Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka specyficznej biologii na styku złośliwych komórek nabłonkowych w inwazyjnym froncie nowotworu i komórek zrębowych związanych z rakiem. Jest to realizowane poprzez uprzednie ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z implantów jelita grubego. Drugim krokiem jest stworzenie organotypowych modeli kokultur z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów jelita grubego oraz hodowanych komórek raka jelita grubego.

Następnie modele organotypowe utrwalono w formie i wykonano ich przekroje na szkiełkach z zamocowaną membraną, a następnie zabarwiono fioletem krystalicznym. Ostatnim etapem jest mikrosekcja laserowa w celu oddzielenia naciekających komórek nowotworowych od komórek nowotworowych nienaciekających oraz komórek zrębu związanych z rakiem. W końcowej fazie można zastosować techniki profilowania molekularnego, aby scharakteryzować biologię naciekających i nienaciekających komórek nowotworowych oraz komórek zrębu w otaczającym mikrośrodowisku guza.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, jak wyraźnie komórki naciekające odróżniają się od komórek nienaciekających w trójwymiarowych organotypowych modelach współhodowli raka jelita grubego. Na początek należy pozyskać próbki prawidłowej tkanki błony śluzowej ludzkiego jelita grubego bezpośrednio z bloku operacyjnego w laboratorium. Próbkę umieszcza się w centrum 10 centymetrowej szalki do hodowli tkanek, a następnie hodowlę płucze się trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem penicyliny, streptomycyny i fungizonu.

Nie odsysać płynu po ostatnim płukaniu. Za pomocą sterylnej pęsety i skalpela pociąć tkankę na małe kawałki. Następnie każdy fragment umieścić w centrum krzyżyka narysowanego ostrzem skalpela. W płytce 12-dołkowej delikatnie poruszać skalpelem nad tkanką, aby umożliwić jej przywieranie do kultury.

Próbki umieść w 750 µL podstawowej pożywki do wzrostu fibroblastów, tak aby tkanka była całkowicie zanurzona, ale nie wypływała na powierzchnię. Następnie umieść próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5–10% CO2 na kolejne pięć dni. Fibroblasty zaczną powoli wyrastać z krawędzi tkanki po około siedmiu dniach.

Będzie to bardziej widoczne po około trzech do czterech tygodniach. Jeśli wyrosło wystarczająco dużo fibroblastów, po odklejeniu się komórek dodaj 750 µL trypsyny do każdej studni, po czym zbierz je i przenieś do kolby hodowlanej T 25 w celu przygotowania organotypowego żelu nasyconego fibroblastami. Najpierw przygotuj zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 500 000 komórek na żel w uzupełnionym dmm.

Przygotuj żele organotypowe w lodzie, zachowując proporcje podane w protokole tekstowym, dla dziewięciu żeli w ilości jednego mililitra na żel. Przygotuj 10 ml i wymieszaj delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj jeden mililitr do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze o zwiększonej wilgotności.

Aby umożliwić stężenie żeli po jednej godzinie, należy dodać 1 ml suplementowanej pożywki DMEM na wierzch żeli i pozostawić je w inkubatorze przez noc. Następnego dnia należy odessać pożywkę z powierzchni żeli i nanieść 1 ml pożywki zawierającej 500 000 komórek nabłonkowych raka jelita grubego na nylonowe arkusze pokryte żelem.

Przygotuj wcześniej sterylne, autoklawowane arkusze nylonowe o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra, używając sterylnej pęsety. Umieść wymaganą liczbę arkuszy nylonowych w 10 centymetrowej szalce hodowlanej. Przygotuj mieszaninę żelu w lodzie zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie dodawaj 0,1 molarny wodorotlenek sodu do mieszaniny żelu, aż zmieni ona kolor na różowy, co oznacza, że roztwór został zneutralizowany.

Następnie należy dodać 250 µL tego roztworu do każdej arkusza nylonowego. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 30 minut, aby żel stężał. W kolejnym kroku dodać 10 mL 1% roztworu glutaraldehydu w PBS do każdej szalki hodowlanej o średnicy 10 cm.

Po zastygnięciu żelu, przed inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, należy przemyć arkusze nylonowe trzy razy w PBS i raz w uzupełnionym dme. Arkusze należy inkubować przez noc w tym samym buforze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przenieść żele organotypowe na stalowe kratki służące jako sterylizowane rusztowania do inwazji, które przygotowano poprzez zagięcie arkuszy ze stali nierdzewnej w formę trójnogu. Następnie, używając pęsety wysterylizowanej etanolem, należy umieścić stalową kratkę w każdym dołku płytki sześciodołkowej.

Na każdej siatce należy umieścić nylonową arkusz powleczony żelem, stroną z kolagenem do góry. Organotypowe żele należy ostrożnie przenieść z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki wysterylizowanej etanolem. Dołek należy wypełnić uzupełnionym medium DMEM tak, aby arkusz nylonowy stykał się z medium, ale nie był w nim zanurzony.

Należy upewnić się, że pożywka nie styka się z żelem organotypowym. Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37°C w atmosferze z dodatkiem 5%CO2. Pożywkę wymieniać co dwa dni.

Wyjąć cały preparat organotypowy wraz z arkuszem nylonowym z dołka i umieścić go na folii spożywczej. Przeciąć preparat organotypowy oraz arkusz nylonowy na pół za pomocą czystego, jednorazowego skalpela, a następnie utrwalić obie połowy w formaldehydzie przez 24 godziny. Po 24 godzinach, w temperaturze pokojowej, zastąpić formaldehyd 70% ethanol i pozostawić na noc przed zatopieniem w parafinie, wykonaniem skrawków i barwieniem w celu przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej.

Pierwsze skrawki organotypowe o grubości 10 µm na szkiełkach z zamontowaną membraną. Po opracowaniu skrawków zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować się do przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej przy użyciu wybranej platformy. Umieść szkiełko przedmiotowe z zabarwionym skrawkiem przeznaczonym do mikrodysekcji.

Umieść odwróconą do góry dnem probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 milliliter w kasecie zbiorczej na stoliku mikroskopu i dodaj 50 microliters buforu do lizy komórek do zakrętki, do której pod bezpośrednią kontrolą wzrokową będą wpadać mikrodysekcjowane fragmenty tkanki. Za pomocą dżojstika zidentyfikuj interesującą tkankę, a następnie korzystając z interfejsu oprogramowania, zaznacz barwiony przekrój organiczny, wyróżniając komórki do mikrodysekcji na froncie naciekania nowotworu. Uruchom laser, który powinien zarówno wyciąć zaznaczony fragment, jak i wprowadzić mikrodysekcjonowaną tkankę do zakrętki probówki do mikrocentryfugi.

Przejdź do przetwarzania próbek odpowiednią metodą w celu wyekstrahowania badanego anality. Przedstawiono tutaj obrazy z mikrosekcji laserowej komórek raka jelita grubego SW 480 naciekających zrąb organotypowy. Fiolet krystaliczny został użyty do wyróżnienia nabłonkowych komórek raka jelita grubego.

Następnie wyznacza się inwazyjne wyspy nowotworowe przed przeprowadzeniem mikrodysekcji laserowej, a wycięty fragment jest transportowany do urządzenia zbierającego. Komórki nieinwazyjne oraz komórki zrębu są identyfikowane i izolowane przy użyciu tej samej metodologii. Trójwymiarowe kokultury poddano analizie profilu microRNA w celu porównania różnic w ekspresji microRNA pomiędzy komórkami znajdującymi się na inwazyjnym froncie nowotworu a komórkami w warstwowych strefach guza.

Dane zostały posortowane według całkowitej zmiany oraz wartości danych w zakresie plus lub minus dwukrotność. Zmiany z reprezentacyjnego eksperymentu przedstawiają różnicową ekspresję genów mikroRNA pomiędzy komórkami marginesu nacieka i komórkami poza marginesem nacieka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre pojęcie o tym, jak konstruować anatomicznie odpowiednie modele organotypowe oraz jak wykorzystywać mikrodysekcję laserową do izolowania poszczególnych populacji komórek w celu dalszych badań. Whoa.