Name: Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę profilowania molekularnego inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów. Wykorzystaj mikrodisekcję laserową do izolacji komórek nowotworowych i stromalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MB jest wspierany przez granty ze stypendium MRC. KP i AHM są wspierane przez dotacje z Wessex Medical Research and Cancer Research UK/RCS (England) (C28503/A10013). Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Jednostki Badawczej Histochemii Uniwersytetu w Southampton.

1. Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów z eksplantatów okrężnicy
<ol>
	<li>Pobrać próbki normalnej tkanki błony śluzowej jelita grubego człowieka bezpośrednio z sali operacyjnej i zawiesić w 7-10 ml PBS uzupełnionym 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml Fungizone.</li>
	<li>W laboratorium umieść próbkę na środku 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i przemyj 3 razy PBS/Pen-strep/Fungizone. Nie zasysać po ostatnim praniu.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela pokrój tkankę na małe kawałki (około 2 mm) i umieść każdy kawałek na środku krzyża narysowanego ostrzem skalpela na 12-dołkowej płytce. Delikatnie kołysz skalpelem po tkance, aby mogła przylgnąć.</li>
	<li>Hoduj próbki w 750 μl pierwotnej pożywki wzrostowej fibroblastów (DMEM uzupełniony 20% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 292 μg/ml L-glutaminy), które powinny zanurzyć tkankę, nie umożliwiając jej unoszenia się na wodzie. Unikaj naruszania talerza przez następne 5 dni, z wyjątkiem ponownego karmienia co 2 dni.</li>
	<li>W ciągu najbliższych 5 dni fibroblasty powoli zaczną wyrastać z krawędzi tkanki. Po około 7 dniach będzie to bardziej widoczne. Po około 3-4 tygodniach, jeśli wyrasta wystarczająca ilość fibroblastów, dodaj 750 μl trypsyny do każdej studzienki. Po odłączeniu komórek (co może zająć 5-10 minut) należy zebrać i przenieść do kolby do hodowli tkankowej T-25.</li>
</ol>
2. Przygotowanie organotypowe
Przygotowanie żelu organotypowego impregnowanego fibroblastami:
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 5 x 105 komórek na organotyp w DMEM, uzupełnioną 10% FCS i 292 μg/ml L-glutaminy.</li>
	<li>Żele organotypowe uzupełnić na lodzie w następujących proporcjach:
	<ul>
		<li>7 tomów Kolagenu ze Szczurzego Ogona: Matrigel mix (1:1)</li>
		<li>1 objętość filtrowanego 10x DMEM</li>
		<li>1 objętość SKO</li>
		<li>1 objętość zawiesiny komórek fibroblastów zawierającej 5 x 105 fibroblastów 
		Na 9 żeli (1 ml na żel) przygotuj 10 ml i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Dodać 1 ml do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze, aby żele zastygły. Po 1 godzinie dodaj 1 ml DMEM (10% FCS)/Glut na wierzch żeli i wróć na noc do inkubatora.</li>
	<li>Następnego dnia należy odessać pożywkę od góry żeli i płytki 1 ml pożywki zawierającej 5 x 105 komórek nabłonka CRC.</li>
</ol>
Przygotowanie arkuszy nylonowych pokrytych żelem:
<ol start="5">
	<li>Przygotuj wcześniej sterylne, autoklawowane arkusze nylonu o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wymaganą liczbę nylonowych arkuszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (zwykle w jednym naczyniu można pomieścić 4 nylonowe arkusze).</li>
	<li>Uzupełnić żel na lodzie w następującej kolejności (wymagana jest całkowita objętość 250 μl na arkusz nylonu):
	<ul>
		<li>7 tomów Kolagenu ze Szczurzego Ogona</li>
		<li>1 objętość filtrowanego 10x DMEM</li>
		<li>1 objętość SKO</li>
		<li>1 objętość DMEM 10% FCS/Glut</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Jeśli roztwór jest żółty, zneutralizować przez dodanie 0,1 M NAOH w 50 μl podwielokrotności, aż roztwór zmieni kolor na różowy.</li>
	<li>Dodać 250 μl tego roztworu do każdego arkusza nylonu i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 30 minut, aby żel stwardniał.</li>
	<li>Uzupełnić 1% roztwór aldehydu glutarowego w PBS. Po stężeniu żelu dodać 10 ml do każdego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Arkusze nylonu prać 3x w PBS i 1x w DMEM (10% FCS)/Glu i inkubować przez noc w DMEM/Glu w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Wznoszenie żeli organotypowych na stalowe siatki w celu inwazji:
<ol start="12">
	<li>Wstępnie przygotuj rusztowania, składając arkusze stali nierdzewnej w formację trójnogu. Autoklaw przed użyciem.</li>
	<li>Użyj kleszczy wysterylizowanych w etanolu, aby umieścić stalową siatkę w każdym dołku sześciodołkowej płytki.</li>
	<li>Umieść pokryty żelem arkusz nylonowy stroną kolagenową do góry na każdej siatce.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść żele organotypowe z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki wysterylizowanej w etanolu.</li>
	<li>Napełnij studzienkę DMEM 10% FCS/Glut uzupełnionym 10% FCS, aż arkusz nylonu zetknie się z medium, ale nie zostanie zanurzony. Upewnij się, że podłoże nie styka się z żelem organotypowym.</li>
	<li>Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , wymieniając pożywkę co 2 dni.</li>
</ol>
3. Utrwalenie organotypowe
<ol>
	<li>Usuń cały arkusz organotypowy, w tym nylonowy, z dołka i umieść na folii spożywczej.</li>
	<li>Przetnij arkusz organotypowy i nylonowy za pomocą czystego jednorazowego skalpela i utrwal obie połówki w formaldehydzie na 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp formaldehyd 70% etanolem po 24 godzinach i pozostaw na noc przed zatopieniem w parafinie, cięciem i barwieniem.</li>
</ol>
4. Laserowa mikrodysekcja brzegu inwazyjnego
<ol>
	<li>Przekrój do grubości 10 μm na szkiełkach montowanych na membranie.</li>
	<li>Odparafinować skrawki, nakładając ksylen na 1 minutę, następnie usunąć ksylen i utrwalić w 75% etanolu przez kolejne 1 minutę.</li>
	<li>Usuń etanol i zabarwić 0,125% roztworem fioletu krezylowego przez 1 minutę. Fiolet krezylowy uwydatnia komórki nabłonkowe i umożliwia łatwą dyskryminację od zrębu.</li>
	<li>Usuń fiolet krezylowy i nałóż 100% etanol na kolejną 1 minutę, a następnie spłucz 100% etanolem. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.</li>
	<li>Przeprowadź mikrodysekcję laserową przy użyciu wybranej platformy (np. systemu Leica AS).</li>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe z zabarwioną częścią przeznaczoną do mikropreparowania ekranem do dołu na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Zamontuj probówkę mikrowirówkową o pojemności 0,5 ml w kasecie zbiorczej i dodaj 50 μl buforu do lizy komórek (np. buforu do lizy DNA, RNA lub białka) do nasadki, do której zbierze się mikrowycięta tkanka.</li>
	<li>W bezpośrednim widzeniu użyj joysticka, aby zidentyfikować interesującą tkankę, a za pomocą interfejsu oprogramowania opisz wybarwioną sekcję organiczną, podświetlając komórki do mikrosekcji na froncie inwazji guza.</li>
	<li>Poinstruuj laser, aby wystrzelił, co powinno zarówno wyciąć podświetloną sekcję, jak i wepchnąć mikrowypreparowaną tkankę do nasadki probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Po zebraniu wystarczającej ilości materiału wysuń kasetę zbiorczą, zamknij probówkę mikrowirówki i delikatnie odwiruj, aby wyciągnąć bufor do lizy na dno probówki.</li>
	<li>Umieść próbki na lodzie do momentu zakończenia mikrodysekcji. Próbki należy przetworzyć odpowiednią metodą w celu ekstrakcji analitu będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Tutaj opisujemy metodę specyficznego izolowania i charakteryzowania komórek nowotworowych, które nabyły zdolność do inwazji zrębu związanego z rakiem podczas najwcześniejszych etapów progresji przerzutów w trójwymiarowym konstrukcie kokulturowym komórek nabłonka i zrębu.
Modele kohodowli składające się z komórek nabłonka CRC zestawionych z syntetycznym zrębem zawierającym ex vivo ludzkie fibroblasty okrężnicy wykorzystano do zbadania inwazji CRC w trzech wymiarach. Ten fizjologicznie ...

Organotypowe kokultury to modele inżynierii tkankowej, które pomagają w rekonstrukcji mikrośrodowiska guza in vivo w 3 wymiarach poprzez zestawienie złośliwych komórek nabłonkowych i komórek zrębu w żelu kolagenowym zawierającym niezbędne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej1-3. Organotypy, pomyślane głównie jako metoda pomiaru inwazji guza, zmniejszają zależność od modeli zwierzęcych in vivo i pozwalają uniknąć niedociągnięć innych technik in vitro, takich jak testy Transwella, w których inwazyjne komórki są sztucznie zmuszane do stanu monorozproszonego2-4. Włączenie komórek zrębu do tych modeli, takich jak fibroblasty, odzwierciedla zasadniczą rolę mikrośrodowiska guza w regulacji inwazji nowotworów złośliwych i przerzutów3-4, jednak niejednorodność fenotypowa zrębu jest taka, że aby zmaksymalizować fizjologiczne znaczenie modeli organotypowych, należy uwzględnić w miarę możliwości fibroblasty ex vivo specyficzne dla narządu, anatomicznie dokładne3,6.
Organotypy są wszechstronną platformą do badania interakcji między komórkami nowotworowymi i zrębowymi i są coraz częściej wykorzystywane w nowatorski sposób do badania wpływu na inwazję nowotworu chemicznych inhibitorów i ukierunkowanych zmian genów7,8. Badanie inwazyjnego marginesu guza jest szczególnie ekscytującą perspektywą. W modelach organotypowych ustalone linie komórkowe raka jelita grubego (CRC) zazwyczaj wytwarzają dobrze warstwową warstwę nabłonkową, a w przekroju poprzecznym komórki, które nabyły zdolność do inwazji na macierz zewnątrzkomórkową (ECM), są łatwo rozpoznawalne. W świetle ustalonej heterogeniczności mikrotopograficznej guza i komórek zrębu związanych z nowotworem in vivo, ekstrakcja tych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej i badanie ich w izolacji może ujawnić ważne biologiczne spostrzeżenia dotyczące pochodzenia przerzutów raka jelita grubego i tego, jak można je skuteczniej ukierunkować. Zgodnie z poniższą metodologią wszyscy pacjenci, którzy oddali próbki tkanek, wyrazili pisemną świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez regionalną komisję etyczną ds. badań naukowych.

<table><tbody><tr><td>Linie komórkowe raka jelita grubego - przykład pokazany SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nylonowa</td><td>Merck Millipore</td><td>VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>Siatka metalowa</td><td>Firma siatkowa</td><td>WSS20-A4</td><td></td></tr><tr><td>themeshcompany.com Laser Platforma mikrodysekcyjna</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice membranowe</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Merck Millipore</td><td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Atakujące komórki raka jelita grubego (CRC) nabyły zdolność do uwalniania się od swoich siostrzanych komórek, infiltracji zrębu i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Scharakteryzowanie biologii tej fenotypowo odrębnej grupy komórek może znacznie poprawić nasze zrozumienie wczesnych zdarzeń podczas kaskady przerzutów.

Inwazja guza to dynamiczny proces, który jest ułatwiony przez dwukierunkowe interakcje między złośliwym nabłonkiem a zrębem związanym z rakiem. W celu zbadania specyficznych dla komórek odpowiedzi na granicy zrębu guza, połączyliśmy współhodowlę organotypową i techniki mikropreparacji laserowej.
Modele organotypowe, w których kluczowe składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są 3-dwukątnie współhodowane z komórkami nabłonkowymi raka, są wysoce podatnymi na manipulację narzędziami eksperymentalnymi, które umożliwiają badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa (LMD) to technika, która polega na chirurgicznym rozwarstwieniu i ekstrakcji różnych warstw tkanki nowotworowej, z precyzją na poziomie mikronów.
Łącząc te techniki z profilowaniem genomicznym, transkryptomicznym i epigenetycznym, dążymy do głębszego zrozumienia cech molekularnych atakujących komórek nowotworowych i otaczającej tkanki zrębu, a tym samym potencjalnie odkrywamy nowe biomarkery i możliwości rozwoju leków w CRC.

Opisaną powyżej metodę zastosowano w odniesieniu do wielu kombinacji linii komórkowych CRC i komórek zrębu. Przykładem przedstawionym w niniejszej pracy są nabłonkowe linie komórkowe CRC SW480 wraz z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami okrężnicy ex vivo. Tworzy się trójwymiarowe kokultury (Rysunek 1), które poddawano badaniom mikroskopowym i laserowej mikrodysekcji (Rysunek 2), a następnie analizowano za pomocą profilowania mikroRNA (miRNA) (Rysunek 3) w celu por...

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka specyficznej biologii na styku złośliwych komórek nabłonkowych w inwazyjnym froncie nowotworu i komórek zrębowych związanych z rakiem. Jest to realizowane poprzez uprzednie ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z implantów jelita grubego. Drugim krokiem jest stworzenie organotypowych modeli kokultur z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów jelita grubego oraz hodowanych komórek raka jelita grubego.Następnie modele organotypowe utrwalono w formie i wykonano ich przekroje na szkiełkach z zamocowaną membraną, a następnie zabarwiono fioletem krystalicznym. Ostatnim etapem jest mikrosekcja laserowa w celu oddzielenia naciekających komórek nowotworowych od komórek nowotworowych nienaciekających oraz komórek zrębu związanych z rakiem. W końcowej fazie można zastosować techniki profilowania molekularnego, aby scharakteryzować biologię naciekających i nienaciekających komórek nowotworowych oraz komórek zrębu w otaczającym mikrośrodowisku guza.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, jak wyraźnie komórki naciekające odróżniają się od komórek nienaciekających w trójwymiarowych organotypowych modelach współhodowli raka jelita grubego. Na początek należy pozyskać próbki prawidłowej tkanki błony śluzowej ludzkiego jelita grubego bezpośrednio z bloku operacyjnego w laboratorium. Próbkę umieszcza się w centrum 10 centymetrowej szalki do hodowli tkanek, a następnie hodowlę płucze się trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem penicyliny, streptomycyny i fungizonu.Nie odsysać płynu po ostatnim płukaniu. Za pomocą sterylnej pęsety i skalpela pociąć tkankę na małe kawałki. Następnie każdy fragment umieścić w centrum krzyżyka narysowanego ostrzem skalpela. W płytce 12-dołkowej delikatnie poruszać skalpelem nad tkanką, aby umożliwić jej przywieranie do kultury.Próbki umieść w 750 µL podstawowej pożywki do wzrostu fibroblastów, tak aby tkanka była całkowicie zanurzona, ale nie wypływała na powierzchnię. Następnie umieść próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5–10% CO2 na kolejne pięć dni. Fibroblasty zaczną powoli wyrastać z krawędzi tkanki po około siedmiu dniach.Będzie to bardziej widoczne po około trzech do czterech tygodniach. Jeśli wyrosło wystarczająco dużo fibroblastów, po odklejeniu się komórek dodaj 750 µL trypsyny do każdej studni, po czym zbierz je i przenieś do kolby hodowlanej T 25 w celu przygotowania organotypowego żelu nasyconego fibroblastami. Najpierw przygotuj zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 500 000 komórek na żel w uzupełnionym dmm.Przygotuj żele organotypowe w lodzie, zachowując proporcje podane w protokole tekstowym, dla dziewięciu żeli w ilości jednego mililitra na żel. Przygotuj 10 ml i wymieszaj delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj jeden mililitr do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze o zwiększonej wilgotności.Aby umożliwić stężenie żeli po jednej godzinie, należy dodać 1 ml suplementowanej pożywki DMEM na wierzch żeli i pozostawić je w inkubatorze przez noc. Następnego dnia należy odessać pożywkę z powierzchni żeli i nanieść 1 ml pożywki zawierającej 500 000 komórek nabłonkowych raka jelita grubego na nylonowe arkusze pokryte żelem.Przygotuj wcześniej sterylne, autoklawowane arkusze nylonowe o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra, używając sterylnej pęsety. Umieść wymaganą liczbę arkuszy nylonowych w 10 centymetrowej szalce hodowlanej. Przygotuj mieszaninę żelu w lodzie zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie dodawaj 0,1 molarny wodorotlenek sodu do mieszaniny żelu, aż zmieni ona kolor na różowy, co oznacza, że roztwór został zneutralizowany.Następnie należy dodać 250 µL tego roztworu do każdej arkusza nylonowego. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 30 minut, aby żel stężał. W kolejnym kroku dodać 10 mL 1% roztworu glutaraldehydu w PBS do każdej szalki hodowlanej o średnicy 10 cm.Po zastygnięciu żelu, przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, należy przemyć arkusze nylonowe trzy razy w PBS i raz w uzupełnionym dme. Arkusze należy inkubować przez noc w tym samym buforze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przenieść żele organotypowe na stalowe kratki służące jako sterylizowane rusztowania do inwazji, które przygotowano poprzez zagięcie arkuszy ze stali nierdzewnej w formę trójnogu. Następnie, używając pęsety wysterylizowanej etanolem, należy umieścić stalową kratkę w każdym dołku płytki sześciodołkowej.Na każdej siatce należy umieścić nylonową arkusz powleczony żelem, stroną z kolagenem do góry. Organotypowe żele należy ostrożnie przenieść z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki wysterylizowanej etanolem. Dołek należy wypełnić uzupełnionym medium DMEM tak, aby arkusz nylonowy stykał się z medium, ale nie był w nim zanurzony.Należy upewnić się, że pożywka nie styka się z żelem organotypowym. Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37°C w atmosferze z dodatkiem 5%CO2. Pożywkę wymieniać co dwa dni.Wyjąć cały preparat organotypowy wraz z arkuszem nylonowym z dołka i umieścić go na folii spożywczej. Przeciąć preparat organotypowy oraz arkusz nylonowy na pół za pomocą czystego, jednorazowego skalpela, a następnie utrwalić obie połowy w formaldehydzie przez 24 godziny. Po 24 godzinach, w temperaturze pokojowej, zastąpić formaldehyd 70% ethanol i pozostawić na noc przed zatopieniem w parafinie, wykonaniem skrawków i barwieniem w celu przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej.Pierwsze skrawki organotypowe o grubości 10 µm na szkiełkach z zamontowaną membraną. Po opracowaniu skrawków zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej przy użyciu wybranej platformy. Umieść szkiełko przedmiotowe z zabarwionym skrawkiem przeznaczonym do mikrodysekcji.Umieść odwróconą do góry dnem probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 milliliter w kasecie zbiorczej na stoliku mikroskopu i dodaj 50 microliters buforu do lizy komórek do zakrętki, do której pod bezpośrednią kontrolą wzrokową będą wpadać mikrodysekcjowane fragmenty tkanki. Za pomocą dżojstika zidentyfikuj interesującą tkankę, a następnie korzystając z interfejsu oprogramowania, zaznacz barwiony przekrój organiczny, wyróżniając komórki do mikrodysekcji na froncie naciekania nowotworu. Uruchom laser, który powinien zarówno wyciąć zaznaczony fragment, jak i wprowadzić mikrodysekcjonowaną tkankę do zakrętki probówki do mikrocentryfugi.Przejdź do przetwarzania próbek odpowiednią metodą w celu wyekstrahowania badanego anality. Przedstawiono tutaj obrazy z mikrosekcji laserowej komórek raka jelita grubego SW 480 naciekających zrąb organotypowy. Fiolet krystaliczny został użyty do wyróżnienia nabłonkowych komórek raka jelita grubego.Następnie wyznacza się inwazyjne wyspy nowotworowe przed przeprowadzeniem mikrodysekcji laserowej, a wycięty fragment jest transportowany do urządzenia zbierającego. Komórki nieinwazyjne oraz komórki zrębu są identyfikowane i izolowane przy użyciu tej samej metodologii. Trójwymiarowe kokultury poddano analizie profilu microRNA w celu porównania różnic w ekspresji microRNA pomiędzy komórkami znajdującymi się na inwazyjnym froncie nowotworu a komórkami w warstwowych strefach guza.Dane zostały posortowane według całkowitej zmiany oraz wartości danych w zakresie plus lub minus dwukrotność. Zmiany z reprezentacyjnego eksperymentu przedstawiają różnicową ekspresję genów mikroRNA pomiędzy komórkami marginesu nacieka i komórkami poza marginesem nacieka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre pojęcie o tym, jak konstruować anatomicznie odpowiednie modele organotypowe oraz jak wykorzystywać mikrodysekcję laserową do izolowania poszczególnych populacji komórek w celu dalszych badań. Whoa.

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Profilowanie molekularne środowiska mikrośrodowiska nowotworowego w 3-wymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i ex vivo fibroblastów

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę profilowania molekularnego inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów. Wykorzystaj mikrodisekcję laserową do izolacji komórek nowotworowych i stromalnych.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Przeglądaj więcej filmów