzić, jeśli ma być utrzymana witryfikacja próbki).</li>
	<li>Przechyl próbkę pod kątem 52° i użyj wiązki jonów, aby rozrzedzić ją do przezroczystości elektronów7. Zaleca się rozpoczęcie od wyższych, bardziej szorstkich prądów wiązki, aby usunąć masę i przystąpić do dokładnego polerowania powierzchni za pomocą prądów dolnej wiązki, ostatecznie zmniejszając również napięcie przyspieszające. Ostateczna grubość lameli powinna wynosić 100-200 nm lub mniej w przypadku analizy ultrastruktury w TEM 100-200 kV lub do 500 nm w przypadku tomografii w TEM 300 kV, w zależności od składu próbki. Podczas rozcieńczania naprężenia wewnętrzne próbki mogą powodować zwijanie się lub wyginanie blaszki. W takim przypadku należy ograniczyć przerzedzony obszar. Stało się tak na przykład na rysunkach 11 i 12.</li>
</ol>
4. Transfer kriogeniczny do TEM
<ol>
	<li>
	<ol>
		<li>Przepłukać stację kriotransferową suchym azotem przez kilka minut.</li>
		<li>Dodać ciekły azot do Dewara TEM AC i do stacji kriotransferowej.</li>
		<li>Włóż uchwyt TEM do kriotransferu w odpowiednie gniazdo stacji kriotransferu i napełnij go również Dewarem. Poczekaj, aż każdy składnik osiągnie żądaną temperaturę (około 15 minut). Jeśli to możliwe, należy podłączyć sterownik uchwytu TEM do kriotransferu, aby monitorować temperaturę podczas transferu. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że końcówka uchwytu TEM (gdzie znajduje się czujnik temperatury) będzie stykać się ze stacją kriotransferową i dlatego ostygnie znacznie szybciej niż reszta uchwytu TEM. Dlatego zaleca się, aby czas potrzebny do schłodzenia całego uchwytu do kriotransferu TEM został wcześniej zmierzony i aby system mógł ulec termalizacji przez co najmniej taki czas.</li>
		<li>Napełnij kubek kriogeniczny ciekłym azotem i zanurz w nim: narzędzie do zaciskania próbki TEM, śrubokręt i pęsetę, aby schłodzić ich końcówki do żądanej temperatury. Wszystkie narzędzia powinny być odpowiednio izolowane na drugim końcu, aby nie spowodować zimnych oparzeń dłoni operatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasuj VTD do zewnętrznej śluzy powietrznej. Doprowadzić zimny stopień do wysokości transferu (16 mm*). Wyłącz wysokie napięcie.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Otwórz uszczelkę VTD, zewnętrzną śluzę powietrzną i wewnętrzną śluzę powietrzną.</li>
		<li>Użyj pręta VTD, aby zablokować się w uchwycie transferowym SEM, popychając i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
		<li>Wciągnąć uchwyt transferowy SEM do komory kriopreparacji.</li>
		<li>Użyj zimnego noża, aby zamknąć pokrywy ochronne kratek TEM. Jest to konieczne, aby zmniejszyć ewentualne zanieczyszczenie lodem podczas przenoszenia.</li>
		<li>Użyj pręta VTD, aby przenieść próbkę do komory próżniowej VTD.</li>
		<li>Zamknij śluzy powietrzne i uszczelnij.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpowietrzyć zewnętrzną śluzę powietrzną i odłączyć VTD. Dopasuj VTD do portu SEM stacji kriotransferowej. Podczas płukania suchym azotem użyj kołka na stacji, aby otworzyć uszczelkę VTD i wsuń uchwyt transferowy SEM do Dewara stacji kriotransferowej.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Dodaj tyle ciekłego azotu, aby poziom w stacji kriotransferowej był wystarczająco wysoki, aby po prostu zanurzyć próbkę.</li>
		<li>Użyj wcześniej schłodzonego śrubokręta, aby otworzyć jedną z pokryw i poluzować odpowiednią, która utrzymuje kratkę TEM na miejscu.</li>
		<li>Użyj wcześniej schłodzonej pęsety, aby wybrać siatkę TEM i umieścić ją w uchwycie TEM.</li>
		<li>Użyj chłodzonego pierścienia sześciokątnego, aby przymocować siatkę TEM do uchwytu TEM.</li>
		<li>Zamknij migawkę uchwytu TEM do kriotransferu. Etap przenoszenia próbki ma kluczowe znaczenie i może być utrudniony przez gazowy azot, który zmniejsza widoczność małej próbki TEM.</li>
		<li>Odłączyć stację kriotransferową od systemu pompowania i przetransportować ją w pobliże TEM wraz ze sterownikiem grzałki uchwytu TEM do kriotransferu.</li>
		<li>Uruchom pompę turbomolekularną TEM, aby przepompować linię podkładową do śluzy powietrznej TEM.</li>
		<li>Ustaw stolik na próbki TEM pod kątem -70°.</li>
		<li>Ustaw najkrótszy czas pompowania śluzy (30-60 sekund), z tylko jednym cyklem przedmuchiwania suchym azotem gazowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że przesłona ochronna na uchwycie kriotransferu TEM jest zamknięta. Wyjmij uchwyt TEM ze stacji kriotransferowej i włóż go do przechylonego goniometru (ciekły azot wyleje się z uchwytu TEM Dewara). Rozpocznie się cykl pompowania. Po zakończeniu cyklu ustaw goniometr tak, aby przechylił się z powrotem do 0° i jednocześnie przytrzymaj uchwyt TEM tak, aby nie obracał się wraz z goniometrem. Włóż go całkowicie do TEM. Na tym etapie uchwyt kriotransferu TEM powinien być podłączony do sterownika grzałki w celu monitorowania temperatury. Procedura wkładania uchwytu próbki do TEM może się różnić w zależności od TEM. Dlatego zaleca się skontaktowanie się z producentem TEM w celu uzyskania odpowiedniej procedury.</li>
	<li>Napełnij uchwyt TEM do kriotransferu Dewara. Poczekaj, aż próżnia w TEM osiągnie akceptowalny poziom.</li>
</ol>

<ol><li>Echlin, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEchlin%2C+P+%22Low+Temperature+Microscopy+and+Analysis%22">Low Temperature Microscopy and Analysis</a>. , Plenum Press. New York. (1992).</li>
<li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy.</a> J. Struct. Biol. 180, 572(2012).</li>
<li>Studer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285(2001).</li>
<li>Umrath, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooling+bath+for+rapid+freezing+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy.</a> J. Microsc. 101, 103(1974).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212, 34(2003).</li>
<li>Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElder%2C+H+%22Cryo+fixation.+Techniques+in+Immunocytochemistry%22">Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiannuzzi%2C+LA+%22Introduction+to+Focused+Ion+Beams%22">Introduction to Focused Ion Beams</a>. , Springer. New York. (2005).</li>
<li>Marko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy.</a> Nat. Methods. 4, 215(2007).</li>
<li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+frozen-hydrated%2C+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 172, 180(2010).</li>
<li>Rigort, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).</li>
<li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue%3A+electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> J. Struct. Biol. 153, 1(2006).</li>
<li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> J. Microsc. 131, 1(1983).</li>
<li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+improved+focused+ion+beam+milling+of+cryo-prepared+life+science+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens.</a> J. Microsc. 226, 263(2007).</li>
<li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73(2013).</li>
<li>Wätjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu+out-diffusion+in+kesterites%E2%80%94A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest dość prostą adaptacją do temperatur kriogenicznych standardowego przygotowania próbek FIB/TEM stosowanego w materiałoznawstwie w RT. W wyniku tej metody próbki TEM są wolne od odkształceń mechanicznych i śladów noża (główna wada mikrotomii), chociaż może wystąpić zasłonięcie, jeśli powierzchnia próbki jest niejednorodna. Można to zmniejszyć poprzez krioosadzanie warstwy wierzchniej (w tej pracy użyto Pt), utwardzanej do uzyskania gładkiej i pozbawionej cech13. Można również przygotować próbki ze składnikami o bardzo różnej twardości bez ryzyka, że pękną one pod wpływem naprężeń podczas przygotowania. Naprężenia wewnętrzne mogą nadal powodować wyginanie się lub zwijanie cienkiej lameli, w takim przypadku rozmiar przekroju musi zostać zmniejszony. Wadą w porównaniu z innymi metodami jest możliwość zmiany struktury biologicznej w wyniku ekspozycji na wiązkę jonów i ewentualnego zagnieżdżenia się jonów w próbce. Wady te występują również w RT do przygotowania próbek w materiałoznawstwie15. Można je zmniejszyć, kończąc rozcieńczanie końcowym etapem polerowania przy najniższym napięciu przyspieszającym jony (500-1 000 V). Ten bardzo delikatny etap polerowania usunie uszkodzoną warstwę z lameli.
Ze względu na charakter kriodepozycji (kroki 3.5, 3.10 i 3.13), duże części próbki zostaną pokryte, zasłaniając w ten sposób widok pierwotnej powierzchni. Może to utrudnić śledzenie zwrotu z inwestycji, chyba że używa się wielu oznaczeń, jak sugerowano w kroku 3.3.
Podczas kroków 4.5 i 4.7 cienka blaszka może wejść w kontakt z powietrzem. Należy tego unikać, ponieważ spowodowałoby to tworzenie się kryształków lodu przez wilgoć w powietrzu na powierzchni próbki, co mogłoby doprowadzić do zasłonięcia ważnych cech. Czynności te powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe, ale jednocześnie niewłaściwe obchodzenie się z nimi podczas przenoszenia może spowodować utratę samej próbki. Zaleca się, aby użytkownik przećwiczył te kroki, używając pustych siatek TEM przed podjęciem próby na prawdziwej próbce.
W materiałoznawstwie instrument FIB stał się główną metodą przygotowania próbek TEM w ciągu dekady od jego komercjalizacji. Ponieważ może być stosowany na praktycznie każdej próbce, eliminuje konieczność dostosowywania techniki przygotowania do rodzaju próbki. Jesteśmy głęboko przekonani, że to samo może się zdarzyć w temperaturach kriogenicznych, dzięki procedurze opisanej tutaj. Jego zastosowanie do większych próbek jest nadal uzależnione od możliwości ich kriokonserwacji w stanie zeszklonym, ale techniki takie jak zamrażanie wgłębne lub zamrażanie wysokociśnieniowe3,5 mogą okazać się optymalnymi rozwiązaniami tego problemu.

W tym protokole cryo-FIB/SEM jest używany do produkcji próbek TEM z określonego regionu próbki, wcześniej zidentyfikowanego z dużą precyzją przez analizę SEM. Mikroskopia elektronowa (skaningowa lub transmisyjna) analiza próbek biologicznych jest rutynową techniką stosowaną w badaniach i diagnostyce. SEM jest dość szybki i łatwy w zastosowaniu i interpretacji, ale informacje uzyskuje się tylko z powierzchni próbki i z rozdzielczością w zakresie 1,5 nm. TEM ma wyższą rozdzielczość, ale jest trudniejszy do wdrożenia, analiza obrazu jest mniej prosta, a podczas uzyskiwania informacji masowych próbki muszą być rozrzedzane do przezroczystości elektronów (o grubości mniejszej niż około 500 nm). Dodatkowym problemem jest to, że wymagania dotyczące próżni w tych instrumentach są rzadko tolerowane przez próbki zawierające wodę. W większości przypadków próbki biologiczne muszą być albo utrwalone chemicznie (zastępując wodę np. polimerami), albo wysuszone. W obu przypadkach prawdopodobne jest wystąpienie znaczących zmian w morfologii i strukturze okazu. Przygotowanie uwodnionych próbek metodą Cryo TEM wywołuje minimalne zmiany chemiczne i pozwala uzyskać próbki jak najbardziej zbliżone do ich stanu pierwotnego, zwłaszcza jeśli uzyskuje się witryfikację lodu1-6.
FIB jest powszechnie używany do przygotowywania próbek TEM ze względu na jego liczne zalety7. Aby wymienić tylko kilka: zastosowanie jonów o wysokiej energii przy niemal normalnej częstości występowania minimalizuje wpływ różnic w mieleniu związanych z materiałem; Obszar wyekstrahowany z próbki zbiorczej można wybrać z dokładnością submikronową; Wydobywana jest bardzo mała ilość materiału. Najnowsze osiągnięcia techniczne umożliwiły zastosowanie FIB również do przygotowania próbek TEM w temperaturach kriogenicznych2,8-10. Istnieje kilka zalet w porównaniu z tradycyjną metodą przygotowania kriomikrotomii11,12 stosowaną głównie do próbek miękkiej masy, takimi jak brak mechanicznego odkształcenia blaszki warstwowej, brak śladów noża oraz możliwość przygotowania próbek kompozytowych z twardymi / miękkimi powierzchniami lub komponentami.

<table><tbody><tr><td>Strata DB 235</td><td>FEI</td><td></td><td>FIB/SEM</td></tr><tr><td>Omniprobe 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Nanomanipulator</td></tr><tr><td>Alto 2500</td><td>Gatan</td><td></td><td>Komora przygotowania kriogenicznego</td></tr><tr><td>Uchwyt kriogeniczny model 626</td><td>Gatan</td><td></td><td>Uchwyt transferowy Cryo TEM</td></tr><tr><td>Tecnai F30</td><td>FEI</td><td></td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Tutaj prezentujemy protokół używany do przygotowania próbek krio-TEM zarodników Aspergillus niger, który jednak można łatwo dostosować do dowolnej liczby mikroorganizmów lub roztworów. Korzystamy z specjalnie zbudowanej stacji kriotransferowej oraz zmodyfikowanej komory przygotowania krio-SEM2. Zarodniki są pobierane z hodowli, zamrażane zanurzeniowo w ciekłym błocie pośniegowym azotu i obserwowane w krio-SEM w celu wybrania interesującego regionu. Cienka blaszka jest następnie ekstrahowana za pomocą FIB, dołączana do siatki TEM, a następnie rozcieńczana do przezroczystości elektronów. Siatka jest przenoszona do uchwytu krio-TEM i do TEM w celu przeprowadzenia badań w wysokiej rozdzielczości. Dzięki wprowadzeniu chłodzonej końcówki nanomanipulatora i stacji kriotransferowej, protokół ten jest prostą adaptacją do temperatury kriogenicznej rutynowo stosowanego przygotowania próbek TEM metodą FIB. W związku z tym ma tę zaletę, że wymaga niewielkiej ilości modyfikacji istniejących instrumentów, konfiguracji i procedur; jest łatwy do wdrożenia; ma szeroki zakres zastosowań, w zasadzie taki sam jak w przypadku przygotowywania próbek cryo-TEM. Jednym z ograniczeń jest to, że wymaga umiejętnego obchodzenia się z próbkami na krytycznych etapach, aby uniknąć lub zminimalizować zanieczyszczenia.

W niniejszej pracy wykorzystano: FIB/SEM z podwójną wiązką wyposażony w nanomanipulator i komorę do kriopreparacji; TEM z uchwytem do kriotransferu; prototypową stację do kriotransferu. Noże antykontaminacyjne (AC) komory do kriopreparacji oraz końcówka nanomanipulatora (NM) zostały zmodyfikowane przez firmę Gatan. W porównaniu do standardowej komory do kriopreparacji, noże AC są większe, aby zapewnić lepszy radiator dla końcówki NM. Ponadto AC jest wyposażony w zaciski do podłączenia miedzianych splotów (Cu) w celu wymiany ciepła z końcówką NM. Układ pneumatyczny FIB/SEM został zmodyfikowany tak, aby NM mógł zostać wprowadzony i pozostać wewnątrz nawet po odpowietrzeniu komory z próbką. Należy zauważyć, że parametry zastosowane w tej pracy są najlepiej dostosowane do wyżej wymienionego sprzętu; parametry te mogą wymagać korekty podczas pracy z innymi typami urządzeń. Podczas pracy z tym protokołem należy przestrzegać standardowych środków ostrożności przy obchodzeniu się z kriogenami, ciekłym azotem i systemami próżniowymi.
Metodę przetestowano z dobrymi wynikami na różnych rodzajach próbek, od roztworów lub matryc polimerowych zawierających nanocząstki, po organizmy jednokomórkowe i nicienie. Przykłady poszczególnych etapów procedury przedstawiono na Rysunkach 1-12 na przykładzie zarodników A. niger barwionych tetratlenkiem osmu i nadmanganianem potasu. Zarodniki są najpierw obrazowane za pomocą SEM (Rysunek 1), aby zidentyfikować miejsce ekstrakcji. W tym przypadku wystarczający był przekrój poprzeczny dowolnego zarodnika, jednak możliwe jest ustawienie ROI dla ekstrakcji z submikrometrową precyzją, aby na przykład przeciąć konkretną komórkę w określonej odległości od błony komórkowej. Po zidentyfikowaniu interesującej cechy wykonuje się pierwszy etap kriodepozycji Pt (Rysunek 2), aby chronić próbkę przed uszkodzeniami wywołanymi wiązką podczas trawienia jonowego. Próbkę przechyla się pod kątem 52°, aby przejść do pierwszych etapów trawienia (Rysunek 3): rozpylania dwóch rowów po obu stronach lameli. Następnie próbkę przywraca się do pozycji wyjściowej i poddaje dalszemu trawieniu, tak aby pozostały jedynie dwa małe mostki łączące ją z materiałem zbiorczym (Rysunek 4). Chłodzony nanomanipulator zostaje doprowadzony do kontaktu z lamelą (Rysunek 5), a kolejna kriodepozycja Pt lutuje je ze sobą (Rysunek 6). Następnie małe mostki łączące są wytrawiane, a NM przesuwa lamelę w pobliże obszaru mocowania siatki TEM (Rysunek 7), gdzie zostaje ona przylutowana za pomocą końcowej kriodepozycji Pt (Rysunek 8). Następnie NM zostaje oddzielony od lameli (Rysunek 9), która jest cieńczona wiązką jonową do uzyskania przezroczystości dla elektronów (Rysunek 10 oraz 11). Lamela jest ostatecznie przenoszona do TEM (Rysunek 12), gdzie można zastosować obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, spektroskopię, tomografię i inne techniki.
<img alt="Klastrowanie nanocząsteczek; obraz z mikroskopu elektronowego; inżynieria materiałowa; analiza morfologii." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obraz cryo-SEM zarodników A. niger przed osadzaniem Pt.
<img alt="Obraz z scanningowego mikroskopu elektronowego ukazujący nanostrukturalną morfologię powierzchni przy dużym powiększeniu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ten sam obszar co na Rysunku 1 po osadzaniu Pt, ale przed utwardzaniem.
<img alt="Skaningowa mikroskopia elektronowa, obraz SEM przedstawiający morfologię powierzchni przy 2000x w celu analizy materiałowej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obraz Cryo-SEM tego samego obszaru co na Rycini 2, pochylony o 52º, po osadzaniu Pt i utwardzaniu, podczas procesu frezowania rowka (patrz krok 3.7).
<img alt="Obraz z scanningowego mikroskopu elektronowego (SEM) trawionej mikrostruktury, ukazujący szczegóły powierzchni przy powiększeniu 5.00 kX." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Lamela przygotowana do wycięcia (lift-out).
<img alt="Obraz z rozpylnego mikroskopu elektronowego przedstawiający mikrostrukturę materiału; badanie morfologii powierzchni." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Końcówka zimnego nanomanipulatora styka się z lamelą.
<img alt="Obraz z skaningowego mikroskopu elektronowego pokazujący mikrostruktury, używany do analizy powierzchni materiałów przy dużym powiększeniu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Druga krio-depozycja Pt jest wykorzystywana do przylutowania nanomanipulatora do lamelli.
<img alt="Obraz z skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) pokazujący analizę powierzchni materiału w skali mikronowej, powiększenie 1000X." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Zimny nanomanipulator służy do przeniesienia lamelli do obszaru mocowania na siatce TEM.
<img alt="Obraz z scanningowego mikroskopu elektronowego przedstawiający pęknięcie materiału, ukazujący szczegółową morfologię powierzchni." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Ponownie zastosowano kriodepozycję w celu przymocowania lamelli do siatki TEM.
<img alt="Obraz z mikroskopu elektronowego skaningowego; analiza powierzchni materiału; badanie w nanoskali; technika SEM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Lamela została odcięta od nanomanipulatora i jest teraz gotowa do przechowywania lub do cieńczenia aż do uzyskania przezroczystości dla elektronów.
<img alt="Obraz z mikroskopu elektronowego skaningowego, analiza struktury porowatej, powiększenie powierzchni materiału, mikrografia." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Etap pośredni procesu cieńczenia, z kilkoma widocznymi zarodnikami w przekroju poprzecznym.
<img alt="Obraz z skaningowego mikroskopu elektronowego pokazujący morfologię powierzchni materiału przy powiększeniu w skali mikro." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11. Obraz Cryo-SEM próbki po końcowym cieńczeniu; większość pozostałych zarodników musiała zostać usunięta poprzez frezowanie, ponieważ lamelka zaczęła się zwijać.
<img alt="Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego przedstawiający strukturę cząsteczki pyłu kometarnego; strzałka wskazuje cechę." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rysunek 12. Złożony obraz cryo-TEM lamelli. Część podstawki Al została włączona do lamelli (czarna strzałka).

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbki do cryo TEM poprzez wycięcie lamelki za pomocą sfocusowanej wiązki jonów z zamrożonej kriogenicznie próbki objętościowej. Osiąga się to najpierw poprzez zamrażanie próbki metodą plunge freezing w ciekłym azocie i zamontowanie jej w cryo sfocused ion beam SEM. Drugim krokiem jest wycięcie cienkiej lamelki za pomocą wiązki jonów i przeniesienie jej na siatkę TEM przy użyciu chłodzonego nanomanipulatora.Następnie siatka TEM jest przenoszona z uchwytu SEM do uchwytu TEM w stacji transferowej. Ostatnim krokiem jest przeniesienie uchwytu TEM do kriomikroskopu TEM w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Ostatecznie kriomikroskop TEM służy do obrazowania z wysoką rozdzielczością, tworzenia tomogramów lub map rentgenowskich wyciętej lamelli.Technika ta umożliwi analizę materii miękkiej z najwyższą rozdzielczością w transmisyjnym mikroskopie elektronowym dzięki uprzedniemu wyborowi miejsca analizy za pomocą innych metod mikroskopowych, takich jak mikroskopia świetlna lub skaningowa mikroskopia elektronowa. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kriomikrotomia, jest uniknięcie artefaktów przygotowawczych, takich jak kompresja i deformacja próbki. Najpierw zamocuj dwie siatki TEM dla próbek do wiązki skupionego jonu.W uchwycie transferowym SEM należy zamocować siatki, dokręcając odpowiednie śruby śrubokrętem, a następnie zamknąć przesłony, zamontować stuby odpowiednie dla badanej próbki i nanieść część preparatu. Na przykład za pomocą pipety należy nanieść krople na płaski stub. Następnie należy zamontować uchwyt transferowy SEM w urządzeniu transferowym próżniowym (VTD).Po dodaniu ciekłego azotu do stacji mrożenia i odpompowaniu powietrza, otwórz stację i wykonaj mrożenie gwałtowne uchwytu transferowego SEM; ponownie odpompuuj, aż wrzenie ustanie i ponownie powstanie zawiesina (slush). Następnie wprowadź uchwyt transferowy SEM do komory próżniowej VTD i zamknij ją. Odpowietrz stację mrożenia oraz komorę przygotowania kriogenicznego; odpowietrz zewnętrzną śluzę.Następnie dopasuj uszczelkę VTD do śluzy komory przygotowania kriogenicznego i pompy. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu próżni, przesuń trzpień śluzy, aby otworzyć uszczelkę VTD oraz zewnętrzną śluzę. Następnie włóż uchwyt transferowy SEM.Następnie za pomocą zimnego noża otwórz osłony slotów na siatki TEM. Wyłącz wysokie napięcie w SEM z wiązką skupionych jonów i otwórz wewnętrzną śluzę. Następnie użyj VTD, aby przenieść uchwyt SEM do komory z próbką.Po umieszczeniu uchwytu SEM w chłodnym stopniu, odłącz VTD, naciskając i obracając. Wycofaj pręt VTD całkowicie do komory próżniowej VTD i zamknij wewnętrzną śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę powietrzną oraz uszczelnienie VTD. Na tym etapie podgrzej gaz prekursor do temperatury od 24 do 26 °C i ustaw system wtryskiwania gazu lub igłę GIS na wysokości około jednego milimetra nad powierzchnią próbki.Podczas obrazowania wiązką elektronów otwórz zawór gazowy na kilka sekund. Następnie utwardź osad nad obszarem zainteresowania (ROI), używając wiązki jonowej o natężeniu 1000 pA przy niskim powiększeniu. Po utwardzeniu przechyl próbkę pod kątem 52 stopni, tak aby powierzchnia była prostopadła do wiązki jonowej.Frezowanie. Dwa rowy terapeutyczne. Po obu stronach ROI przechylić próbkę z powrotem do zera stopni i użyć wiązki jonów do wycięcia boków oraz spodu lameli, upewniając się, że ślady cięcia przechodzą przez całą lamelę.Po wprowadzeniu igły GIS manipuluj nanomanipulatorem, aż jego końcówka znajdzie się w fizycznym kontakcie z lamelą, najlepiej z boku. Otwórz zawór GIS na kilka sekund i monitoruj krioosadzanie poprzez ciągłe obrazowanie wiązką elektronów. Gdy zostanie nałożona dodatkowa warstwa platyny o grubości od 1 do 2 µm, zamknij zawór, a następnie utwardź platynę jedynie w obszarze kilku mikrometrów wokół punktu styku nanomanipulatora z lamelą.Następnie użyj wysokiego natężenia prądu wiązki jonowej, aby wyciąć lamelę. Ostrożnie operuj nanomanipulatorem, aby wyciągnąć lamelę z rowków i przenieść ją na wysokość co najmniej 500 micrometers ponad powierzchnię próbki. Po wycofaniu igły obniż stolik z próbką o kilka milimetrów i przesuń go, aż w polu widzenia pojawi się jedna z siatek TEM.Przesuń obszar mocowania na siatce do pozycji roboczej i wprowadź igłę GIS. Następnie ostrożnie steruj nanomanipulatorem, aby doprowadzić przymocowaną lamelę do fizycznego kontaktu z obszarem mocowania na siatce TEM, otwórz zawór gazu na kilka sekund i nałóż metodą kriosputterowania dodatkową warstwę platyny o grubości od 1 do 2 µm; utrwal platynę jedynie w promieniu kilku mikrometrów wokół punktu styku lameli z siatką TEM. Następnie użyj wysokiego natężenia prądu wiązki jonowej, aby odciąć lamelę od nanomanipulatora.Przechyl próbkę pod kątem 52 stopni i użyj wiązki jonowej, aby zmniejszyć jej grubość do poziomu przejrzystości dla elektronów. Po przepłukaniu stacji transferu kriogenicznego suchym azotem, włóż uchwyt TEM do transferu kriogenicznego do odpowiedniego gniazda stacji transferu kriogenicznego i napełnij go ciekłym azotem. Następnie zanurz śrubokręt, narzędzie do zaciskania próbek TEM oraz pęsetę w kubku kriogenicznym wypełnionym ciekłym azotem, aby schłodzić ich końcówki do pożądanej temperatury.Po dopasowaniu VTD do zewnętrznej śluzy, przesuń stopień chłodzenia na wysokość transferu wynoszącą 16 milimetrów. Po wyłączeniu wysokiego napięcia otwórz uszczelkę VTD, zewnętrzną śluzę oraz wewnętrzną śluzę. Następnie, naciskając i obracając w prawo, zablokuj pręt VTD w uchwycie transferowym SEM.W tym momencie wsuń uchwyt transferowy SEM z powrotem do komory przygotowania kriogenicznego. Użyj zimnego noża, aby zamknąć osłony siatek TEM. Następnie za pomocą pręta VTD przenieś próbkę do komory próżniowej VTD, zamknij ją i uszczelnij śluzę.Następnie odgazuj zewnętrzną śluzę i odłącz VTD. Dopasuj VTD do portu SEM stacji transferu kriogenicznego. Podczas płukania suchym azotem użyj trzpienia w stacji, aby otworzyć uszczelnienie VTD i wsuń uchwyt transferowy SEM do prowadnicy stacji transferu kriogenicznego.Za pomocą schłodzonego śrubokręta otwórz jedną z pokrywek i poluzuj odpowiednią śrubę, przytrzymując siatkę TEM na miejscu. Następnie podnieś siatkę TEM i za pomocą schłodzonej pęsety umieść ją w uchwycie TEM. Po tym kroku przytwierdź siatkę TEM do uchwytu TEM.Używając schłodzonego pierścienia sześciokątnego, zamknij migawkę uchwytu TEM do transferu kriogenicznego i odłącz stację transferu kriogenicznego od układu pompowania. Przenieś stację oraz sterownik grzewczy uchwytu TEM w pobliże TEM i podłącz je ponownie. Ustawy stalik próbkowy TEM pod kątem pochylenia minus 70 stopni.Następnie ustaw najkrótszy czas pompowania śluzy z tylko jednym cyklem płukania suchym azotem. Wyjmij uchwyt TEM ze stacji transferu kriogenicznego i włóż go do pierwszego stopnia pochylonego goniometru, co rozpocznie cykl pompowania. Po zakończeniu cyklu ustaw goniometr tak, aby powrócił do nachylenia zero stopni, trzymając uchwyt TEM w taki sposób, aby nie obracał się wraz z goniometrem.Następnie włóż uchwyt przez goniometr całkowicie do wnętrza TEM. Na koniec ponownie napełnij dozownik uchwytu do kriotransferu TEM ciekłym azotem. W tej metodzie zarodniki aspergillus Niger są najpierw obrazowane za pomocą SEM w celu zidentyfikowania miejsca ekstrakcji.Wystarczy przekrój przez dowolną zarodnik, jednak możliwe jest ustawienie ROI do ekstrakcji z precyzją submikronową, aby przeciąć konkretną komórkę w określonej odległości od błony komórkowej. Po zidentyfikowaniu interesującej cechy realizowany jest pierwszy krok depozycji kriogenicznej. Aby chronić próbkę przed uszkodzeniem wiązką podczas trawienia jonowego, próbkę przechyla się pod kątem 52 stopni, a następnie wykonuje rozpylanie dwóch rowów po obu stronach mella. Następnie próbkę przechyla się z powrotem i poddaje dalszemu trawieniu, pozostawiając jedynie dwa małe mostki łączące ją z materiałem bazowym.Schłodzony nanomanipulator zostaje doprowadzony do kontaktu z lamellą, a kolejna kriodepozycja platyny lutuje je ze sobą. Małe mostki łączące zostają usunięte poprzez frezowanie, a nanomanipulator przemieszcza lamellę w pobliże obszaru mocowania przystosowanego do TEM, gdzie zostaje ona przylutowana końcową kriodepozycją platyny. Następnie nanomanipulator zostaje oddzielony od lamelli, która jest następnie cieńczona do uzyskania przejrzystości dla elektronów.Za pomocą wiązki jonów lamelkę przenosi się do TEM, gdzie można zastosować spektroskopię obrazowania o wysokiej rozdzielczości, tomografię oraz inne techniki. Metoda ta przyczyni się do zrozumienia interfejsów tkanek miękkich serca w systemach takich jak sondy neuronowe czy implanty kostne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowywania próbek cryo TEM wolnych od artefaktów, które mogą zostać wyekstrahowane z określonego obszaru próbki biologicznej z submikrometrową precyzją.

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie próbek do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skoncentrowanego wiązki jonów

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i obrazowania w trzech wymiarach tkanki mózgowej zatopionej w żywicy przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego.

Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Techniki kriogenicznej skupionej wiązki jonów (FIB) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat chemii i morfologii nienaruszonych granic faz ciało stałe-ciecz. Szczegółowo omówiono metody sporządzania wysokiej jakości map spektroskopowych takich interfejsów z dyspersją energii (EDX), ze szczególnym uwzględnieniem urządzeń do magazynowania energii.

Charakterystyka granic faz ciecz-ciało stałe w nanoskali poprzez sprzężenie kriofokusowego mielenia wiązki jonów ze skaningową mikroskopią elektronową i spektroskopią

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj metodę przygotowania próbek do krio-TEM za pomocą skupionej wiązki jonów. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości materiałów biologicznych przy minimalnym ryzyku artefaktów przygotowania.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Przeglądaj więcej filmów