Name: Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj metodę hydrodynamicznego dostarczania genów do przejściowej ekspresji białek u myszy. Technika ta umożliwia wprowadzanie nago DNA z minimalną odpowiedzią zapalną do analizy funkcji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) za początkowe nauczenie nas techniki HGD oraz Dr. Russellowi Thomsonowi (Albert Einstein College of Medicine) za jego ciągłe wskazówki w różnych aspektach technologii. Ta praca została sfinansowana przez Hunter College, fundusze startowe CUNY i nagrodę NSF Bread IOS-1249166. Dziękujemy NYULMC Histopathology Core NYUCI Center Support Grant, NIH/NCI 5 P30CA16087-31 za histologię wątroby myszy.

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Hunter College, City University of New York.
1. Przygotowanie plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn
<ol>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię bakterii zawierającą gen będący przedmiotem zainteresowania w wektorze ekspresji ssaków ze świeżo pokrytej selektywnej płytki z prążkami.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami zawartymi w podręczniku dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn do hodowli i zbierania bakterii.</li>
	<li>Oczyść DNA plazmidu wolnego od endotoksyn z komórek bakteryjnych, postępując zgodnie z protokołem dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn</li>.
	<li>Używaj plastikowych naczyń wolnych od endotoksyn i obchodź się z DNA ostrożnie, aby upewnić się, że endotoksyna nie zostanie ponownie wprowadzona do próbki DNA po etapie usuwania.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn, oznaczając jego absorbancję przy 260 nm za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV, jak opisano poniżej, lub standardowego spektrofotometru kuwetowego.
	<ol>
		<li>Oczyść dolną i górną powierzchnię optyczną systemu zatrzymywania próbek mikrospektrofotometru w następujący sposób. Odpipetować 1 μl czystej wody dejonizowanej na dolny układ optyczny. Zamknij ramię dźwigni i postukaj w nie kilka razy, aby wykąpać górny układ optyczny, a następnie otwórz dźwignię i wytrzyj do czysta chusteczką.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie mikrospektrofotometru i wybierz moduł kwasów nukleinowych.</li>
		<li>Umieść 1 μl czystej wody dejonizowanej na dolnym układzie optycznym, opuść ramię dźwigni i wybierz "Zainicjuj" z oprogramowania programu. Po zakończeniu inicjalizacji wyczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.</li>
		<li>Wykonaj ślepy pomiar, ładując 1 μl wolnego od endotoksyn buforu TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) i wybierając "ślepa" z oprogramowania programu. Po wykonaniu ślepego pomiaru wyczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.</li>
		<li>Wykonaj pomiar próbki, ładując 1 μl próbki DNA wolnej od endotoksyn i wybierając "pomiar" z oprogramowania programu. Zapisz stężenie DNA. Oceń czystość DNA, rejestrując współczynnik absorbancji 260/280 nm, który pojawia się na ekranie. Ponieważ stosowanie czystego DNA (stosunek 260/280 1,8) do HGD jest wysoce pożądane, należy unikać używania próbki DNA o stosunku 260/280 poniżej 1,7. Po wykonaniu pomiaru oczyść obie powierzchnie optyczne chusteczką.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ważenie myszy
<ol>
	<li>Oznacz myszy w sposób odpowiedni dla szczepu. Uwaga: znakowanie ogona nie jest zalecane w tej procedurze.
	<ol>
		<li>Oznacz czarnym markerem gatunki myszy, które mają białe futro (np. szwajcarski Webster) na grzbiecie. W razie potrzeby ponownie zastosuj znaczniki w miarę upływu czasu.</li>
		<li>Oznacz gatunki myszy, które mają czarne futro (np. C57BL/6) poprzez przekłuwanie uszu z kilkudniowym wyprzedzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Waż myszy pojedynczo, delikatnie umieszczając je na szalce lub wiadrze umieszczonym na cyfrowej wadze laboratoryjnej. Zapisz wagę każdej myszy użytej w eksperymencie w dniu eksperymentu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie strzykawek
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej
	<ol>
		<li>Oblicz ilość DNA potrzebną do wstrzyknięcia każdej myszy, zakładając 5 - 50 μg plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn.
		<ol>
			<li>Określ eksperymentalnie optymalną ilość plazmidowego DNA.</li>
			<li>Określając wymaganą ilość DNA, załóżmy wstrzyknięcie jednej dodatkowej myszy na grupę, ponieważ prawidłowe załadowanie strzykawek będzie wymagało dodatkowej mieszanki do wstrzykiwań. Aby ułatwić obliczenia, rozważmy następujący przykład: wstrzyknij 4 myszy eksperymentalne i 4 myszy kontrolne, każda o wadze 25 g, po 50 μg plazmidowego DNA na mysz. Aby określić ilość DNA potrzebną w tym przypadku, oblicz z 5 myszami na grupę: 5 x 50 μg = 250 μg DNA potrzebne dla każdej grupy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określić ilość soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu) potrzebną, przyjmując 10% masy ciała do wstrzyknięcia każdej myszy.
		<ol>
			<li>Zgodnie z powyższym przykładem, wstrzyknij każdej myszy o wadze 25 g 50 μg plazmidowego DNA w 2,5 ml soli fizjologicznej (2,5 g płynu).</li>
			<li>Określając ilość soli fizjologicznej wymaganą dla całej grupy myszy, należy założyć wstrzyknięcie dodatkowej myszy na grupę, aby umożliwić prawidłowe załadowanie strzykawek. Biorąc pod uwagę podane doświadczenie, oblicz ilość soli fizjologicznej potrzebną dla 5 myszy w każdej grupie: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml soli fizjologicznej dla każdej grupy (lub łącznie 25 ml). Uwaga: Jeśli myszy z tej samej grupy nie mają tej samej masy ciała (więcej niż 10% różnicy w masie ciała), należy przygotować mieszanki do wstrzykiwań oddzielnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Używaj bezkonserwantów i endotoksyn, sterylnego roztworu soli fizjologicznej, który został zatwierdzony do stosowania u ludzi, w 10 ml fiolkach wielokrotnego użytku.</li>
		<li>Za pomocą igły o rozmiarze 20 (0,9 mm x 25 mm) przymocowanej do końcówki typu luer-lock strzykawki o pojemności 20 ml, pobrać płyn z fiolek z solą fizjologiczną i opróżnić strzykawki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby pomóc w dokładnym pipetowaniu soli fizjologicznej podczas przygotowywania mieszanin do wstrzykiwań DNA i soli fizjologicznej, należy zebrać więcej soli fizjologicznej niż jest to potrzebne do wstrzyknięcia wszystkim myszom w eksperymencie. W powyższym eksperymencie należy pobrać sól fizjologiczną z 3 fiolek o pojemności 10 ml (łącznie około 30 ml), nawet jeśli obliczona ilość soli fizjologicznej potrzebna do przeprowadzenia eksperymentu wynosi tylko 25 ml.</li>
		<li>Odpipetować obliczoną ilość DNA do innej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Należy uważać, aby nie dotknąć korpusu pipety bokiem probówki, aby uniknąć wprowadzenia endotoksyny. Zgodnie z przykładem, odpipetować 250 μg kontroli i 250 μg eksperymentalnego plazmidowego DNA do oddzielnych stożkowych probówek.</li>
		<li>Dodaj wymaganą ilość soli fizjologicznej do DNA za pomocą pipety serologicznej. Biorąc pod uwagę doświadczenie z próbką, odpipetować 12,5 ml soli fizjologicznej do każdej z mieszanek wzorcowych (eksperymentalnej i kontrolnej).</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy odczekać, aż wszystkie roztwory osiągną temperaturę pokojową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie strzykawek
	<ol>
		<li>Dla każdej myszy napełnij sterylną, 3 ml strzykawkę typu luer-lock mieszanką DNA i soli fizjologicznej za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 20 (0,9 mm x 25 mm). Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Należy unikać używania strzykawek o większej objętości, ponieważ szybkość wtrysku nie może być bardzo dobrze kontrolowana i trudno jest manipulować większymi strzykawkami w jednej ręce. Wyrzuć nadmiar mieszanki DNA i soli fizjologicznej z powrotem do stożkowej probówki, ponieważ może ona zostać ponownie użyta.</li>
		<li>Zmienić igłę na sterylną igłę o rozmiarze 27. Całkowicie napełnić igłę płynem, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. Dostosuj objętość mieszanki DNA i soli fizjologicznej obliczoną na podstawie wagi myszy.</li>
		<li>Nie dopuścić do tego, aby nieosłonięta igła dotykała jakiejkolwiek niesterylnej powierzchni. W razie potrzeby igły można ponownie nakręcić techniką jednoręczną: umieść nasadkę na płaskiej powierzchni, włóż igłę bez trzymania nasadki drugą ręką i dociśnij nakrętkę igłą do twardego przedmiotu, aby przymocować nasadkę do igły. Strzykawki są teraz gotowe do wstrzykiwań do żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hydrodynamiczne dostarczanie DNA
<ol>
	<li>Należy pamiętać, że znieczulenie myszy może zmniejszyć żywotność. Unikaj wykonywania HGD w pomieszczeniu, które jest zbyt zimne, ponieważ zmniejszy to również żywotność. Jeśli w pomieszczeniu panuje temperatura otoczenia 20 °C lub jeśli stosuje się znieczulenie, po zabiegu umieść myszy na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aby uniknąć utraty zwierząt. Jeśli używasz znieczulenia, upewnij się, że usta i pysk myszy są drożne podczas korzystania z poduszki grzewczej i obserwuj mysz, aż w pełni wyzdrowieje. Nie odmawiaj myszom jedzenia ani wody przed HGD.</li>
	<li>Ogrzej myszy, aby rozszerzyły naczynia krwionośne.
	<ol>
		<li>Umieść klatkę na mysz (z dołączoną pościelą) na poduszce grzewczej na 5 minut, tak aby temperatura ściółki wynosiła około 38-39 °C. Temperatura powinna być na tyle niska, aby myszy trzymały się na poduszce grzewczej przez dłuższy czas.</li>
		<li>Alternatywnie, umieść mysz w ograniczniku dostępu grzbietowego z minimalnym ograniczeniem. Ogrzewaj ogon myszy przez 1 minutę, delikatnie przytrzymując go kawałkiem gazy zwilżonej ciepłą wodą. W razie potrzeby zezwól myszy na zmianę położenia. Wytrzyj ogon chusteczką do wyschnięcia.</li>
		<li>Alternatywnie ogrzej mysz, umieszczając klatkę pod lampą grzewczą na nie dłużej niż 2 minuty. Jeśli używasz lampy grzewczej, zachowaj ostrożność, aby uniknąć przegrzania myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja żyły ogonowej o dużej objętości
	<ol>
		<li>Unieruchomić ogranicznik dostępu grzbietowego na płaskiej powierzchni za pomocą taśmy laboratoryjnej.</li>
		<li>Trzymając za ogon, delikatnie umieść mysz w ograniczniku i włóż wtyczkę. Używaj tak mało ograniczeń, jak to konieczne, aby utrzymać ogon unieruchomiony. Upewnij się, że mysz oddycha swobodnie.</li>
		<li>Jeśli mysz znajduje się w poważnym niebezpieczeństwie w dowolnym momencie zabiegu, natychmiast wyjmij mysz z ogranicznika i pozwól jej odpocząć.</li>
		<li>Ustaw mysz tak, aby widoczna była jedna z bocznych żył ogonowych. Zlokalizuj boczne żyły ogonowe, patrząc prosto w dół na tył myszy: czerwona linia biegnąca pośrodku ogona to tętnica, podczas gdy niebieskie linie po obu stronach ogona to boczne żyły ogonowe.</li>
		<li>Dokładnie wytrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
		<li>Używając ręki nieiniekcyjnej, trzymaj mocno ogon między palcem wskazującym i środkowym, tak aby ogon przechodził pod palcem wskazującym, nad środkowym i trzecim palcem oraz pod małym palcem. Pozwól, aby kciuk pozostał swobodny i mógł się poruszać. (Rysunek 1A)</li>
		<li>Drugą ręką przetrzyj ponownie obszar wstrzyknięty wacikiem nasączonym alkoholem. Pozostaw obszar do wyschnięcia.</li>
		<li>Podnieść załadowaną strzykawkę ręką do wstrzykiwania i trzymać ją za cylinder między kciukiem a pozostałymi czterema palcami. Nie trzymać za tłok.</li>
		<li>Ustawić strzykawkę równolegle do ogona, z igłą skierowaną w stronę ciała myszy i skosem (skośną krawędzią) igły skierowaną do góry.</li>
		<li>Wbić igłę do żyły ogonowej. Wstrzyknięcie należy wykonać tylko wtedy, gdy żyła jest prawidłowo zlokalizowana, co jest widoczne po wsunięciu igły bez oporu. Należy pamiętać, że głębokość wkłucia igły jest kwestią osobistych preferencji, jednak pełne wprowadzenie nie jest zalecane ze względu na zwiększone ryzyko ścinania żyły. Unikać przesuwania igły.</li>
		<li>Używając kciuka ręki trzymającej ogon, zamknij piastę igły i dociśnij piastę do ogona, aby utrzymać igłę na miejscu. Nie należy wywierać nadmiernego nacisku i nie chwytać się trzonu igły, ponieważ utrudni to przepływ płynu do żyły. W tym miejscu luźno trzymać ogon palcem wskazującym, aby nie utrudniać wstrzyknięcia (Rysunek 1A).</li>
		<li>Ponownie ustawić rękę trzymającą strzykawkę tak, aby palec wskazujący i środkowy trzymały się kołnierza, a kciuk znajdował się na końcu tłoka (Rysunek 1A).</li>
		<li>Docisnąć tłok jednym, ciągłym ruchem i wstrzyknąć pełną objętość płynu w ciągu 6-8 sekund.</li>
		<li>Usuń igłę z żyły i zatamuj krwawienie, delikatnie uciskając ogon chusteczką.</li>
		<li>Wyjmij mysz z ogranicznika i umieść ją w klatce regeneracyjnej umieszczonej na poduszce grzewczej (ściółka powinna mieć temperaturę 37-38 °C). Jeśli pomieszczenie iniekcyjne jest zimne, ten krok ma kluczowe znaczenie dla przeżycia myszy. Przytrzymaj ogon myszy, aż krwawienie całkowicie ustaje.</li>
		<li>Obserwuj mysz przez 1 godzinę po hydrodynamicznym podaniu DNA. Początkowy okres dyszenia i bezruchu jest normalny z powodu tymczasowej arytmii spowodowanej przez HGD, ale upewnij się, że mysz wykazuje oznaki powrotu do zdrowia w ciągu około 5 minut. Jeśli oddech myszy stanie się nadmiernie płytki, delikatnie masuj brzuch myszy, aby ułatwić oddychanie. Należy pamiętać, że na tempo regeneracji może mieć niewielki wpływ zastosowany szczep myszy.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i upewnij się, że mysz ma obfity zapas jedzenia i wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja do żyły ogonowej o dużej objętości przy użyciu alternatywnej pozycji dłoni
	<ol>
		<li>Umieścić mysz w unieruchomieniu i przygotować się do wstrzyknięcia, wykonując czynności opisane w punktach od 4.3.1 do 4.3.5, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Oprzyj dłoń, której nie wykonuje się iniekcji, na płaskiej powierzchni z czterema palcami zgiętymi pod kątem dziewięćdziesięciu stopni. Palce (wszystkie z wyjątkiem kciuka) powinny spoczywać jeden na drugim, tworząc platformę. Przytrzymaj ogon myszy między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 1B).</li>
		<li>Drugą ręką przetrzyj ponownie obszar wstrzyknięty wacikiem nasączonym alkoholem. Pozostaw obszar do wyschnięcia.</li>
		<li>Chwycić strzykawkę ręką do wstrzykiwania i przytrzymać ją za kołnierz i koniec tłoka, aby była gotowa do wstrzyknięcia.</li>
		<li>Zakończ procedurę, postępując zgodnie z tym protokołem od kroku 4.3.9 do kroku 4.3.17, jak opisano wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+therapeutic-level+hepatic+gene+expression+of+human+factor+IX+after+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo.</a> Mol Ther. 3, 947-957 (2001).</li>
<li>Magin-Lachmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+delivery+of+intact+BAC+DNA+--+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods.</a> J Gene Med. 6, 195-209 (2004).</li>
<li>Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+human+hepatitis+delta+virus+genome+Is+initiated+in+mouse+hepatocytes+following+intravenous+injection+of+naked+DNA+or+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences.</a> J Virol. 75, 3469-3473 (2001).</li>
<li>Giladi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+inhibits+hepatitis+B+virus+replication+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice.</a> Mol Ther. 8, 769-776 (2003).</li>
<li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector-based+in+vivo+RNA+interference%3A+dose-+and+time-dependent+suppression+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).</li>
<li>Layzer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activity+of+nuclease-resistant+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.</a> Rna. 10, 766-771 (2004).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA interference in adult mice.</a> Nature. 418, 38-39 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+hepatitis+C+translational+initiation+in+vitro%2C+in+cultured+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice.</a> Mol Ther. 5, 676-684 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+and+specific+morpholino+antisense+inhibitor+of+hepatitis+C+translation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.</a> Hepatology. 38, 503-508 (2003).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroporation+as+the+mechanism+of+hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery.</a> Gene Ther. 11, 675-682 (2004).</li>
<li>Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+uptake+and+gene+expression+mechanisms+following+intravenous+administration+of+plasmid+DNA+by+conventional+and+hydrodynamics-based+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures.</a> J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+procedure+involves+transient+hyperpermeability+in+the+hepatic+cellular+membrane%3A+implication+of+a+nonspecific+process+in+efficient+intracellular+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.</a> J Gene Med. 6, 584-592 (2004).</li>
<li>Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+and+its+applications+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.</a> Pharm Res. 28, 694-701 (2011).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+principle%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress.</a> Aaps J. 11, 671-681 (2009).</li>
<li>Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+what+we+know+and+what+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: what we know and what is next.</a> Aaps J. 9, (2007).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+hydrodynamic+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery.</a> Gene Ther. 14, 99-107 (2007).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamics-based+procedure+for+controlling+the+pharmacokinetics+of+gene+medicines+at+whole+body%2C+organ+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery.</a> Adv Genet. 54, 65-82 (2005).</li>
<li>Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+delivery+of+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+to+livers+of+mice+by+hydrodynamic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection.</a> Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).</li>
<li>Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-based+in+vivo+monitoring+of+NF-kappaB+activity+through+a+gene+delivery+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach.</a> Cell Commun Signal. 11, (2013).</li>
<li>Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery of DNA.</a> Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).</li>
<li>Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+expression+of+naked+plasmid+DNA+encoding+hepatocyte+growth+factor+in+mice+promotes+liver+and+overall+body+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth.</a> Hepatology. 33, 848-859 (2001).</li>
<li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4, 333-341 (2002).</li>
<li>Hen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+foreign+genes+in+chicks+by+hydrodynamics-based+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Domestic+animal+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo.</a> Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).</li>
<li>Eastman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li>
<li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li>
<li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+Epidemiology+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li>
<li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li>
<li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trypanolytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li>
<li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li>
<li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li>
<li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li>
<li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+lytic+factor%2C+a+subclass+of+high-density+lipoprotein%2C+forms+cation-selective+pores+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li>
<li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li>
<li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li>
<li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li>
<li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li>
<li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przy prawidłowym wykonaniu, HGD jest niezwykle bezpiecznym i skutecznym sposobem dostarczania transgenów. Kluczowymi krokami do udanego HGD są: 1) dostarczenie odpowiedniej ilości DNA w dużej objętości nośnika soli fizjologicznej 2) do żyły ogonowej myszy 3) w czasie krótszym niż 8 sekund.
Chociaż sam proces wstrzykiwania niezaprzeczalnie wymaga pewnej zręczności manualnej, sukces tej sześciosekundowej procedury często leży w starannym przygotowaniu eksperymentu. Ilość pDNA niezbędna do osiągn...

Od czasu pierwszego opisu przez Liu et al. i Zhang et al., hydrodynamiczne dostarczanie genów (HGD) stało się nieocenionym narzędziem do badania funkcji genów w modelach gryzoni 1,2. Technika polega na szybkim wstrzyknięciu (5-7 sekund) dużej objętości (8-12% masy ciała) roztworu do żyły ogonowej myszy w celu ułatwienia wychwytu plazmidowego DNA przez komórki narządów docelowych 1,2. Stany te prowadzą do silnej ekspresji genów w wątrobie i mniejszej ekspresji genów w nerkach, śledzionie, płucach i sercu.
Wstrzyknięcie 10 μg plazmidu pCMV-LacZ może transfekować aż 40% hepatocytów, co czyni HGD najbardziej efektywną, niewirusową, metodą dostarczania genów in vivo do tej pory1. W przeciwieństwie do nosicieli wirusów, pDNA jest łatwe do przygotowania, nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej u gospodarzagryzonia 3 i nie stanowi zagrożenia dla zdrowia poprzez rekombinację z endogennymi wirusami. Ponadto, ponieważ cząsteczki DNA dostarczane przez HGD nie wymagają pakowania, metoda ta nadaje się do dostarczania sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) o wielkości nawet 150 kb4 . Inne rodzaje cząsteczek, które zostały dostarczone metodą hydrodynamiczną, to RNA5-10, morfoliny11, białka12,13 i inne małe cząsteczki12,14. Zalety i wady HGD w porównaniu z innymi metodami podawania zostały omówione w doskonałych recenzjach w literaturze15-20, a wielu autorów przedstawiło szczegółowy opis procedury21-23.
Wprowadzanie transgenów do myszy za pomocą HGD jest bezpieczne i skuteczne1-3,24 i metoda ta była stosowana u szczurów z porównywalnym sukcesem25. Z pewnymi modyfikacjami przeprowadzono eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji na kurczętach26, królikach27 i świniach28, chociaż zastosowanie tej techniki in vivo u większych zwierząt pozostaje wyzwaniem. W przypadku stosowania tej metody, innym powszechnym ograniczeniem jest to, że wielu dostępnym wektorom ekspresji ssaków brakuje składników do osiągnięcia trwałego, wysokiego poziomu ekspresji genów. Przy użyciu plazmidu pCMV-Luc ekspresja genów w narządach docelowych jest widoczna już po dziesięciu minutach od HGD, jednak początkowy, wysoki poziom ekspresji gwałtownie spada w pierwszym tygodniu po wstrzyknięciu1. Długotrwała ekspresja transgenu jest możliwa w zależności od promotora i intronu zastosowanego w konstrukcji plazmidu 3,24, jednak utrzymanie wysokiego poziomu ekspresji genów często wymaga wielokrotnych wstrzyknięć. Z tego powodu HGD może być mniej odpowiedni do badania chorób przewlekłych, które są wynikiem długotrwałego narażenia na szkodliwe białka lub produkty białkowe. Ze względu na te ograniczenia, HGD jest wyjątkowo potężnym narzędziem do badania potencjalnej roli genu i wpływu jego mutantów in vivo, a także efektów terapeutycznych i regulacji białek oraz do ustanawiania zwierzęcych modeli chorób (przegląd, patrz15). Na przykład HGD może być używany do przypisywania funkcji domenom i aminokwasom białek poprzez indywidualne wprowadzanie różnych konstruktów genów do myszy, które mają znokautowane odpowiednie geny. Co więcej, technika ta może być stosowana w każdym szczepie myszy.
Ten protokół opisuje HGD u myszy, koncentrując się na technicznych aspektach niezbędnych do osiągnięcia udanej transfekcji: prawidłowe wprowadzenie igły do żyły, objętość wstrzyknięcia i szybkość dostarczania. Zastosowanie tej metody wykazano na mysim modelu trypanosomatozy afrykańskiej, śmiertelnej choroby ludzi i zwierząt gospodarskich29,30. Podczas gdy kilka gatunków trypanosomów powoduje choroby u zwierząt gospodarskich, większość z nich nie może powodować chorób u ludzi ze względu na wrodzone kompleksy immunologiczne we krwi zwane czynnikami litycznymi trypanosomów (TLF)29,31,32. Te tworzące pory lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) zawierają dwa unikalne, specyficzne dla naczelnych białka: HPR, ligand, który ułatwia wychwyt TLF do trypanosomów, oraz APOL-I, składnik lityczny 31,33-38. Trypanosoma brucei rhodesiense jest zdolny do zakażania ludzi ze względu na ekspresję białka związanego z opornością surowicy (), które wiąże się i neutralizuje ludzki APOL-I 34,39. Pawian TLF nie jest neutralizowany przez ze względu na rozbieżne białko APOL-I40. Jak donoszono wcześniej, przy użyciu wektora ekspresyjnego ssaków (pRG977), transgeniczna ekspresja składników TLF pawiana u myszy zapewnia ochronę przed trypanosomami infekcyjnymi dla ludzi40. Przedstawione tutaj reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób hydrodynamiczne dostarczanie genów może być stosowane do badania efektów terapeutycznych białka.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do przygotowania chusteczek nasączonych alkoholem</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST, probówka stożkowa Amplite Colorimetric</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz ogona myszy</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>igła, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm)</td> <td>Igła 305175</td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm)</td> <td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (wektor ekspresji ssaków)</td> Wymagana <td>umowa o transferze materiału</td> <td>Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira&nbsp;</td><td></td> Strzykawka Fisher <td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>, 3 ml, końcówka Luer-Lok BD</td><td></td><td>309657</td><td>Luer Lock niezbędna do wytrzymania nacisku HGD</td></tr></tbody></table>

przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efektywna ekspresja transgenów in vivo ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji genów i opracowywaniu metod leczenia chorób. W ciągu ostatnich lat hydrodynamiczne dostarczanie genów (HGD) stało się prostą, szybką, bezpieczną i skuteczną metodą dostarczania transgenów gryzoniom. Technika ta opiera się na sile generowanej przez szybkie wstrzyknięcie dużej objętości roztworu fizjologicznego w celu zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych perfundowanych narządów, a tym samym dostarczania DNA do komórek. Jedną z głównych zalet HGD jest możliwość wprowadzania transgenów do komórek ssaków za pomocą nagiego plazmidowego DNA (pDNA). Wprowadzenie egzogennego genu za pomocą plazmidu jest minimalnie pracochłonne, wysoce wydajne i, w przeciwieństwie do nośników wirusa, niezwykle bezpieczne. HGD był początkowo używany do dostarczania genów myszom, obecnie jest używany do dostarczania szerokiej gamy substancji, w tym oligonukleotydów, sztucznych chromosomów, RNA, białek i małych cząsteczek do myszy, szczurów i, w ograniczonym stopniu, innych zwierząt. Protokół ten opisuje HGD u myszy i koncentruje się na trzech kluczowych aspektach metody, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia zabiegu: prawidłowe wprowadzenie igły do żyły, objętość wstrzyknięcia i szybkość podawania. Podano przykłady w celu pokazania zastosowania tej metody do przejściowej ekspresji dwóch genów, które kodują wydzielane, specyficzne dla naczelnych białka, apolipoproteinę L-I (APOL-I) i białko związane z haptoglobiną (HPR).

Prawidłowe umieszczenie igły w żyle ogonowej myszy (jak pokazano na Rysunku 1) jest warunkiem niezbędnym do skutecznego wprowadzenia transgenu za pomocą transfekcji hydrodynamicznej. Często jednak najtrudniejszym elementem tej techniki jest utrzymanie igły w żyle ogonowej bez przemieszczania się, tak aby cała objętość wstrzykiwanego roztworu mogła zostać podana w czasie od 6 do 8 s. Nawet niewielkie błędy podczas procesu iniekcji mogą prowadzić do znacznego obniżenia wydajności transfekcji i ekspresji bi...

Transfekcja in vivo nagiego DNA poprzez hydrodynamiczne dostarczanie genów wprowadza geny do tkanki zwierzęcia z minimalną reakcją zapalną. Generowane są wystarczające ilości produktu genowego, aby można było analizować funkcję i regulację genów, a także strukturę i funkcję białek.

Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przejściowa ekspresja genów u myszy z wykorzystaniem hydrodynamicznego dostarczania genów (HGD). Myszy są ważone, a następnie przygotowuje się i pobiera do strzykawki odpowiednią objętość soli fizjologicznej zawierającej plazmidowe DNA.Następnie ogrzewa się mysz, aby rozszerzyć naczynia krwionośne ogona, i umieszcza ją w stabilizatorze, wykorzystując tętnicę grzbietową. Jako punkt odniesienia lokalizuje się boczne żyły ogonowe, a następnie do jednej z nich wstrzykuje się mieszaninę DNA w soli fizjologicznej. Na koniec mysz wyjmuje się ze stabilizatora i umieszcza na ciepłej macie w celu rekonwalescencji.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące ekspresję transgenu poprzez monitorowanie poziomów białek w krwi za pomocą metody Western blot. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja poprzez transfuzję wirusową, jest to, że hydrodynamiczne dostarczanie genów umożliwia zastosowanie gołego plazmidowego DNA, które jest łatwe do otrzymania, bezpieczne w użyciu i posiada mniejsze ograniczenia dotyczące wielkości. Jestem Daniela Kovacic.Jestem pracownikiem posutdoctoralnym w laboratorium dr Jane Raper i zaprezentuję tę metodę. Rozpocznij procedurę od oznakowania grzbietów białych myszy markerem niezmywalnym, aby wskazać ich grupę eksperymentalną; w razie potrzeby odnawiaj oznaczenia w czasie. W dniu eksperymentu zważ każdą mysz, umieszczając ją w naczyniu lub wiaderku do ważenia zwierząt ustawionym na cyfrowej wadze laboratoryjnej.Zapisz masę każdej myszy zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie. Przygotuj odpowiednią ilość mieszaniny do wstrzyknięcia dla każdej myszy oraz dodatkową porcję dla jednej sztuki, ponieważ prawidłowe napełnienie strzykawek będzie wymagało nadmiaru mieszaniny. Użyj sterylnej soli fizjologicznej wolnej od konserwantów i endotoksyn, zatwierdzonej do stosowania u ludzi.Po doprowadzeniu wszystkich roztworów do temperatury pokojowej, przymocuj sterylną igłę o rozmiarze 20 G do strzykawki z blokadą Luer o pojemności 3 ml i pobierz mieszaninę DNA w soli fizjologicznej x. Przygotuj jedną strzykawkę dla każdego wstrzyknięcia. Należy upewnić się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Należy unikać używania strzykawek o większej objętości, ponieważ nie można wtedy precyzyjnie kontrolować ilości wstrzykiwanego fluorku, a manipulowanie większymi strzykawkami jedną ręką jest utrudnione. Następnie należy zmienić igłę na sterylną o rozmiarze 27G. Odmierzyć objętość mieszaniny DNA w soli fizjologicznej zgodnie z obliczeniami.Wypchnij nadmiar roztworu z powrotem do probówki stożkowej, aby móc go wykorzystać później. Pozwoli to na wypełnienie igły bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Aby chronić igłę przed wstrzyknięciem, nie dopuścić do kontaktu odsłoniętej igły z żadną powierzchnią niesterylną. Nałożyć osłonkę, stosując technikę jednoręczną. Położyć osłonkę na płaskiej powierzchni, a następnie, nie przytrzymując jej drugą ręką, włożyć igłę i docisnąć ją wraz z osłonką do twardego przedmiotu.Aby zabezpieczyć korek, przygotuj wszystkie potrzebne strzykawki w ten sam sposób. Wejdź do pomieszczenia przed rozpoczęciem wstrzykiwania. Umieść klatkę z myszami wraz z ściółką na podkładce grzewczej na pięć minut, tak aby temperatura ściółki wynosiła około 38 do 39 °C.Doprowadzi to do rozszerzenia naczyń krwionośnych myszy. Należy pamiętać, że podczas ogrzewania myszy nie zaleca się stosowania anestezji; należy użyć taśmy laboratoryjnej do unieruchomienia stabilizatora z dostępem grzbietowym na płaskiej powierzchni. Po upływie pięciu minut należy zdjąć nasadkę z zastrzykiwacza, który zostanie użyty do pierwszego wstrzyknięcia myszy.Połóż strzykawkę na nakładce, aby zapobiec dotykaniu odsłoniętej igły nieczystych powierzchni. Służy to zarówno bezpieczeństwu, jak i zachowaniu czystości. Pozostaw odsłoniętą tylko jedną igłę w danej chwili.Następnie chwyć mysz za ogon. Umieść ją delikatnie w ograniczniku i włóż korek. Stosuj minimalne ograniczenie niezbędne do unieruchomienia ogona.Upewnij się, że mysz swobodnie oddycha. Następnie zlokalizuj boczne żyły ogonowe, patrząc bezpośrednio na grzbiet ogona myszy. Czerwona linia biegnąca przez środek ogona to tętnica.Podczas gdy niebieskie linie po obu stronach ogona są bocznymi żyłami ogonowymi, ustaw mysz tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była widoczna. Następnie dokładnie przemyj ogon myszy gazikiem nasączonym alkoholem. Używając ręki niepodającej preparatu, mocno chwyć ogon między palcem wskazującym a środkowym w taki sposób, aby ogon przechodził pod palcem wskazującym, nad środkowym i serdecznym oraz pod małym palcem.Pozostaw kciuk swobodny. Drugą ręką przemyj miejsce wstrzyknięcia gazikiem nasączonym alkoholem. Ponownie poczekaj, aż obszar ten wyschnie.Teraz ręką wykonującą iniekcję chwyć napełnioną strzykawkę, trzymając ją za cylinder kciukiem i pozostałymi czterema palcami. Nie trzymaj tłoka. Ustaw strzykawkę równolegle do ogona, tak aby igła była skierowana w stronę ciała myszy, a ścięcie igły było zwrócone do góry.Wprowadź igłę do żyły ogonowej. Jeśli żyła została prawidłowo zlokalizowana, igła powinna wsunąć się bez oporu. Trzymając igłę stabilnie, użyj kciuka dłoni trzymającej ogon, aby docisnąć nasadkę igły do ogona i utrzymać ją w tej pozycji. Nie wywieraj nadmiernego nacisku i nie trzymaj za trzon igły, ponieważ może to utrudnić przepływ cieczy do żyły.Następnie zmień ułożenie dłoni trzymającej strzykawkę tak, aby palec wskazujący i środkowy opierały się o kołnierz, a kciuk znajdował się na końcu tłoka. Naciśnij tłok jednym płynnym ruchem i wstrzyknij całą objętość płynu w ciągu od sześciu do ośmiu sekund. Wyjmij igłę z żyły i za pomocą chusteczki wywrzyj delikatny nacisk na miejsce wkłucia, aby zatamować krwawienie.Tutaj przedstawiono proces wstrzykiwania w czasie rzeczywistym. Należy pamiętać, że pełne wprowadzenie igły nie jest zalecane ze względu na zwiększone ryzyko przerwania żyły. Po wstrzyknięciu wyjmij mysz z ograniczacza i umieść ją w klatce regeneracyjnej ustawionej na podkładce grzewczej. Jeśli w pomieszczeniu do iniekcji jest zimno, krok ten jest krytyczny dla przeżycia myszy.Przytrzymaj ogon myszy do całkowitego ustąpienia krwawienia. Obserwuj mysz przez jedną godzinę po dostarczeniu DNA drogą hydrodynamiczną.Początkowy okres sapania i unieruchomienia jest normalny, jednak należy upewnić się, że mysz wykazuje oznaki regeneracji. Około pięciu minut po ustąpieniu tych objawów należy umieścić mysz z powrotem w klatce i zapewnić jej obfitą ilość pokarmu oraz wody. Następnie zaprezentujemy iniekcję ogonową przy zastosowaniu alternatywnej pozycji ręki.Ta metoda jest szczególnie użyteczna w sytuacjach, gdy konieczne jest wykonanie wstrzyknięcia bliżej nasady ogona myszy. Przykładowo, podczas korygowania nieudanego wstrzyknięcia w tym samym dniu lub przy podawaniu preparatów myszom z krótszymi ogonami. Przygotuj mysz do wstrzyknięcia i umieść ją w stabilizatorze. Podobnie jak wcześniej, oprzyj dłoń nieużywaną do wstrzykiwania na płaskiej powierzchni z czterema palcami zgiętymi pod kątem 90 stopni, tak aby palce spoczywały jeden na drugim.Tworząc platformę, chwyć ogon myszy między kciukiem a palcem wskazującym. Drugą ręką przemyj miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem. Pozostaw obszar do wyschnięcia.Chwyć strzykawkę iniekcyjną ręką wykonującą zastrzyk i trzymaj ją za kołnierz oraz koniec tłoka, przygotowując do iniekcji. Następnie ustaw strzykawkę równolegle do ogona, tak aby igła była skierowana w stronę ciała myszy, a ścięcie igły znajdowało się u góry. Wykonaj zastrzyk w opisany wcześniej sposób, aby ocenić, czy dodanie znacznika His-tag w określonych miejscach sekwencji zakłóca prawidłowe przetwarzanie i sekrecję APO małpy pawiana.Myszy wstrzyknięto plazmid niosący jeden z trzech baboonich genów APO L1 z różnymi znacznikami histydynowymi oraz drugi plazmid niosący baboonie HPR. Powodzenie wstrzyknięć oceniono za pomocą analizy Western blot poziomu krążącego HPR we krwi myszy dwa dni po iniekcji. Jak tutaj pokazano, baboonie HPR wykazano na wysokim poziomie w osoczu wszystkich, z wyjątkiem jednej z transfekowanych myszy, co wskazuje na powodzenie HGD.Niewielkie spadki poziomów ekspresji, widoczne u jednej z dwóch myszy w przypadku B APO L1: grupa z tagiem His, są zazwyczaj przypisywalne bardzo krótkemu, jednosekundowemu lub dwusekundowemu zmniejszeniu prędkości wstrzykiwania. Tutaj ścieżka 1 próbki osocza wykazuje całkowity brak ekspresji białka. Wskazuje to na niepowodzenie HGD, najprawdopodobniej z powodu niepełnego wstrzyknięcia całej objętości nośnika. Aby ocenić wpływ tagowania His na sekrecję B APO L1, oceniono również ekspresję tagu His, co przedstawiono tutaj.W grupach pierwszej i drugiej odnotowano całkowity brak wykrywalnego białka z tagiem histydynowym. Jedyną grupą myszy, w której w osoczu stwierdzono wykrywalne poziomy białka, była grupa trzecia. Wraz wzięte dane te wskazują, że brak białka z tagiem histydynowym w grupach pierwszej i drugiej jest wynikiem różnic w ekspresji genów lub procesowaniu białka, a nie błędu podczas iniekcji.Podkreślono w niej również znaczenie dołączenia białka śledzącego do mieszaniny wstrzykiwanej w celu monitorowania powodzenia HGD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować myszy oraz strzykawki i jak wprowadzić igłę do żyły ogonowej w celu szybkiego wstrzyknięcia DNA do myszy w celu ekspresji genów poprzez hydrodynamiczne dostarczanie genów. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest utrzymanie igły w odpowiedniej pozycji przez cały czas trwania wstrzykiwania.Prawidłowo wprowadzona igła może wysunąć się z pozycji z powodu przypadkowego ruchu osoby wykonującej wstrzyknięcie lub nieznieczulonej myszy; aby zwiększyć szansę powodzenia, należy tego unikać. Nie wstrzykujemy preparatów myszom o wadze przekraczającej 27 g, ponieważ operowanie strzykawką o pojemności 3 ml jest bardziej trudne.Ustaliliśmy, że najwygodniej jest wykonywać iniekcje u myszy o masie od 23 do 27 g. Żyły myszy o masie poniżej 20 g mogą być zbyt małe, aby przeprowadzić iniekcję.

transient-expression-of-proteins-by-hydrodynamic-gene-delivery-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przejściowa ekspresja białek poprzez hydrodynamiczne wprowadzanie genów u myszy

W tym filmie prezentujemy protokół hydrodynamicznego wstrzykiwania plazmidów do miedniczki nerkowej myszy w celu transfekcji kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia dostarczanie plazmidów specyficznie dla narządu, wykorzystując zasadę wysokiego ciśnienia hydrostatycznego, które z impetem kieruje plazmidy do określonego miejsca, nie powodując uszkodzenia tkanek.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miednicy nerkowej: technika bezpośredniego dostarczania DNA do komórek nerkowych modelu mysiego

Ten film opisuje technikę genetycznej transfekcji in vivo mysich hepatocytów poprzez hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej. Ten system transfekcji generuje długotrwałą ekspresję transgenu w hepatocytach.

Hydrodynamiczne dostarczanie genów: technika transfekcji in vivo egzogennego DNA w mysich hepatocytach poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej

Transgeniczne myszy lub wektory wirusowe zostały użyte do zwiększenia ekspresji białka w płucach. Jednak techniki te są czasochłonne, trudne technicznie i mają niezamierzone skutki, które mogą zakłócić wyniki. Nasz protokół transfekcji białek wykorzystuje odczynnik do transfekcji na bazie lipidów i ultradrobny mikrorozpylacz, aby równomiernie dostarczyć aktywne białko do komórek płuc.

Transfekcja białek płuc myszy

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Poznaj metodę hydrodynamicznego dostarczania genów do przejściowej ekspresji białek u myszy. Technika ta umożliwia wprowadzanie nago DNA z minimalną odpowiedzią zapalną do analizy funkcji genów.

Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

Przeglądaj więcej filmów