Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie charakterystycznej biologii na granicy między złośliwymi komórkami nabłonkowymi na froncie inwazyjnego guza a komórkami zrębu związanymi z rakiem. Osiąga się to poprzez najpierw ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z implantów okrężnicy. Drugim krokiem jest skonstruowanie organotypowych modeli współhodowli z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów okrężnicy i hodowanych komórek raka jelita grubego.

Następnie modele organotypowe są utrwalane w forminie, cięte na szkiełka nasączone membraną i barwione fioletem wyrostka zębodołowego. Ostatnim krokiem jest mikrodysekcja laserowa w celu oddzielenia inwazyjnych komórek nowotworowych od nieinwazyjnych komórek nowotworowych i komórek zrębowych związanych z rakiem. Ostatecznie techniki profilowania molekularnego mogą być wykorzystane do scharakteryzowania biologii inwazyjnych i nieinwazyjnych komórek nowotworowych i komórek zrębu w otaczającym mikrośrodowisku guza.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, jak wyraźnie można odróżnić komórki inwazyjne od komórek nieinwazyjnych w trójwymiarowych organotypowych modelach współhodowli raka jelita grubego. Na początek należy pobrać próbki normalnej tkanki błony śluzowej jelita grubego bezpośrednio z sali operacyjnej w laboratorium. Umieść próbkę na środku 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej, a następnie trzykrotnie umyj kulturę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS uzupełnionym penicyliną, streptomycyną i strefą grzybów.

Nie zasysać po ostatnim umyciu sterylnymi kleszczami i skalpelem, pokroić tkankę na małe kawałki. Następnie umieść każdy kawałek na środku krzyża narysowanego ostrzem skalpela. W 12-dołkowej płytce delikatnie nałóż skalpel na tkankę, aby umożliwić jej przyleganie do kultury.

Próbki w 750 mikrolitrach pierwotnej pożywki wzrostowej fibroblastów, która powinna zanurzyć tkankę, nie umożliwiając jej unoszenia się na wodzie. Następnie umieść próbki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, od pięciu do 10% CO2 w ciągu następnych pięciu dni. Fibroblasty powoli zaczną wyrastać z krawędzi tkanki po około siedmiu dniach.

Będzie to bardziej widoczne po około trzech do czterech tygodniach. A jeśli wyrasta wystarczająca ilość fibroblastów, dodaj 750 mikrolitrów trypsyny do każdego dołka po odłączeniu komórek i przenieś je do kolby do hodowli tkankowej T 25 w celu uzyskania żelu organotypowego nasączonego fibroblastami. Najpierw przygotuj zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 500 000 komórek na żel w uzupełnionym DMM.

Żele organotypowe należy przygotować na lodzie w proporcjach podanych w protokole tekstowym dla dziewięciu żeli w ilości jednego mililitra na żel. Przygotuj 10 mililitrów i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć bąbelków. Następnie dodaj jeden mililitr do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze.

Aby żele stwardniały po godzinie, dodaj jeden mililitr uzupełnionego DM EM na wierzch żeli i wróć na noc do inkubatora. Następnego dnia. Odessać pożywkę od góry żeli i płytkę o pojemności jednego mililitra pożywki zawierającej 500 000 komórek nabłonka raka jelita grubego do powlekanych żelem arkuszy nylonowych.

Przygotuj wcześniej sterylne autoklawy nylonowe arkusze o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść wymaganą liczbę nylonowych arkuszy w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym. Przygotować mieszaninę żelu na lodzie zgodnie z opisem w protokole tekstowym i dodać 0,1 molowego wodorotlenku sodu do mieszanki żelowej, aż zmieni kolor na różowy, co oznacza, że roztwór został zobojętniony.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów tego roztworu do każdego arkusza nylonu. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 30 minut, aby żel stwardniał. Następnie dodaj 10 mililitrów 1% roztworu aldehydu glutarowego w PBS do każdej 10-centymetrowej płytki hodowlanej.

Gdy żel stwardnieje przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę, należy umyć nylonowe arkusze trzy razy w PBS i raz w uzupełnionym dme. Arkusze należy inkubować przez noc w tym samym buforze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby podnieść żele organotypowe na stalowe siatki do inwazji wysterylizowanych rusztowań, które zostały przygotowane przez złożenie arkuszy ze stali nierdzewnej w formację trójnogu. Następnie za pomocą kleszczy, sterylizowanych i etanolu, umieść stalową siatkę w każdym dołku sześciodołkowej płytki.

Umieść powlekany żelem arkusz nylonu stroną z kolagenem do góry na każdej siatce. Ostrożnie przenieść żele organotypowe z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki, sterylizowanej i etanolu. Napełnij studzienkę uzupełnionym D mem, aż arkusz nylonu zetknie się z medium, ale nie zostanie zanurzony.

Upewnij się, że podłoże nie styka się z żelem organotypowym. Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze 5% CO2. Wymiana pożywki co dwa dni.

Usuń cały arkusz organotypowy, w tym nylonowy, ze studzienki i umieść go na folii przylegającej. Przetnij arkusz organotypowy i nylonowy za pomocą czystego jednorazowego skalpela i utrwal obie połówki w formaldehydzie na 24 godziny. W temperaturze pokojowej po 24 godzinach zastąp formaldehyd 70% etanolem i pozostaw na noc przed zatopieniem w parafinie, cięciem i barwieniem w celu przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej.

Pierwsza sekcja, organotypowy o grubości 10 mikronów na szkiełkach montowanych na membranie. Po potraktowaniu odcinków zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do przeprowadzenia mikrodysektu laserowego przy użyciu wybranej formy platformy. Umieść szkiełko szkiełkowe z sekcją bejcy, która ma być mikro wycięta.

Ekranem do dołu na stoliku mikroskopu zamontuj 0,5 mililitra mikroprobówki wirówkowej w kasecie zbiorczej i dodaj 50 mikrolitrów buforu do lizy komórek do nasadki, do której zbierze się mikrowypreparowana tkanka pod bezpośrednim widzeniem. Użyj joysticka, aby zidentyfikować interesującą tkankę i korzystając z interfejsu oprogramowania, opisz wybarwiony fragment organiczny, podświetlając komórki, które mają być mikrodostępne na froncie inwazji guza. Poinstruuj laser, aby wystrzelił, co powinno zarówno wyciąć podświetloną sekcję, jak i wepchnąć tkankę mikrodykcyjną do nasadki probówki mikrowirówki.

Przystąpić do przetwarzania próbek za pomocą odpowiedniej metody w celu ekstrakcji analitu będącego przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj obrazy mikrodysekcji laserowej komórek raka jelita grubego SW 480 atakujących zrąb organotypowy. Fiolet wyrostka zębodołowego służy do podkreślenia komórek nabłonka raka jelita grubego.

Inwazyjne wyspy nowotworowe są następnie definiowane przed sekcją laserową, a wycięty kawałek jest transportowany do urządzenia do pobierania. Komórki nieinwazyjne i komórki zrębu są identyfikowane i izolowane przy użyciu tej samej metodologii. Trójwymiarowe hodowle ko-agentów analizowano za pomocą profilowania mikroRNA w celu porównania mikroRNA o zróżnicowanej ekspresji między komórkami na froncie inwazyjnego guza i tymi w warstwowych strefach guza.

Dane zostały posortowane według pełnej zmiany i wartości danych plus minus dwukrotnie. Przedstawiono zmiany z reprezentatywnego eksperymentu wykazujące różnicową ekspresję genu mikro RNA między inwazyjnymi komórkami marginesowymi a nieinwazyjnymi komórkami marginesowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak konstruować anatomicznie odpowiednie modele organotypowe i jak wykorzystać mikrodysekcję laserową do izolowania poszczególnych populacji komórek do dalszych badań. Whoa.