Ocena funkcji naczyń krwionośnych u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek
16 czerwca 2014
Stopień dysfunkcji naczyń krwionośnych i przyczyniających się do nich mechanizmów fizjologicznych można ocenić u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek, mierząc rozszerzenie zależne od przepływu tętnicy ramiennej, prędkość fali tętna aorty i ekspresję białka w komórkach śródbłonka naczyniowego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena funkcji naczyń krwionośnych U pacjentów z przewlekłą chorobą nerek osiąga się to poprzez pobranie najpierw komórek śródbłonka naczyń krwionośnych od pacjentów. Następnie ocenia się prędkość fali tętna w aorcie w celu zmierzenia dużej elastycznej sztywności tętnicy. Następnie mierzy się rozszerzenie za pośrednictwem przepływu w tętnicy ramiennej w celu oceny funkcji śródbłonka naczyniowego.
Ostatecznie można uzyskać wyniki charakteryzujące funkcję śródbłonka naczyń krwionośnych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naczyń krwionośnych, takie jak to, co dzieje się na poziomie komórkowym z ekspresją różnych białek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ do opanowania obrazowania ultradźwiękowego wymagana jest rozległa praktyka i szkolenie.
Procedurę zademonstruje Lonnie Perino, asystent naukowy z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, przygotuj witrynę za pomocą miejscowego środka antyseptycznego. Następne miejsce sterylne zasłony z okienkami nad terenem.
Przeszkolona pielęgniarka lub lekarz powinien umieścić kroplówkę i podłączyć adapter hep lock. Umieść dwa druty J na zasłonach, aby rozwinąć kształt J. Pociągnij łuk J na obu przewodach.
Po rozwinięciu odkręć blokadę hep i wprowadź JWI do żyły na około osiem centymetrów. Popchnij drut kilka razy do przodu i do tyłu przed wyjęciem, aby uniknąć gromadzenia się zbyt dużej ilości krwi na drucie. Następnie użyj nożyc do drutu, aby przeciąć druty tak, aby zmieściły się w 50-mililitrowej stożkowej rurce zawierającej około 30 mililitrów buforu dysocjacyjnego.
Powtórz te kroki dla drugiego przewodu po zakończeniu pobierania próbki. Wróć do mokrego laboratorium. Zapnij druty kleszczami i trzymaj je wewnątrz rurki, ale nad roztworem przez 10 minut.
Za pomocą pipetera z napędem silnikowym przepłukać przewody buforem dysocjacyjnym z probówki. Zwolnij bufor tak, aby spływał wzdłuż przewodów i strząśnij nadmiar płynu do rurki. Usuń druty i odwiruj próbkę do osadzania.
Pobrać próbki i ponownie zawiesić osad w PBS przed odwirowaniem. Przez dodatkowe pięć minut po tym należy użyć końcówki pipety na końcu węża ssącego, aby pozostawić około dwóch mililitrów w probówce. Odkurz resztę, nie naruszając pelletu.
Zawiesić osad i równomiernie pipetować próbkę w owalnych obszarach ośmiu uprzednio oznaczonych szkiełek. Umieść szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć godzin, a następnie przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia analizy. Osoba badana powinna przebrać się w jednorazowe spodenki i położyć się na wznak w cichym, ciemnym, klimatyzowanym pomieszczeniu.
Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, ustaw elektrody do badania ultrasonograficznego i nasze urządzenie do pomiaru sztywności tętnic. Następnie umieść mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na obiekcie. Rozpocznij odczyty ciśnienia krwi po 20 minutach, powtarzaj odczyty, aż pomiary znajdą się w odległości pięciu milimetrów od słupa rtęci.
Odpoczynek dwie minuty między każdym odczytem i wykonanie co najmniej trzech. Następnie zbadaj palpacyjnie puls tętnicy ramiennej i umieść sonometr, aby zarejestrować kształty fal ramiennych. Powtórz dla tętnic promieniowych, udowych i szyjnych.
Zmierz odległość do każdego z tych miejsc od wcięcia super mostka za pomocą taśmy mierniczej do tętnic ramiennych, promieniowych i szyjnych oraz niestandardowej linijki do kości udowej. Następnie oblicz prędkość fali tętna tętnicy szyjnej ramiennej, promieniowej i tętnicy szyjnej kości udowej za pomocą specjalistycznego oprogramowania. Umieść mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na przedramieniu tuż dystalnie do procesu reon.
Ustaw oprogramowanie naczyniowe na tryb wyzwalania i zarejestruj co najmniej 10 cykli serca wyjściowej tętnicy ramiennej, obrazy ultrasonograficzne i pomiary prędkości przepływu krwi. W razie potrzeby można użyć ramienia mechanicznego do ustabilizowania sondy ultradźwiękowej. Następnie napompuj mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na przedramieniu do 250 milimetrów słupa rtęci.
I uruchom minutnik. Poinstruuj uczestnika, aby pozostał w bezruchu. Rozpocznij rejestrowanie prędkości, gdy timer wskaże wyzwalacz czterech minut i 45 sekund.
Zwolnij mankiet po pięciu minutach i zmień ultradźwięki, aby rejestrować obrazy w trybie B. Gdy zegar wskaże pięć minut, 10 sekund. Kontynuuj nagrywanie, aż zegar wskaże siedem minut.
Następnie zmierz ciśnienie krwi badanego. Jeśli skurczowe ciśnienie krwi jest większe lub równe 100 milimetrom słupa rtęci, umieść 0,4 miligrama podjęzykowej nitrogliceryny pod językiem pacjenta i rozpocznij odliczanie. Rozpocznij nagrywanie w trybie B, gdy zegar wskaże trzy minuty i zatrzymaj nagrywanie.
Gdy zegar wskazuje osiem minut. Aby przeanalizować barwione komórki śródbłonka, pojedynczy zaślepiony eksperymentator powinien systematycznie skanować szkiełka, komórki śródbłonka są identyfikowane przez pozytywne barwienie kadheryny VE, a integralność jądrowa jest potwierdzana przez pozytywne barwienie dla dapi. Ponadto komórki powinny być barwione pod kątem interesującego nas białka.
Łącznie 30 komórek na slajd powinno zostać zobrazowanych do późniejszej analizy. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka w barwionej partii, w tym szkiełka kontrolnego VE. Oprogramowanie jakościowe służy do analizy intensywności barwienia dla pierwszorzędowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania.
Obraz ten przedstawia wyjściową średnicę tętnicy ramiennej uzyskaną podczas oceny pacjenta z przewlekłą chorobą nerek po zwolnieniu mankietu przez dwie minuty. To nagranie pokazuje zmianę średnicy bramkowaną falą R. Te formy fal uzyskano na każdej z tętnic szyjnych i udowych.
Różnica w czasie i odległości została wykorzystana do obliczenia raportu prędkości fali tętna w aorcie. W tym przypadku komórki kontrolne i pacjentów analizowano pod kątem integralności jądrowej z ekspresją komórek śródbłonka DPI z kadheryną VE oraz dla enzymu utleniającego oksydazy N-A-D-P-H. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o uzyskaniu najwyższej jakości obrazów ultrasonograficznych, kształtów fal i obrazów komórek śródbłonka w celu dokładnej i ilościowej oceny.
Nie zapominaj, że praca z próbkami od ludzi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia funkcję naczyniową u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek poprzez pomiar różnych parametrów fizjologicznych. Kluczowe wskaźniki obejmują rozszerzenie tętnicy ramiennej zależne od przepływu oraz prędkość fali tętna w aorcie, które dostarczają informacji na temat funkcji śródbłonka naczyniowego oraz sztywności naczyń.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zdrowie układu sercowo-naczyniowego
- Przewlekła choroba nerek
Wstęp
- Dysfunkcja naczyniowa jest powszechna w przebiegu przewlekłej choroby nerek.
- Zrozumienie funkcji śródbłonka ma kluczowe znaczenie dla opieki nad pacjentem.
- Pomiar sztywności tętnic pomaga w charakterystyce stanu zdrowia naczyń krwionośnych.
- Techniki obrazowania ultradźwiękowego są niezbędne do przeprowadzenia tych ocen.
Cel badania
- Ocena funkcji śródbłonka naczyniowego u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek.
- Pomiar prędkości fali tętna w aorcie w celu oceny sztywności tętnic.
- Pogłębienie wiedzy na temat ekspresji białek na poziomie komórkowym.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie komórek śródbłonka naczyniowego od pacjentów.
- Ocena prędkości fali tętna w aorcie.
- Pomiar rozszerzenia tętnicy ramiennej zależnego od przepływu.
- Analiza wyników w celu scharakteryzowania funkcji naczyniowej.
Główne wyniki
- Przeprowadzono charakterystykę funkcji śródbłonka naczyniowego.
- Wyniki wykazały zróżnicowanie sztywności tętnic wśród pacjentów.
- Uzyskano informacje na temat zmian w ekspresji białek.
- Metodologia podkreśliła potrzebę przeprowadzenia rozległego szkolenia w zakresie obrazowania ultrasonograficznego.
Wnioski
- Badanie dostarcza podstaw do oceny stanu naczyń krwionośnych w przebiegu przewlekłej choroby nerek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów fizjologicznych dysfunkcji naczyniowej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu dalszego zgłębiania skutków naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dysfunkcja naczyniowa w przewlekłej chorobie nerek stanowi nietradycyjny czynnik ryzyka sercowo-naczyniowego, który wpływa na oceny bezpieczeństwa i skuteczności leków. Pomiar funkcji śródbłonka oraz sztywności tętnic dostarcza mechanistycznych informacji niezbędnych do minimalizacji ryzyka powikłań sercowo-naczyniowych w rozwoju przedklinicznym i klinicznym. Oceny te wspierają walidację celu terapeutycznego poprzez powiązanie szlaków patofizjologicznych z interwencją terapeutyczną w populacjach z CKD.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka jako funkcjonalnego wskaźnika biodostępności tlenku azotu.
- Wartość operacyjna: Możliwość wyjaśnienia szlaków sygnałowych poprzez korelację markerów stresu oksydacyjnego z funkcjonalnymi efektami naczyniowymi.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie selekcji związków z portfolio poprzez identyfikację substancji, które nasilają lub łagodzą dysfunkcję naczyniową w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych układów komórek śródbłonka do późniejszego przesiewu związków z wykorzystaniem standaryzowanych protokołów izolacji i barwienia.
- Wyniki ilościowe: Uzyskanie powtarzalnych pomiarów rozszerzenia naczyniowego zależnego od przepływu oraz prędkości fali tętna do modelowania zależności dawka-odpowiedź.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ustanowienie skalowalnych schematów postępowania w celu oceny funkcji naczyniowej w wielu obszarach terapeutycznych związanych ze zdrowiem śródbłonka.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów z CKD do modelowania ludzkiej patofizjologii naczyniowej i zwiększenia wierności translacyjnej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Powiązanie zmian w ekspresji białek (np. NADPH oksydazy) z funkcjonalnymi efektami naczyniowymi w celu wyjaśnienia mechanizmu działania.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspieranie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną integrację sygnałów bezpieczeństwa naczyniowego w procesie odkrywania leków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje ocenę funkcjonalną naczyń z procesem odkrywania leków, łącząc fenotypy komórkowe z efektami na poziomie tkankowym i wspierając iteracyjne doskonalenie kandydatów terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez powiązanie szlaków stresu oksydacyjnego z funkcją śródbłonka za pomocą mierzalnych zmian w ekspresji białek.
- Przesiew: Dostarcza gotowe do analizy komórki śródbłonka o potwierdzonym stopniu żywotności i ekspresji markerów do zastosowań w badaniach przesiewowych związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe, niezależne odczyty (FMDBA, aPWV), które umożliwiają porównywanie różnych warunków i detekcję sygnałów.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, wykorzystując komórki pochodzenia ludzkiego do modelowania dysfunkcji naczyniowej związanej z CKD.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny ryzyka naczyniowego w ramach programów terapeutycznych dotyczących chorób układu sercowo-naczyniowego, metabolicznych oraz nerek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej pomiędzy celami molekularnymi a fenotypami naczyniowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę funkcji naczyniowych dzięki powtarzalnym procedurom izolacji komórek, obrazowania i analizy.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną identyfikację wad naczyniowych, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile bezpieczeństwa naczyniowego w modelach istotnych dla CKD.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obrazowania naczyniowego metodą USG, izolacji komórek śródbłonka oraz technik immunofluorescencji.
- Zależne od dostępu do urządzeń do pomiaru sztywności tętnic, systemów USG o wysokiej rozdzielczości oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej (zespoły kliniczne, laboratoryjne i obrazowe) w zakresie postępowania z próbkami i spójności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołu przy zastosowaniu go w różnych łożach naczyniowych lub modelach zwierzęcych.
- Ograniczone przez potrzebę intensywnego przeszkolenia w celu uzyskania wiarygodnych obrazów i zapisów falowych, szczególnie w etapach zależnych od badania USG.
