Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów
July 26th, 2014
Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbki do krio-TEM poprzez ekstrakcję skupionej blaszki wiązki jonów z kriogenicznie zamrożonej próbki zbiorczej. Osiąga się to poprzez pierwsze zanurzenie, zamrożenie próbki w ciekłym azocie i umieszczenie jej w krioogniskowej wiązce jonów SEM. Drugim krokiem jest wycięcie cienkiego LA Melo z wiązką jonów i przeniesienie go na siatkę TEM za pomocą chłodzonego nano manipulatora.
Następnie siatka TEM jest przenoszona z uchwytu SEM do uchwytu TEM w stacji przesyłowej. Ostatnim krokiem jest przeniesienie uchwytu TEM do krio-TEM w celu dalszej analizy. Ostatecznie cryo TEM służy do wyświetlania obrazów o wysokiej rozdzielczości, tomo Grahamów lub map rentgenowskich wydobytej blaszki.
Technika ta umożliwi nam analizę miękkiej materii z najwyższą rozdzielczością w transmisyjnym mikroskopie elektronowym poprzez wstępny wybór miejsca analizy za pomocą innych mikroskopów, takich jak mikroskopia świetlna lub elektromikroskopia skaningowa. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikrotomia kriogeniczna Mac, jest to, że unika się artefaktów preparacji, takich jak kompresja i tworzenie def próbki. Najpierw zamontuj dwie siatki TEM dla próbek skupionej wiązki jonów.
Na uchwycie transferowym SEM zabezpiecz kratki, dokręcając odpowiednie śrubokrętem i zamknij żaluzje, zamontuj króciec próbki odpowiedni dla próbki i dodaj część próbki. Na przykład użyj pipety, aby osadzać kropelki na płaskim klocku. Następnie zamontuj uchwyt transferowy SEM na urządzeniu do transferu próżniowego lub VTD.
Po dodaniu ciekłego azotu do stacji slushingu i odpompowaniu, otwórz stację i zanurz ponownie zamrozić pompę uchwytu transferowego SEM, aż do zakończenia wrzenia i ponownego uzyskania błota pośniegowego. Następnie wsuń uchwyt transferowy SEM do komory próżniowej VTD i uszczelnij go. Odpowietrzyć stację spłukania i komorę przygotowania krio, odpowietrzyć śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę.
Następnie dopasuj uszczelkę VTD do śluzy powietrznej komory przygotowania kriogenicznego i pompy. Po osiągnięciu dobrego poziomu podciśnienia zmierz trzpień śluzy powietrznej, aby otworzyć uszczelkę VTD i zewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie włóż uchwyt transferowy SEM.
Następnie użyj zimnego noża, aby otworzyć pokrywy ochronne szczelin siatki TEM. Wyłączyć wysokie napięcie skupionej wiązki jonów SEM i otworzyć wewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie za pomocą VTD przenieś uchwyt SEM do komory na próbkę.
Gdy uchwyt SEM znajdzie się w zimnym stage, odłącz VTD, popychając i obracając. Wsuń pręt VTD do końca do komory próżniowej VTD i zamknij wewnętrzną śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę powietrzną i uszczelkę VTD. W tym momencie podgrzej gaz prekursorowy do temperatury od 24 do 26 stopni Celsjusza i umieść system wtrysku gazu lub igłę GIS na wysokości około jednego milimetra nad powierzchnią próbki.
Podczas obrazowania wiązką elektronów otwórz zawór gazowy na kilka sekund. Następnie utwardź osad w obszarze zainteresowania lub ROI za pomocą wiązki jonów o mocy 1000 pico ampire w małym powiększeniu. Po utwardzeniu przechylić próbkę pod kątem 52 stopni, tak aby powierzchnia była prostopadła do wiązki jonów.
Młyn daleko. Dwa okopy terrorystyczne. Po obu stronach ROI przechyl próbkę z powrotem do zera stopni i użyj wiązki jonów, aby odciąć boki i spód blaszki, upewniając się, że ślady cięcia przechodzą przez całą blaszkę.
Po wkłuciu igły GIS manewruj nanomanipulatorem, aż jego końcówka znajdzie się w fizycznym kontakcie z blaszką, najlepiej z boku. Otwórz zawór GIS na kilka sekund i monitoruj osadzanie kriogeniczne poprzez ciągłe obrazowanie wiązką elektronów. Po osadzeniu kriogenicznym warstwy platyny o grubości od jednego do dwóch mikrometrów, zamknij zawór po tym utwardzeniu platyny tylko w odległości kilku mikrometrów wokół punktu, w którym nanomanipulator styka się z blaszką.
Następnie użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć blaszkę. Ostrożnie manewruj nanomanipulatorem, aby wydobyć blaszkę z rowów i przesunąć ją na co najmniej 500 mikrometrów nad powierzchnię próbki. Po schowaniu igły obniż stolik próbki o kilka milimetrów i przesuwaj go, aż jedna z siatek TEM znajdzie się w zasięgu wzroku.
Przesuń obszar mocowania na siatce do pozycji roboczej i włóż igłę GIS. Następnie ostrożnie manewruj nanomanipulatorem, aby doprowadzić dołączoną lamelę do fizycznego kontaktu z obszarem mocowania na siatce TEM, otwórz zawór gazowy na kilka sekund i kriogenicznie zdeponuj dodatkową warstwę platyny o grubości od jednego do dwóch mikrometrów, utwardź platynę tylko w ciągu kilku mikrometrów wokół punktu styku lameli z siatką TEM. Następnie użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę od nano manipulatora.
Przechyl próbkę pod kątem 52 stopni i użyj wiązki jonów, aby rozrzedzić ją do przezroczystości elektronów. Po przepłukaniu stacji kriotransferowej suchym azotem gazowym, włóż uchwyt TEM do kriotransferu w odpowiednie szczeliny stacji kriotransferowej i napełnij ciekłym azotem. Następnie zanurz śrubokręt, narzędzie do zaciskania próbki TEM i pęsetę w kubku kriogenicznym wypełnionym ciekłym azotem, aby schłodzić ich końcówki do żądanej temperatury.
Po dopasowaniu VTD do zewnętrznej śluzy powietrznej, doprowadzić zimny stopień do wysokości transferu 16 milimetrów. Po wyłączeniu wysokiego napięcia otwórz uszczelkę VTD, zewnętrzną śluzę powietrzną i wewnętrzną śluzę powietrzną. Następnie użyj pręta VTD, aby zablokować się w uchwycie transferowym SEM, popychając i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
W tym momencie wsuń uchwyt transferowy SEM do komory kriopreparacji. Użyj zimnego noża, aby zamknąć pokrywy ochronne kratek TEM. Następnie za pomocą pręta VTD przenieś próbkę do komory próżniowej VTD, zamknij i uszczelnij śluzę powietrzną.
Następnie odpowietrzyć zewnętrzną śluzę powietrzną i odłączyć VTD. Dopasuj VTD do portu SEM stacji kriotransferowej. Podczas płukania suchym azotem użyj kołka na stacji, aby otworzyć uszczelkę VTD i wsuń uchwyt transferowy SEM do doera stacji kriotransferowej.
Za pomocą schłodzonego śrubokręta otwórz jedną z pokryw i poluzuj odpowiednią, utrzymując siatkę TEM na miejscu. Następnie podnieś siatkę TEM i umieść ją w uchwycie TEM za pomocą schłodzonej pęsety. Następnie przymocuj siatkę TEM do uchwytu TEM.
Za pomocą chłodzonego pierścienia sześciokątnego zamknij przesłonę uchwytu kriotransferu TEM i odłącz stację kriotransferową od układu pompowego. Przetransportować stację i sterownik grzałki uchwytu TEM w pobliże TEM i podłączyć je ponownie. Ustaw stolik próbki TEM na nachylenie ujemne 70 stopni.
Następnie ustaw najkrótszy czas pompowania śluzy z tylko jednym cyklem przedmuchiwania suchym azotem gazowym. Wyjmij uchwyt TEM ze stacji kriotransferowej i włóż go do pierwszego stopnia przechylonego goniometru, który rozpocznie cykl pompowania. Po zakończeniu cyklu ustaw goniometr tak, aby odchylał się do tyłu do zera stopni, trzymając uchwyt TEM, aby nie obracał się wraz z goniometrem.
Następnie włóż uchwyt przez goniometr całkowicie do TEM. Na koniec napełnij uchwyt TEM do kriotransferu ciekłym azotem. W tej metodzie zarodniki aspergillus Niger są najpierw obrazowane za pomocą SEM w celu identyfikacji miejsca ekstrakcji.
Wystarczający jest przekrój poprzeczny dowolnego zarodnika, ale możliwe jest ustawienie ROI do ekstrakcji z precyzją submikrometrową, aby przeciąć określoną komórkę w określonej odległości od błony komórkowej. Po zidentyfikowaniu interesującej cechy wdrażany jest pierwszy etap osadzania kriogenicznego Aby chronić próbkę przed uszkodzeniem wiązki podczas mielenia jonowego, próbka jest nachylana pod kątem 52 stopni, a następnie napylana jest dwa rowy po obu stronach melli. Próbka jest następnie odchylana do tyłu i dalej mielona, pozostawiając tylko dwa małe mostki łączące ją z masą.
Schłodzony nanomanipulator styka się z mellą, a kolejne kriogeniczne osadzanie platyny lutuje je ze sobą. Małe mostki łączące są frezowane, a nanomanipulator przesuwa lamelę w pobliże obszaru mocowania klasy TEM, gdzie jest lutowana z końcowym krioosadzaniem platyny. Nanomanipulator jest następnie oddzielany od blaszki, która jest rozrzedzona do przezroczystości elektronów.
Za pomocą wiązki jonów blaszka jest przenoszona do TEM, gdzie można zastosować spektroskopię obrazowania o wysokiej rozdzielczości, tomografię i inne techniki. Metoda ta przyczyni się do lepszego zrozumienia granic faz miękkiej materii serca w systemach takich jak sondy neurologiczne czy implanty kostne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki cryo TM, które są artefaktem trzecim i które można pobrać z określonego obszaru próbki robaka z precyzją submikrometrową.
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę przygotowywania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej (cryo-TEM) z użyciem technik wiązki jonów o skupieniu (FIB). Metoda ta umożliwia wysokiej rozdzielczości obrazowanie miękkiej materii, minimalizując przy tym artefakty przygotowywania próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologiczne Obrazowanie
- Kriogeniczna Mikroskopografia Elektronowa
Tło
- Kriogeniczne mikroskopy elektronowe są niezbędne do analizy próbek biologicznych.
- Techniki wiązki jonów o skupieniu poprawiają przygotowanie próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej.
- Minimalizowanie artefaktów jest kluczowe dla dokładnego obrazowania.
- Ta metoda pozwala na wstępne selekcjonowanie miejsc analizy za pomocą innych technik mikroskopowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody przygotowywania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej.
- Osiągnięcie wysokiej rozdzielczości obrazowania miękkich materiałów biologicznych.
- Uniknięcie artefaktów przygotowywania, które mogą zniekształcać wyniki.
Stosowane metody
- Nagłe zamrażanie próbek w ciekłym azocie.
- Wykorzystanie wiązki jonów o skupieniu do wyciągania cienkich lameli.
- Przeniesienie lameli na kratki TEM za pomocą chłodzonego nano manipulatora.
- Wysokiej rozdzielczości obrazowanie i analiza za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej.
Główne wyniki
- Udane wyciągnięcie i przeniesienie lameli do obrazowania.
- Zdemonstrowane zdolności do wysokiej rozdzielczości obrazowania kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej.
- Minimalizowane artefakty przygotowywania próbek w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Możliwość szczegółowej analizy struktur miękkiej materii.
Wnioski
- Opracowany metoda jest skuteczna w przygotowywaniu próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej transmisyjnej.
- Zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zmniejszając artefakty.
- Ta technika poprawia analizę próbek biologicznych w neuronauce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise, artifact-minimized sample preparation for cryo-TEM by extracting thin lamellae from frozen biological specimens using focused ion beam milling. It supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by allowing sub-micrometer precision in region-of-interest selection, reducing ambiguity in structural analysis. The approach enhances predictive confidence in downstream workflows by preserving native ultrastructure and enabling high-resolution imaging of soft matter interfaces relevant to neurobiology and implant materials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of subcellular structures in native state.
- Operational Value: Reduces preparation artifacts that could confound target engagement or mechanism-of-action studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing high-fidelity structural data for lead candidate assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for correlative light and electron microscopy workflows.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for reproducible ultrastructural analysis across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse for multiple target classes requiring nanoscale structural validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent ultrastructural assessment across model systems.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translational biomarkers via high-resolution mapping of protein complexes or membrane domains.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by minimizing false positives from preparation-induced artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, reproducible ultrastructural data that informs mechanistic understanding and compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling site-specific analysis of cellular structures.
- Screening: Enhances assay readiness by delivering artifact-free samples for reliable compound-induced phenotypic screening.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as lamella thickness, membrane curvature, and protein density for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved ultrastructural features relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for structural validation across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through artifact-minimized, high-resolution imaging of native biological states.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of cryo-sample preparation across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage failure due to biological misinterpretation.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization grounded in validated structural data rather than artifact-prone surrogates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron microscopy, focused ion beam operation, and nanomanipulation techniques.
- Dependent on access to cryo-FIB/SEM systems, cryo-transfer stations, and cooled nanomanipulators.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, freezing protocols, and grid preparation to minimize contamination.
- Adaptation considerations include specimen type, grid geometry, and ion beam parameters for different biological systems.
- Practical limitations include skill-dependent handling to avoid contamination during lamella extraction and transfer.
