Name: Ocena funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metody oceny funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek przy użyciu ultrasonografii i pomiaru prędkości fali tętniczej. Techniki te pozwalają badać sztywność tętnic i funkcję śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ninie Bispham za jej pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez American Heart Association (12POST11920023) i NIH (K23DK088833, K23DK087859).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB).
1. Przygotowanie do sesji testowej
<ol>
	<li>Uczestnicy powinni przestrzegać następujących ograniczeń, aby uzyskać najdokładniejsze pomiary: 12-godzinny post od jedzenia i kofeiny, 12-godzinny zakaz ćwiczeń, 12-godzinny zakaz palenia, jeśli dotyczy, >4 ograniczenie okresu półtrwania od leków, jeśli to możliwe (może to nie być wykonalne w populacji takiej jak pacjentki z PChN), a kobiety przed menopauzą powinny być badane w dniach 1-7 cyklu miesiączkowego, aby zminimalizować wpływy hormonalne.</li>
	<li>Przygotować 500 ml buforu dysocjacyjnego, dodając 2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,05 g heparyny (180 jednostek USP/mg) i 2,5 g albuminy surowicy bydlęcej do 476,8 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Włącz ultrasonografię, komputer i nieinwazyjną stację roboczą hemodynamiczną (NIHem; sprzęt do sztywności tętnic). Podłącz wyprowadzające ultradźwięki do skrzynki spustowej R-wave komputera.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przetwarzanie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Przeszkolona pielęgniarka lub lekarz przeprowadza pobieranie (kroki 2.2-2.5, 2.7), a badacz pobiera i przetwarza przewody (kroki 2.6, 2.8-2.19)</li>
	<li>Przygotuj miejsce przełokcia za pomocą miejscowego środka antyseptycznego, załóż opaskę uciskową, zlokalizuj żyłę i kaniuluj za pomocą cewnika 18 G. Umieść adapter heplock na końcu kroplówki.</li>
	<li>Załóż sterylne rękawice i umieść sterylne zasłony z okienkami na miejscu.</li>
	<li>Umieść 2 druty J na zasłonach. Pociągnij łuk "J", aby rozwinąć kształt "J" z obu drutów.</li>
	<li>Odkręć heplock i wprowadź drut J do żyły na około 8 cm. Popchnij kilka razy w przód iw tył przed wyjęciem drutu. Unikaj dużej krwi na drucie.</li>
	<li>Użyj nożyc do drutu, aby przeciąć druty tak, aby zmieściły się w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej ~30 ml buforu dysocjacyjnego</li>
	<li>Powtórz krok 2.5 dla drugiego przewodu.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 dla drugiego przewodu. Wróć rurkę do mokrego laboratorium.</li>
	<li>Zapnij przewody za pomocą kleszczy i przytrzymaj druty wewnątrz rurki, ale nad roztworem. Przez 10 minut za pomocą zmotoryzowanego pipetera kilkakrotnie zbieraj bufor dysocjacyjny z rurki stożkowej o pojemności 50 ml i uwalniaj go tak, aby spływał wzdłuż drutów, aby przepłukać i wibrować przewody, a następnie strząśnij nadmiar płynu z drutów do rurki.</li>
	<li>Wirować przez 7 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór formaldehydu w probówce pokrytej folią, łącząc 100 ml roztworu formaldehydu + 900 ml PBS.</li>
	<li>Powoli wyjmij probówkę z wirówki, włącz pompę próżniową, umieść końcówkę pipety na końcu węża ssącego i pozostaw ~400 ml w probówce, odkurzając resztę bez naruszania granulatu.</li>
	<li>Przykryj folią i odpipetuj 1 ml roztworu formaldehydu do probówki, aby utrwalić próbkę. Nie zawieszaj ponownie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 8 slajdów, oznaczając je tematem i informacjami o wizycie studyjnej oraz rysując owal na każdym slajdzie za pomocą pisaka.</li>
	<li>Dodać 15 ml PBS, zawiesić i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.15, dodać 12 ml PBS, zawiesić i odwirować przez 6 minut w temperaturze 400 x g i 4 °C.</li>
	<li>Powoli wyjmij probówkę z wirówki, włącz pompę próżniową, umieść końcówkę pipety na końcu węża ssącego i pozostaw ~2 ml w probówce, odkurzając resztę bez naruszania granulki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i równomiernie pipetować na 8 szkiełkach w owalnych obszarach.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 godzin, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do analizy (próbki będą w porządku przez wiele lat).</li>
</ol>
3. Ocena FMDBA i aPWV
<ol>
	<li>Poproś osobę badawczą o przebranie się w jednorazowe spodenki i położenie jej na wznak w cichym, ciemnym, klimatyzowanym pomieszczeniu.</li>
	<li>Umieść odpowiednią liczbę EKG dla konkretnego urządzenia ultrasonograficznego i sztywności tętnic (ta procedura wykorzystuje nieinwazyjną stację roboczą hemodynamiczną [NIHem] do pomiaru sztywności tętnic, co wymaga 4 elektrod) i mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na badanym.</li>
	<li>Po 20 minutach rozpocznij pomiary ciśnienia krwi. Wykonaj co najmniej 3 czynności i powtarzaj, aż pomiary będą mieścić się w granicach 5 mmHg, odpoczywając 2 minuty między każdym odczytem.</li>
	<li>Rozpocznij tonometrię od badania palpacyjnego pulsu tętnicy ramiennej i umieszczenia tonometru w celu zarejestrowania przebiegów ramiennych za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Powtórz dla tętnic promieniowych, udowych i szyjnych.</li>
	<li>Zmierz odległość do każdego z tych miejsc od wcięcia nadmostkowego za pomocą taśmy mierniczej (ramiennej, promieniowej i szyjnej) oraz niestandardowej linijki/suwmiarki (kości udowej).</li>
	<li>Oblicz tętnicę szyjną i ramienną, tętnicę szyjną promieniową i tętnicę szyjną i kość udową (aPWV) za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Umieść mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na przedramieniu tylko dystalnie do wyrostka łokciowego i zarejestruj co najmniej 10 cykli serca wyjściowych obrazów ultrasonograficznych tętnicy ramiennej i pomiarów prędkości przepływu krwi, z oprogramowaniem naczyniowym ustawionym na tryb wyzwalania. W razie potrzeby można użyć ramienia mechanicznego do ustabilizowania sondy ultradźwiękowej.</li>
	<li>Napompuj mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na przedramieniu do 250 mmHg i uruchom timer. Poinstruuj uczestnika, aby pozostał bardzo nieruchomy.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrowanie prędkości za pomocą oprogramowania naczyniowego ustawionego na tryb wyzwalania, gdy timer wskaże 4:45. Spust Zwolnij mankiet o 5:00 i zmień ultradźwięki, aby rejestrować obrazy w trybie B (średnicy), gdy zegar wskazuje 5:10.</li>
	<li>Kontynuuj nagrywanie, aż zegar wskaże 7:00.</li>
	<li>Zarejestruj co najmniej 10 cykli serca wyjściowych obrazów ultrasonograficznych tętnicy ramiennej za pomocą oprogramowania naczyniowego ustawionego na tryb wyzwalania.</li>
	<li>Zmierz ciśnienie krwi testera. Jeśli skurczowe ciśnienie krwi >100 mmHg, umieść 0,4 mg podjęzykowej nitrogliceryny pod językiem pacjenta i rozpocznij odliczanie, chyba że pacjent ma inne przeciwwskazania.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie w trybie B (obrazy średnicy), gdy zegar wskaże 3:00 z oprogramowaniem naczyniowym ustawionym na tryb wyzwalania.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie, gdy zegar wskaże 8:00.</li>
	<li>Monitoruj ciśnienie krwi, aż powróci do wartości wyjściowej</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów kontrolnych z komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC)
<ol>
	<li>Uprawiaj HUVEC do przejścia 5-6 i ~80% konfluencji.</li>
	<li>Trypsynizować za pomocą 3 ml trypsyny lub czegokolwiek, co jest niezbędne do naczynia/kolby.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą równej objętości roztworu neutralizującego trypsynę.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez ~5 min i usunąć trypsynę i roztwór neutralizujący za pomocą próżni.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w ~10 ml PBS do umycia.</li>
	<li>Odwirować przy 200 x g ~ 5 min. Usunąć PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i utrwal 1800 μl PBS + 200 μl formaldehydu.</li>
	<li>Zawiesić w PBS (~10 ml).</li>
	<li>Odwirować przy 200 x g ~5 min. Usunąć PBS, ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości, aby dodać ~200 μl na szkiełko.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy (próbki będą w porządku przez wiele lat).</li>
</ol>
5. Barwienie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z zamrażarki o temperaturze -80 °C i odczekaj 5 minut w temperaturze pokojowej (ta procedura dotyczy partii 10 szkiełek, w tym jednego szkiełka kontrolnego HUVEC).</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar wody delikatną chusteczką zadaniową (nie dotykaj środka szkiełka).</li>
	<li>Ponownie nawodnij szkiełka, dodając zmieniony PBS do każdego szkiełka i pozostaw je na 10 minut.</li>
	<li>Gdy szkiełka stoją, przygotuj 5% surowicę osła i inne roztwory.
	<ol>
		<li>Przygotuj 5% surowicy osła, dodając 300 μl surowicy osła do 5 700 μl zmienionego PBS (do pH 7,4) na maksymalnie 10 szkiełkach (zwiększ tę ilość, aby uzyskać więcej).</li>
		<li>Rozcieńczyć pierwotne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania w 1 000 μl 5% surowicy. Na przykład nitrotyrozyna i oksydaza NADPH (1:300 i 1:1,500) mogą być stosowane jako markery stresu oksydacyjnego.</li>
		<li>Przygotować wtórny AF568, rozcieńczając 5 μl AF568 do 1,500 μll 5% surowicy.</li>
		<li>Przygotować kadherynę VE, rozcieńczając 2 μl kadheryny VE do 1 000 μl 5% surowicy.</li>
		<li>Przygotować AF488, rozcieńczając 5 μl kadheryny VE do 1 000 μl 5% surowicy.</li>
		<li>Przechowuj AF568, kadherynę VE i AF488 pod folią przez cały proces, a następnie umieść na bujaku w lodówce o temperaturze 4 °C podczas przygotowywania szkiełek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 10 minutach nawodnienia wysusz szkiełka delikatną ściereczką zadaniową.</li>
	<li>Dodaj 5% serum osła przez 60 minut i umieść kawałek plastikowej folii parafinowej na zakreślonym obszarze, aby zapewnić całkowite pokrycie substancji chemicznej.</li>
	<li>Wyrzuć plastikową folię parafinową i suche szkiełka za pomocą delikatnej ściereczki roboczej. Nie prać. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe na 60 minut i umieść kawałek plastikowej folii parafinowej na zakreślonym obszarze, aby zapewnić pełne pokrycie substancji chemicznej.</li>
	<li>Wyrzuć plastikową folię parafinową, spłucz zmienionym PBS z butelki ze spryskiwaczem i zanurz w kolumnach szkiełkowych przez 5 minut. Gdy zjeżdżalnie nasiąkną, przenieś je do ciemnego pomieszczenia. Pracuj w ciemności dla wszystkich pozostałych kroków.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka za pomocą chusteczek Kimwipes, dodać AF568 (przeciwciało wtórne) na 45 minut i umieścić kawałek plastikowej folii parafinowej na zakreślonym obszarze, aby zapewnić całkowite pokrycie substancji chemicznej. Osłona przed światłem.</li>
	<li>Wyrzuć plastikową folię parafinową do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Spłucz zmienionym PBS z butelki ze spryskiwaczem, a następnie moczyć w kolumnach przez 5 minut.</li>
	<li>Wysusz szkiełka chusteczkami Kimwipe, a następnie dodaj kadherynę VE na 60 minut i umieść kawałek plastikowej folii parafinowej na zakreślonym obszarze, aby zapewnić pełne pokrycie substancji chemicznej. Osłona przed światłem.</li>
	<li>Wyrzuć plastikową folię parafinową do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Spłucz zmienionym PBS z butelki ze spryskiwaczem, a następnie moczyć w kolumnach przez 5 minut.</li>
	<li>Osusz szkiełka delikatną ściereczką zadaniową, dodaj AF488 na 30 minut i umieść kawałek plastikowej folii parafinowej na zakreślonym obszarze, aby zapewnić całkowite pokrycie substancji chemicznej. Osłona przed światłem.</li>
	<li>Wyrzuć plastikową folię parafinową do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Spłucz zmienionym PBS z butelki ze spryskiwaczem, a następnie moczyć w kolumnach przez 5 minut.</li>
	<li>Wysuszyć preparaty delikatną ściereczką i pozostawić do wyschnięcia na 20 minut. Przykryć przed światłem.</li>
	<li>Dodać tylko jedną kroplę podłoża mocującego fluoroshield z 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolowym chlorowodorkiem (DAPI) do każdego szkiełka i przykryć każdą z nich szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść szkiełka w lodówce o temperaturze 4 °C, przykrytej folią. Obrazowanie musi zostać zakończone w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
6. Obrazowanie i analiza komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Przygotuj mikroskop do obrazowania barwionych komórek śródbłonka zgodnie ze specyfikacją konkretnego mikroskopu. Pojedynczy zaślepiony technik powinien przeanalizować dowolne białko dla partii komórek.</li>
	<li>Systematycznie skanuj slajdy. Zidentyfikuj komórki śródbłonka przez dodatnie barwienie dla kadheryny VE i potwierdź integralność jądrową przez dodatnie barwienie dla DAPI.</li>
	<li>Zobrazuj 30 komórek na slajdzie do późniejszej analizy. Powtórzyć te czynności dla każdego szkiełka w barwionej partii, w tym dla HUVEC.</li>
	<li>Przeanalizuj intensywność barwienia dla podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania jakościowego .</li>
	<li>Aby zminimalizować możliwy mylący efekt różnic w intensywności barwienia między różnymi sesjami barwienia, należy podać wartości jako stosunek ekspresji białka w pobranych komórkach śródbłonka do tej samej ekspresji białka w HUVEC.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Uzyskanie dokładnych wyników dla FMDBA i aPWV wymaga uzyskania wysokiej jakości obrazów ultrasonograficznych i przebiegów ciśnienia. Kluczowe znaczenie ma przy tym odpowiednie i ciągłe szkolenie oraz stosowanie każdej techniki przez operatora44. Ponadto bardzo ważne jest, aby kontrolować jak najwięcej zmiennych zewnętrznych, które mogą mieć wpływ na wyniki, poprzez standaryzację sesji testowej (np. wcześniejszy 12-godzinny post, klimatyzowane pomieszczenie itp.)44,45. Ja...

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest poważnym problemem zdrowia publicznego, który osiągnął rozmiary epidemii, dotykając ~11,5% populacji w samych Stanach Zjednoczonych1. Ryzyko zgonu z przyczyn sercowo-naczyniowych lub incydentu sercowo-naczyniowego u pacjentów z PChN jest znacznie zwiększone w porównaniu z populacją ogólną2-4. Chociaż pacjenci z PChN wykazują wysoką częstość występowania tradycyjnych czynników ryzyka sercowo-naczyniowego, wyjaśnia to tylko część zwiększonej częstości występowania u nich chorób sercowo-naczyniowych (CVD)5. Dysfunkcja naczyń krwionośnych jest ważnym nietradycyjnym czynnikiem ryzyka sercowo-naczyniowego, który zyskuje coraz większe uznanie w dziedzinie nefrologii6-9.
Podczas gdy wiele zmian prawdopodobnie przyczynia się do rozwoju dysfunkcji tętnic, do najbardziej niepokojących należy rozwój dysfunkcji śródbłonka naczyniowego, najczęściej oceniany jako upośledzone rozszerzenie zależne od śródbłonka (EDD) oraz usztywnienie dużych elastycznych tętnic10. Istnieją różne techniki oceny EDD i dużej elastycznej sztywności tętnicy, ale najczęściej stosowanymi są odpowiednio rozszerzenie tętnicy ramiennej za pośrednictwem przepływu FMDi prędkość fali tętna w aorcie (aPWV). Inną powszechnie stosowaną techniką oceny EDD jest pomiar odpowiedzi przepływu krwi na przedramieniu na środki farmakologiczne, takie jak acetylocholina, za pomocą pletyzmografii okluzji żylnej11,12. Metodologia ta wymaga jednak cewnikowania tętnicy ramiennej, które jest bardziej inwazyjne niż FMDBA i może być przeciwwskazane u pacjentów z PChN. Alternatywną techniką oceny sztywności tętnicy jest pomiar lokalnej podatności tętniczej (odwrotności sztywności) tętnicy szyjnej, chociaż nie jest to tak szeroko stosowane ani zwalidowane z klinicznymi punktami końcowymi jak aPWV13 .
Pacjenci z PChN wykazują zarówno upośledzoną FMDBA14-16, jak i zwiększoną prędkość fali tętna aorty aPWV13,17,18, nawet przed koniecznością dializy. Co ważne z perspektywy klinicznej, obie te nieinwazyjne miary dysfunkcji naczyń są niezależnymi predyktorami przyszłych zdarzeń sercowo-naczyniowych i śmiertelności zarówno u pacjentów z PChN19-21, jak i w innych populacjach22-26. Techniki te można zastosować do badania różnych populacji zagrożonych chorobami układu krążenia, w tym pacjentów z PChN.
Dokładne mechanizmy, dzięki którym rozwija się dysfunkcja tętnic w PChN, nie są w pełni zrozumiałe; jednak zmniejszona biodostępność tlenku azotu (NO) jest krytycznym czynnikiem27-30 i wspólnym mechanizmem zarówno upośledzenia EDD, jak i zwiększonej sztywności tętnic10,31. W PChN stres oksydacyjny jest zwiększony i przyczynia się do zmniejszenia biodostępności NO32-34. Stres oksydacyjny definiuje się jako nadmierną biodostępność reaktywnych form tlenu (ROS) w stosunku do obrony antyoksydacyjnej. Bodźce fizjologiczne, w tym sygnalizacja zapalna, sprzyjają układom enzymów utleniających (np. enzymowi utleniającemu oksydazie NADPH) do wytwarzania ROS, w tym anionu ponadtlenkowego (O2●-)35. Produkcja ponadtlenku ostatecznie prowadzi do zmniejszenia biodostępności tlenku azotu (NO).
Upośledzona biodostępność NO może z kolei przyczyniać się do rozwoju PChN, ponieważ dysfunkcja śródbłonka jest niezależnym predyktorem wystąpienia PChN36. Jest to zgodne z danymi na zwierzętach wskazującymi, że hamowanie eNOS indukuje nadciśnienie (układowe i kłębuszkowe), niedokrwienie kłębuszków nerkowych, stwardnienie kłębuszków nerkowych i uszkodzenie cewkowo-śródmiąższowe37. Rzeczywiście, zmniejszona biodostępność NO wydaje się niezbędna do rozwoju i progresji eksperymentalnej choroby nerek, która naśladuje chorobę człowieka, co sugeruje kluczową rolę dysfunkcji śródbłonka w PChNu ludzi 38,39.
Markery stresu oksydacyjnego naczyń krwionośnych mogą być oceniane w komórkach śródbłonka naczyniowego pobranych od ludzi biorących udział w badaniach, przy użyciu techniki pierwotnie opracowanej przez Colombo et al.40 oraz zmodyfikowane Seals i wsp. 41-43. Za pomocą 2 sterylnych drutów w kształcie litery J komórki są pobierane z żyły łokciowej, odzyskiwane, naprawiane, a następnie pozytywnie identyfikowane jako komórki śródbłonka i analizowane pod kątem ekspresji interesujących białek za pomocą immunofluorescencji.
Przedstawiamy tutaj dyskusję na temat tej metodologii, która może być użyta do: a) pomiaruFMD BA; b) pomiar aPWV; c) Pomiar ekspresji białek komórek śródbłonka naczyń krwionośnych markerów stresu oksydacyjnego. Nacisk kładziony jest na pacjentów z PChN, którzy nie wymagają przewlekłej dializy.

<table><tbody><tr><td>J-wire</td><td>St. Jude</td><td>404584</td><td>2 na kolekcję</td></tr><tr><td>Spodenki jednorazowe (MediShorts)</td><td>Quick Medical</td><td>4507</td><td></td></tr><tr><td>Nieinwazyjna hemodynamiczna stacja robocza (NIHem)</td><td>Cardiovascualr Engineering</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zawiera niestandardową linijkę.&nbsp; Alternatywnym systemem jest Sphygmocor</td></tr><tr><td>Ultrasound</td><td>G.E.</td><td>Model: Vivid7 Dimension</td><td>Używamy GE, ale istnieje wiele firm i modeli</td></tr><tr><td>Oprogramowanie naczyniowe (Vascular Imager)&nbsp;</td><td>Zastosowania obrazowania medycznego Nie</td><td>dotyczy Skrzynka</td><td></td></tr><tr><td>spustowa R-wave</td><td>Zastosowania obrazowania medycznego</td><td>Nie dotyczy</td><td>niestandardowego</td></tr><tr><td>systemu szybkiego napełniania mankietów</td> Model <td>Hokanson</td>: Mankiet do pomiaru ciśnienia krwi <td>Hokanson E20</td><td></td></tr> na <tr><td>przedramieniu</td> Niestandardowy mankiet <td>Hokanson</td><td>N/A</td><td>z pęcherzem 6,5 x 34 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Invitrogren</td><td>C-015-5C</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Pióro do pap</td><td>Produkty badawcze Międzynarodowe</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>VE Kadheryna</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td></td></tr><tr><td>AF568</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>zależy od specyfikacji microscpe&nbsp;</td></tr><tr><td>AF488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>zależy od specyfikacji microscpe&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało nitrotyrozynowe&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7048</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko oksydazie NADPH</td><td>Upstate</td><td>07-001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Delikatna chusteczka zadaniowa (Kimwipe)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A Plastikowa folia</td><td></td></tr><tr><td>parafinowa (parafilm)&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Model Olympus</td><td>: FV1000 FCS/RICS</td><td>istnieje wiele opcji&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ocena funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Pacjenci z przewlekłą chorobą nerek (PChN) mają znacznie zwiększone ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD) w porównaniu z populacją ogólną, co jest tylko częściowo wyjaśnione przez tradycyjne czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Dysfunkcja naczyń krwionośnych jest ważnym nietradycyjnym czynnikiem ryzyka, charakteryzującym się dysfunkcją śródbłonka naczyń krwionośnych (najczęściej ocenianą jako upośledzone poszerzenie zależne od śródbłonka [EDD]) i usztywnieniem dużych tętnic elastycznych. Chociaż istnieją różne techniki oceny EDD i sztywności dużych elastycznych tętnic, najczęściej stosowanymi są odpowiednio rozszerzenie tętnicy ramiennej za pośrednictwem przepływu (FMDBA) i prędkość fali tętna w aorcie (aPWV). Obie te nieinwazyjne miary dysfunkcji naczyń są niezależnymi predyktorami przyszłych zdarzeń sercowo-naczyniowych u pacjentów z chorobą nerek i bez niej. Pacjenci z PChN wykazują zarówno upośledzonebadanie BA FMD, jak i zwiększoną aPWV. Chociaż dokładne mechanizmy, za pomocą których rozwija się dysfunkcja naczyń w PChN, nie są w pełni poznane, ważnym czynnikiem jest zwiększony stres oksydacyjny i wynikające z niego zmniejszenie biodostępności tlenku azotu (NO). Zmiany komórkowe w stresie oksydacyjnym można ocenić, pobierając komórki śródbłonka naczyń krwionośnych z żyły łokciowej i mierząc ekspresję białek markerów stresu oksydacyjnego za pomocą immunofluorescencji. Przedstawiamy tutaj omówienie tych metod pomiaru FMDBA, aPWV i ekspresji białek komórek śródbłonka naczyniowego.

FMDBA określa się jako maksymalną zmianę średnicy tętnicy ramiennej po wystąpieniu hiperemii reaktywnej. W związku z tym średnicę w spoczynku porównuje się ze średnicą po zakończeniu 5-minutowego okresu okluzji mankietem do pomiaru ciśnienia krwi (Rycina 1). Panel A przedstawia reprezentatywny obraz ultrasonograficzny tętnicy ramiennej, a Panel B prezentuje wykres zmiany średnicy zsynchronizowanej z załamkiem R, od momentu zwolnienia mankietu do 2 min później, uzyskany przy użyciu dostępnego k...

Stopień dysfunkcji naczyń krwionośnych i przyczyniających się do nich mechanizmów fizjologicznych można ocenić u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek, mierząc rozszerzenie zależne od przepływu tętnicy ramiennej, prędkość fali tętna aorty i ekspresję białka w komórkach śródbłonka naczyniowego.

Ocena funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena funkcji naczyniowych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie komórek śródbłonka naczyniowego od pacjentów. Następnie oceniana jest prędkość fali tętna w aorcie w celu pomiaru sztywności dużych tętnic elastycznych. W kolejnym kroku mierzone jest rozszerzenie tętnicy ramiennej zależne od przepływu, aby ocenić funkcję śródbłonka naczyniowego.Ostatecznie można uzyskać wyniki charakteryzujące funkcję śródbłonka naczyniowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań naczyniowych, takie jak zmiany zachodzące na poziomie komórkowym w ekspresji różnych białek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ opanowanie obrazowania ultradźwiękowego wymaga intensywnej praktyki i przeszkolenia.Procedurę zademonstruje Lonnie Perino, asystent badawczy z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować miejsce zabiegu za pomocą antyseptyki miejscowej. Następnie nad miejscem zabiegu należy rozłożyć sterylne draperie okienne.Wytrenżowana pielęgniarka lub lekarz powinni założyć kaniulę dożylną i podłączyć adapter do blokady heparynowej. Połóż dwa druciki J na sterylnych obłożeniach, aby rozwinąć ich kształt litery J. Pociągnij za łuk litery J w obu drucikach.Po rozwinięciu odkręć zatyczkę blokady heparynowej i wprowadź JWI do żyły na głębokość około ośmiu centymetrów. Przed wyjęciem kilkukrotnie przesuń drut w przód i w tył, aby zapobiec nadmiernemu osadzeniu się krwi na drucie. Następnie, za pomocą przecinaków do drutu, utnij druty tak, aby zmieściły się w probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej około 30 mililitrów buforu do dysocjacji.Po zakończeniu pobierania próbek powtórz te kroki dla drugiego drutu. Wróć do laboratorium mokrego. Chwyć druty pęsetą i trzymaj je wewnątrz probówki, ale nad roztworem, przez 10 minut.Używając zautomatyzowanej pipety, wypłucz druty buforem dysocjującym z probówki. Puść bufor tak, aby spłynął wzdłuż drutów, a następnie strząśnij nadmiar cieczy z powrotem do probówki. Wyjmij druty i odwiruj próbkę w celu utworzenia osadu.Wyjąć próbki i resuspender osad w PBS przed wirowaniem. Następnie, przez kolejne pięć minut, używać końcówki pipety zamocowanej na końcu węża ssącego, aby pozostawić w probówce około 2 mL płynu. Resztę odessać za pomocą pompy próżniowej, uważając, aby nie naruszyć osadu.Resuspender osad i równomiernie nanieść próbkę pipetą na owalne obszary ośmiu uprzednio oznakowanych szkiełek. Umieścić szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C na pięć godzin, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia analizy. Badany powinien przebrać się w jednorazowe spodenki i położyć się na plecach w cichym, zaciemnionym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze.Po przygotowaniu do rozpoczęcia procedury należy odpowiednio umieścić elektrody dla urządzenia do badania USG oraz sztywności tętnic. Następnie załóż mankiet do pomiaru ciśnienia tętniczego na badanym. Rozpocznij pomiary ciśnienia tętniczego po 20 minutach i powtarzaj je do momentu, aż wyniki będą mieścić się w granicach pięciu mmHg.Odpoczywaj przez dwie minuty pomiędzy każdym pomiarem, wykonując co najmniej trzy odczyty. Następnie zlokalizuj palpacyjnie tętno z tętnicy ramiennej i umieść sonometr, aby zarejestrować formy fal tętnicy ramiennej. Powtórz procedurę dla tętnic promieniowej, udowej i szyjnej.Zmierz odległość od każdego z tych miejsc do wcięcia nadmostkowego, używając miary krawieckiej w przypadku tętnic ramiennej, promieniowej i szyjnej oraz specjalistycznej linijki dla tętnicy udowej. Następnie oblicz prędkość fali tętna dla odcinków szyjno-ramiennego, szyjno-promieniowego i szyjno-udowego za pomocą specjalistycznego oprogramowania. Załóż mankiet do pomiaru ciśnienia tętniczego na przedramieniu, tuż za wyrostkiem rzępki.Ustaw oprogramowanie naczyniowe w trybie wyzwalania i zarejestruj co najmniej 10 cykli serca dla obrazów USG tętnicy ramiennej w stanie spoczynkowym oraz pomiarów prędkości przepływu krwi. W razie potrzeby można użyć ramienia mechanicznego, aby ustabilizować głowicę USG. Następnie napompuj mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na przedramieniu do 250 mmHg.Następnie uruchom stoper. Poinstruuj uczestnika, aby pozostał w całkowitym bezruchu. Rozpocznij pomiar prędkości, gdy stoper wskaże 4 minuty i 45 sekund.Zwolnij ucisk mankietu w piątej minucie i przełącz aparat ultrasonograficzny na rejestrację obrazów w trybie B. Gdy zegar wskaże pięć minut i 10 sekund, kontynuuj rejestrację do momentu, aż zegar wskaże siedem minut.Następnie zmierz ciśnienie tętnicze badanego. Jeśli skurczowe ciśnienie tętnicze wynosi 100 mmHg lub więcej, podaj 0,4 mg nitrogliceryny podjęzykowo i uruchom stoper. Rozpocznij rejestrację w trybie B, gdy zegar wskaże trzy minuty, a następnie zakończ rejestrację.Po upływie ośmiu minut. W celu analizy barwionych komórek śródbłonka, pojedynczy badacz pracujący w ślepej próbie powinien systematycznie przeskanować preparaty; komórki śródbłonka są identyfikowane na podstawie pozytywnego barwienia na VE cadherin, a integralność jądra jest potwierdzana pozytywnym barwieniem dapi. Dodatkowo komórki powinny zostać zabarwione pod kątem białka będącego przedmiotem badania.Na każdym preparacie należy obrazować łącznie 30 komórek do późniejszej analizy. Powtórz ten proces dla każdego preparatu w barwionej serii, w tym dla preparatu kontrolnego VE. Do analizy intensywności barwienia badanego przeciwciała pierwszorzędowego wykorzystuje się oprogramowanie do analizy jakościowej.Na tym obrazie przedstawiono bazową średnicę tętnicy ramiennej uzyskaną podczas badania pacjenta z przewlekłą chorobą nerek dwie minuty po zwolnieniu mankietu. Nagranie to pokazuje zmianę średnicy zsynchronizowaną z załamkiem R. Takie kształty fal uzyskano w każdej z tętnic szyjnych oraz udowych.Różnica w czasie i odległości została wykorzystana do obliczenia prędkości fali tętna w aorcie. W tej części analizowano komórki kontrolne i komórki pacjentów pod kątem integralności jądra za pomocą DPI, ekspresji komórek śródbłonka za pomocą VE kadheryny oraz pod kątem enzymu utleniającego NADPH oksydazy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uzyskać najwyższej możliwej jakości obrazy ultrasonograficzne, przebiegi fal oraz obrazy komórek śródbłonka w celu zapewnienia dokładnej i ilościowej oceny.Należy pamiętać, że praca z próbkami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

assessment-vascular-function-patients-with-chronic-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zaprezentowano nieinwazyjną procedurę oceny funkcji śródbłonka z wykorzystaniem urządzenia Endo-PAT 2000.

Ocena funkcji rozszerzania naczyń śródbłonka za pomocą urządzenia Endo-PAT 2000

Kapilaroskopia to nieinwazyjna, stosunkowo tania metoda bezpośredniej wizualizacji mikrokrążenia. Technika przepływu krwi w przedramieniu zapewnia akceptowane nieinwazyjne pomiary funkcji śródbłonka.

Nieinwazyjna ocena funkcji mikrokrążenia i śródbłonka

Niniejszy artykuł opisuje metodologiczne rozważania dotyczące kilku nieinwazyjnych ocen funkcji i morfologii naczyń krwionośnych, które są powszechnie stosowane w badaniach medycznych do oceny różnych etapów miażdżycy.

Metodologiczne podejście do nieinwazyjnej oceny funkcji i morfologii naczyń krwionośnych

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Opisujemy ocenę współczynnika determinacji między gęstością naczynia a gęstością perfuzji powierzchownego splotu kapilarycznego przydołkowego, aby określić udział naczyń większych niż naczynia włosowate w gęstości perfuzji.

Ocena udziału naczyń włosowatych i innych naczyń w gęstości perfuzji plamki żółtej mierzonej za pomocą angiografii optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy chirurgiczne tworzenia mysiej wspólnej przetoki tętniczo-żylnej. Opracowaliśmy ten model do badania patofizjologii kończyn związanej z dostępem do hemodializy.

Mysi model dysfunkcji ręki związanej z dostępem do hemodializy

Ultrasonografia przyłóżkowa (POCUS) jest często stosowana do oceny obwodu hemodynamicznego i wykrywania obecności przekrwienia żylnego. System oceny ultrasonografii nadmiaru żylnego (VExUS) został opracowany, aby pomóc klinicystom w przewidywaniu wpływu przekrwienia żylnego na dysfunkcję narządów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie akwizycji i interpretacji obrazu VExUS.

Demistyfikacja nadmiaru żylnego ultrasonografia (VExUS): akwizycja i interpretacja obrazu

W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, ułatwiający badania przedkliniczne w celu opracowania farmaceutycznego.

Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki

Omówiono metodologię gromadzenia gęstych danych potencjałów wywołanych podczas wykonywania przez pacjentów z chorobą Alzheimera zadania z pamięcią rozpoznawczą. Protokół ten obejmuje przygotowanie badanych, zapewnienie jakości, akwizycję danych oraz analizę danych.

Badanie charakterystyki pamięci epizodycznej z wykorzystaniem potencjałów wywołanych zdarzeniami u pacjentów z chorobą Alzheimera

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest zaawansowaną techniką cytogenetyczną służącą do identyfikacji aberracji genomicznych i chromosomalnych. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, które umożliwiają klasyfikację wszystkich chromosomów. SKY pozwala również na identyfikację złożonych aberracji chromosomalnych oraz wad segregacji u myszy i ludzi z różnymi schorzeniami, w tym z wielotorbielkową chorobą nerek.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Poznaj metody oceny funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek przy użyciu ultrasonografii i pomiaru prędkości fali tętniczej. Techniki te pozwalają badać sztywność tętnic i funkcję śródbłonka.

Ocena funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek

Przeglądaj więcej filmów