Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Ogólnym celem tej procedury jest włączenie genów gag pochodzących od osób zakażonych podtypem CHIV One do kompetentnego replikacji plazmidu HIV one. Aby ocenić wpływ polimorfizmów sekwencji gag na zdolność replikacji wirusa HIV one in vitro, dokonuje się tego najpierw poprzez amplifikację genu gag z osocza pacjenta. Drugim krokiem jest sklonowanie sekwencji gag pochodzącej od pacjenta do kompetentnego zakaźnego klonu molekularnego MJ four.

Następnie plazmid chimery MJ four jest transfekowany w celu wytworzenia zakaźnych zapasów wirusa i określany w celu oceny zakaźności na wskaźnikowej linii komórkowej. Ostatnim krokiem jest pomiar zdolności replikacji in vitro w linii limfocytów T G XR 25. Ostatecznie znakowany radiowo test odwrotnej transkryptazy służy do ilościowego określenia produkcji wirionu w czasie w celu wizualizacji kinetyki replikacji wirusa.

Metoda, którą dzisiaj opiszemy, może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie HIV. Obejmują one zdefiniowanie determinantów dopasowania replikacyjnego HIV i zrozumienie, w jaki sposób dopasowanie HIV wpływa na długoterminową patogenezę. Dzisiaj metody opiszą Jessica Prince i Dan Klaban, dwoje moich doktorantów.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy dokonać odwrotnej transkrypcji CDNA z RNA i amplifikować produkty DNA pierwszej rundy za pomocą odwrotnej transkryptazy i termostabilnej polimerazy DNA w jednoetapowym RT PCR. Następnie, używając jednego mikrolitra amplifikacji PCR w pierwszej rundzie jako matrycy DNA, wykonaj zagnieżdżoną amplifikację PCR w drugiej rundzie. Następnie dodaj trzy mikrolitry pięciokrotnego barwnika ładującego do pięciu mikrolitrów objętości reakcji drugiej rundy.

Uruchom go przy napięciu 120 woltów na 1% aros, żelu TAE zawierającym fluorescencyjne barwienie DNA UV, aż pasma zostaną rozwiązane. Następnie zwizualizuj pasma 1,6 KB na iluminatorze światła niebieskiego. Następnie uruchom pozostałą objętość reakcyjną 45 mikrolitrów na 1% aros, żelu TAE zawierającym barwienie DNA.

Wytnij odpowiednie pasma czystą żyletką i połącz trzy pozytywne reakcje na osobę. Następnie wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą zestawu do oczyszczania żelu i umieść je w wodzie wolnej od nukleaz. Zamroź produkt w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w dalszej części tej procedury.

Po amplifikacji długiego terminala powtórz pięć głównych regionów UTR plazmidu MJ cztery. Zwizualizuj produkty PCR o wielkości 1,3 KB na iluminatorze, wytnij dodatnie amplikony, a następnie oczyść je i zamroź zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie utwórz stopione MJ cztery amplikony gag LTR za pomocą PCR z rozszerzeniem splicingu na zakładkę.

Wizualizacja, wycięcie, oczyszczenie i zamrożenie amplikonu o długości 3,2 kb. Teraz trawić 1,5 mikrograma hiperidu MJ i 1,5 mikrograma oczyszczonego produktu LTR gag PCR z endonukleazą restrykcyjną BCL przez 1,5 godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie dodaj jeden mikrolitr NGOM cztery do reakcji trawienia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie dodaj pięć x barwnika ładującego do reakcji trawienia restrykcyjnego. Powoli elektroforeza całkowitej objętości na 1% aros, żelu TAE zawierającym barwienie DNA przez jedną do dwóch godzin przy napięciu 100 woltów. Wizualizacja, wycięcie i oczyszczenie wskazanych pasm do klonowania, jak opisano wcześniej.

Następnie przygotuj reakcje podwiązania za pomocą oczyszczonego knebla LTR. Wstawić czterowektorowy DNA MJ w stosunku trzy do jednego wstawiania do wektora. Reakcje ligacji inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przekształć JM 1 0 9 chemicznie kompetentne bakterie za pomocą produktów ligacji rozprowadzonych na płytkach ślimakowych LB w ilości 100 mikrogramów na mililitr. Ampicylina hoduje przekształcone bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez co najmniej 22 godziny. Aby potwierdzić wierność klonowania, przetnij mini preparowane DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych NGO M four i HPA one w podwójnym trawieniu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie przeanalizuj go na 1%aros. Żel TAE. Obliczyć objętość wirusa potrzebną z każdego stada na podstawie miana IU na mikrolitr z testu komórkowego TZM BL w celu zakażenia pięć razy 10 do piątej G XR dwóch pięciu komórek przy wielokrotności infekcji 0,05.

Upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej do pracy z wirusem HIV kompetentnym do replikacji, które obejmują pełny fartuch, maskę na twarz i podwójne rękawiczki w dniu zakażenia. Wyjmij zapasy wirusa z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź. Następnie rozcieńczyć wirusa w pożywce C-R-P-M-I do objętości 100 mikrolitrów.

W celu osiągnięcia 0,05 MOI dodaj go do płytki 96-dołkowej poddanej działaniu hodowli tkankowej vbo, w tym zarówno pozytywnej, jak i ujemnej kontroli w każdym zestawie eksperymentów replikacyjnych i ustaw płytkę tak, aby co druga kolumna była ślepa, aby ograniczyć zanieczyszczenie krzyżowe między studzienkami. Następnie policz GXR dwie pięć komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz łączną liczbę komórek potrzebnych do wszystkich infekcji. Porcję wymaganej objętości do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować w celu osadzenia komórek.

Następnie ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić w C-R-P-M-I w stężeniu pięć razy 10 do piątej komórki na 100 mikrolitrów, odpipetować komórki do sterylnego koryta i dokładnie wymieszać. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej rozcieńczonego wirusa i dokładnie wymieszać. Następnie dodaj dwa mikrolitry po pięć miligramów na mililitr roztworu poli mózgu do każdej studzienki i dokładnie wymieszaj komórki.

Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO2 przez trzy godziny w celu przepłukania zainfekowanych komórek. 96-dołkowa płyta dolna V do osadzania komórek. Następnie ostrożnie usuń 150 mikrolitrów pożywki i zastąp świeżymi 150 mikrolitrami C-R-P-M-I, nie naruszając osadu komórkowego.

Powtórz procedurę jeszcze dwa razy, aby wystarczająco umyć komórki po ostatnim odwirowaniu i dodaniu 150 mikrolitrów C-R-P-M-I ponownie zawiesić osad komórek za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj mieszaninę z każdej studzienki do 800 mikrolitrów C-R-P-M-I w studzience z 24-dołkową płytką do hodowli tkankowej. Następnie co dwa dni umieszczać płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z powierzchni dołka hodowli do studzienki z 96 dołkami na dolnej płytce i zamrozić do późniejszej analizy za pomocą testu RT, a następnie dokładnie zawiesić komórki i usunąć połowę pozostałej objętości, aby zapobiec przerostowi komórek. Następnie przywróć pierwotną objętość, dodając 550 mikrolitrów świeżego C-R-P-M-I do każdej studzienki w tej procedurze, dodaj jeden do dwóch mikrolitrów po 10 milikiurów na mililitr DTTP i cztery mikrolitry jednego molowca DIO trzy etol do każdej mililitrowej podwielokrotności naszej głównej mieszanki. Ostrożnie wymieszaj każdą 1,5 mililitra mikroprobówkę wirówkową RT master mix DTT i DTTP za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i przenieś do sterylnego koryta.

Następnie dozuj 25 mikrolitrów oznakowanego RT. Wymieszać z każdym dołkiem 96-dołkowej cienkościennej płytki PCR. Dodać pięć mikrolitrów każdego supernatantu do płytki PCR zawierającej główną mieszankę RT. Następnie uszczelnij płytkę PCR samoprzylepną foliową osłoną i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze po inkubacji, wykonaj małe otwory w foliowej pokrywie za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Wymieszać próbki pięć razy. Przenieść pięć mikrolitrów każdej próbki na papier DE 81 i pozostawić wszystkie próbki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Umieść kleksy w osobnych pojemnikach do mycia.

Następnie umyj plamy pięć razy za pomocą jednego XSSC. Następnie dwa razy z 90% etanolem przez pięć minut na pranie, zanim pozostawisz je do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu ostrożnie zawiń blot w folię Saran i wystaw go na ekran fosfonowy w szczelnie zamkniętej kasecie na noc w temperaturze pokojowej.

Gdy wszystko będzie gotowe, przeanalizuj badania przesiewowe za pomocą skanera fosfologicznego i określ ilościowo radioaktywne transkrypty. Pokazano. Poniżej znajdują się reprezentatywne obrazy żelu przedstawiające elektroforetyczne oddzielanie różnych amplikonów PCR niezbędnych do wygenerowania amplikonu gag pochodzącego od pacjenta, który można sklonować do szkieletu plazmidu MJ four. Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia elektroforetyczne oddzielanie trawień restrykcyjnych w celu klonowania genów gag pacjenta do MJ cztery.

A ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia elektroforetyczne oddzielenie restrykcji trawi oczyszczone DNA plazmidu MJ four chimery. Ten wykres przedstawia odtwarzalność testu replikacji w czasie w linii dwóch pięciu komórek G XR. Te same chimeryczne wirusy MJ zostały użyte do zakażenia G XR dwóch pięciu komórek w dwóch niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w odstępie około roku.

Wyniki replikacji zostały wygenerowane przez obliczenie nachylenia wartości DLU przekształconych logarytmicznie i znormalizowanie tego nachylenia do dzikiego typu MJ cztery. Te dwa niezależne pomiary są silnie skorelowane i podkreślają powtarzalność testów przeprowadzanych w różnym czasie i na komórkach w różnych pasażach. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się AIDS przeciwko HIV do zbadania wirusowych uwarunkowań patogenezy.

W ostrym zakażeniu podtypem C, najbardziej rozpowszechnionym podtypem na świecie. Praca z kompetentnym wirusem HIV może być bardzo niebezpieczna. Wszystkie czynności związane z żywym wirusem powinny być wykonywane w obiekcie BSL two plus.

Wszystkie powierzchnie powinny być regularnie odkażane i przez cały czas należy nosić podwójne rękawice.