Name: Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę klonowania opartą na enzymach restrykcyjnych do oceny zdolności replikacji HIV-1 in vitro. Technika ta pozwala badać wpływ polimorfizmów genu gag na replikację wirusa w liniach komórkowych T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badacze dziękują wszystkim ochotnikom w Zambii, którzy wzięli udział w tym badaniu oraz całemu personelowi Zambia Emory HIV Research Project w Lusace, dzięki któremu to badanie było możliwe. Badacze chcieliby podziękować Jonowi Allenowi, Smicie Chavan i Mackenzie Hurlston za pomoc techniczną i zarządzanie próbkami. Chcielibyśmy również podziękować dr Markowi Brockmanowi za jego dyskusje i hojne przekazanie komórek GXR25.
To badanie zostało sfinansowane przez R01 AI64060 i R37 AI51231 (EH) oraz Międzynarodową Inicjatywę Szczepień przeciwko AIDS. Praca ta była możliwa częściowo dzięki hojnemu wsparciu narodu amerykańskiego za pośrednictwem Agencji Stanów Zjednoczonych ds. Rozwoju Międzynarodowego (USAID). Autorzy badania ponoszą odpowiedzialność za ich treść i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy USAID lub rządu Stanów Zjednoczonych. Prace te były również częściowo wspierane przez Rdzeń Wirusologiczny w Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC i JP były częściowo wspierane przez stypendia Action Cycling Fellowships. Prace te były częściowo wspierane przez grant bazowy Yerkes National Primate Research Center (2P51RR000165-51). Projekt ten został również częściowo sfinansowany przez Narodowe Centrum Zasobów Badawczych P51RR165 i jest obecnie wspierany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej/OD P51OD11132.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na długość i techniczny charakter tego protokołu, istnieje kilka etapów, które mają kluczowe znaczenie zarówno dla pomyślnej budowy chimerycznych plazmidów Gag-MJ4, jak i dla ilościowego określenia zdolności replikacji wirusa. Chociaż strategia klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia obcych genów gag do MJ4 opisana w tym protokole ma wiele zalet w porównaniu z wcześniej stosowanymi metodami opartymi na rekombinacji, protokół może być technicznie trudny, jeśli krytyczne kroki n...

Określenie zarówno cech gospodarza, jak i wirusa, które wpływają na patogenezę HIV-1 i postęp choroby, jest kluczowe dla racjonalnego projektowania szczepionek. Komórkowa odpowiedź immunologiczna jest kluczowym elementem ludzkiej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie HIV-1. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) są niezbędne do wstępnej kontroli ostrej wiremii i umożliwiają gospodarzowi ustalenie stanu ustalonego (wartości zadanej) wiremii1,2. Eksperymentalne zubożenie tych komórek efektorowych powoduje utratę kontroli nad wirusem3,4. Mimo to w genomie wirusa powstają mutacje ucieczki, które podważają rozpoznawanie CTL komórek zakażonych wirusem5-9.
Niektóre allele HLA są związane z niższymi wiremiami i wolniejszym postępem choroby, w tym B*57, B*27 i B*8110-15. Część korzyści ochronnych alleli HLA klasy I można przypisać faktowi, że są one ukierunkowane na funkcjonalnie ograniczone regiony genomu, takie jak Gag, i wybierają mutacje ucieczki, które zmniejszają zdolność wirusa do replikacji in vitro16-21. Chociaż ucieczka z komórkowego układu odpornościowego jest korzystna dla wirusa w kontekście selekcji allelu HLA klasy I, efekt tych mutacji może mieć zróżnicowane konsekwencje dla gospodarza po transmisji na osobę niedopasowaną do HLA22,23. W związku z tym zrozumienie wpływu przenoszonych mutacji ucieczki związanych z HLA na zdolność replikacji wirusa będzie ważne dla pogłębienia naszej wiedzy na temat wczesnej patogenezy HIV-1.
Chociaż poczyniono duży postęp w identyfikowaniu i charakteryzowaniu defektów dopasowania poszczególnych mutacji ucieczki związanych ze specyficznymi allelami HLA klasyI 24-29, naturalnie występujące izolaty HIV-1 mają unikalne i złożone ślady polimorfizmów związanych z HLA, prawdopodobnie wynikających z ciśnienia immunologicznego o różnym podłożu immunogenetycznym za pośrednictwem HLA30. W poprzedniej analizie Goepfert i wsp. wykazały, że akumulacja mutacji związanych z HLA w przekazywanych sekwencjach Gag pochodzących od 88 ostro zakażonych Zambijczyków wiązała się ze zmniejszeniem wartości zadanej wiremii31. Sugeruje to, że przenoszenie szkodliwych mutacji ucieczki, szczególnie w Gag, do biorców niedopasowanych do HLA zapewnia korzyści kliniczne i może być spowodowane osłabioną replikacją wirusa. Idąc dalej, konieczne jest zbadanie, w jaki sposób złożone kombinacje polimorfizmów Gag w naturalnie występujących izolatach współpracują ze sobą w celu zdefiniowania cech przenoszonego wirusa, takich jak zdolność replikacji, oraz jak wczesna replikacja może z kolei wpływać na parametry kliniczne HIV-1 i późną patogenezę.
Brockman i wsp. po raz pierwszy wykazali związek między zdolnością replikacji sekwencji gag-pro wyizolowanych podczas przewlekłej infekcji a wiremią zarówno w podtypie C, jak i B infekcji32-35. Podejście eksperymentalne przedstawione w tych badaniach, chociaż odpowiednie do badania zdolności replikacji in vitro sekwencji pochodzących od osób przewlekle zakażonych, ma kilka technicznych zastrzeżeń i ograniczeń, które utrudniają badanie zdolności replikacyjnych HIV-1 u osób z ostrym zakażeniem podtypem C. Metoda ta opiera się na rekombinacji populacyjnych sekwencji amplifikowanych PCR do podwirusa NL4-3 podtypu B, który pochodził częściowo z LAV, laboratoryjnie zaadaptowanego zapasu wirusa36. Wytwarzanie wirusa osiągnięto poprzez jednoczesną transfekcję linii komórek T37 opartej na CEM z amplikonami PCR i strawionym DNA delta-gag-pro NL4-3. Metoda ta wymaga wzrostu wirusa w okresie od tygodni do miesięcy, co może zniekształcić charakter odzyskanego zasobu wirusa w stosunku do quasi-gatunku wirusa in vivo, a tym samym zmienić pomiar zdolności replikacji in vitro. Metoda ta jest bardziej odpowiednia do badania osób przewlekle zakażonych, gdzie skutecznie selekcjonuje wirusa o najwyższej zdolności replikacji i gdzie klonowanie wielu różnych wariantów wirusa od dużej liczby osób przewlekle zakażonych jest dość pracochłonne, a zatem niewykonalne. Jednak u osoby z ostrym zakażeniem na ogół obecny jest jeden do dwóch wariantów, a zatem wyeliminowanie ryzyka wypaczenia charakteru odzyskanego zasobu wirusa poprzez presję selekcyjną in vitro pozwala na dokładniejszą ocenę zdolności replikacji in vitro. Po drugie, metoda ta wymaga ponownego połączenia sekwencji gag-pro podtypu C w szkielet pochodzący z podtypu B i może wprowadzić do analizy błędy niezgodności kręgosłupa. Ze względu na te ograniczenia, duża liczba sekwencji musi być analizowana w celu przezwyciężenia wszelkich potencjalnych wprowadzonych uprzedzeń.
Tutaj opisujemy alternatywne podejście eksperymentalne odpowiednie do badania sekwencji pochodzących od osób zakażonych podtypem C. Używamy strategii klonowania opartej na enzymach restrykcyjnych, aby wprowadzić gen gag pochodzący z punktów czasowych ostrej infekcji osób zakażonych HIV-1 podtypem C do podtypu C rdzenia prowirusa, MJ4. Wykorzystanie MJ4 jako wspólnego szkieletu, w którym można klonować geny gag, ma kluczowe znaczenie dla analizy sekwencji pochodnych podtypu C. MJ4 pochodzi z pierwotnego izolatu38, a zatem byłoby mniej prawdopodobne, że wprowadzi błąd systematyczny z powodu niezgodności podtypu między genem szkieletowym a genem gag. Ponadto podejście polegające na zastosowaniu klonowania restrykcyjnego opartego na enzymach pozwala na bezpośrednią transfekcję konstruktów prowirusowych do komórek 293T oraz na odzyskanie klonalnego zapasu wirusa identycznego ze sklonowaną sekwencją gag.
Metoda przedstawiona poniżej to metoda o wysokiej przepustowości do oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących z podtypu C. Transfekcja do komórek 293T jest prosta, a powrót do zdrowia wirusa trwa tylko trzy dni. Zdolność replikacji in vitro jest testowana na tej samej linii komórek T opartej na CEM-CCR5, stworzonej przez Brockmana i wsp.37, ale przy użyciu ważnych modyfikacji protokołu niezbędnych do pomyślnej replikacji chimerycznych wirusów MJ4 podtypu C. Zastosowanie odpowiedniej linii limfocytów T, a nie PBMC, pozwala na przetestowanie dużej liczby wirusów chimerycznych MJ4 podtypu C z wysoką powtarzalnością testu. Wreszcie, użycie znakowanego radioaktywnie testu odwrotnej transkryptazy do ilościowego oznaczania wirusa w supernatancie jest bardziej opłacalne niż stosowanie dostępnych na rynku zestawów ELISA p24. Daje również wyższy zakres dynamiki, co było ważne dla wykrywania zarówno słabo, jak i wysoce replikujących się wirusów w ramach tego samego testu oraz dla wykrywania subtelnych różnic w replikacji między izolatami.
Podsumowując, przedstawiona tutaj metoda pozwoliła na dogłębne badanie zdolności replikacji sekwencji gagowych pochodzących od osób zakażonych podtypem C HIV-1 z Zambii i jak napisano, może być również rozszerzona do badania innych populacji zakażonych podtypem C. Zaobserwowano duży stopień zmienności zdolności replikacyjnych między różnymi izolatami Gag. Ponadto udało nam się wykazać statystyczny związek między zdolnością replikacji przenoszonego Gag a nastawą wiremii, a także ze spadkiem CD4 + w okresie trzech lat39. Wyniki te podkreślają znaczenie badania, w jaki sposób przenoszone cechy wirusa, takie jak zdolność replikacji, oddziałują z układem odpornościowym gospodarza, wpływając na patogenezę we wczesnym okresie infekcji i będą stanowić integralną rolę w opracowywaniu skutecznych interwencji szczepionkowych, a także leczenia.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><silne>odczynniki PCR</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Niestandardowy Oligo</td><td>25 nmol, standardowy odsalanie</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowy Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCTCTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Wyprodukowane przez Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 probówek paskowych, niebieskie (płaska nasadka)</td><td></td> Jednoetapowy system RT-PCR <td>Daigger</td> EF3647BX <td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II Polimeraza DNA</td><td>Nukleotyd Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Mix</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, wysoka moc żelu</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb drabinka DNA</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Wyprodukowana przez Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10 000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel i System oczyszczania PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki, jednosieczne</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Wyprodukowane przez Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Odczynniki do klonowania</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne polistyrenowe szalki Petriego 100 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polipropylenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna NgoMIV</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4, 5 U/&mu; l</td><td></td><td></td> Kompetentne komórki Roche 10799009001 <td></td></tr><tr><td>JM109, >108 jtk/&mu; g</td><td>System</td> minipreparacji plazmidu Promega <td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Nadajnik światła niebieskiego</td><td>Wirówka Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 Beckman</td><td>Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Amphyl środek czyszczący/dezynfekujący</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>wyprodukowany przez Promega</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny (polibren)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Costar, 6-dołkowe, płaskie</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 24-dołkowe, płaskie</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 96-dołkowe, okrągłe</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Produkowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Kolby, górna część filtra Corning/skośna szyjka, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Rurki stożkowe, 50 ml, niebieska nakrętka</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Wyprodukowane przez BD Biosciences</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml, niebieska nakrętka</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Wyprodukowane przez BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Wyprodukowane przez Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna/Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS z magnezem i wapniem, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez magnezu i wapnia</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Sarstedt, różne kolory</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Tacki na zbiorniki do Wielokanałowy, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well clear V bottom tissue culture microplate</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Wyprodukowany przez Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Buffer Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Zdefiniowany, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Wyprodukowany przez Promega</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy, klasa II, 25% w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, do biologii molekularnej, 36,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potas trójwodzian heksacyjanożelazianu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III) potasu</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X15-R Beckman</td><td>Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">Odczynniki do oznaczania ilościowego odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8,0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Musi być dostosowany do pH 7,8 za pomocą KOH</td></tr><tr><td>2 M Chlorek potasu (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust do 1 M roztwór</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Kwas poliadenylowy (Poly rA) sól potasowa&nbsp;</td><td>Midland Reagent Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>- SR - Ekran fosforowy o super rozdzielczości, mały</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) Poliwęglan</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>wyprodukowany przez Corning Life</td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa aluminiowa taśma uszczelniająca z mikropłytkami, niesterylna</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Wyprodukowana przez Corning Life</td></tr><tr><td>DE-81 Papier anionowymienny</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta autoradiograficzna</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone storage phoshpor screen</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów hiv-1 podtypu c gag-mj4

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Ochronny wpływ wielu alleli HLA klasy I na patogenezę HIV-1 i postęp choroby jest częściowo przypisywany ich zdolności do celowania w konserwatywne części genomu HIV-1, które z trudem się wydostają. Zmiany sekwencji przypisywane komórkowemu ciśnieniu immunologicznemu pojawiają się w całym genomie podczas infekcji, a jeśli zostaną znalezione w konserwatywnych regionach genomu, takich jak Gag, mogą wpływać na zdolność wirusa do replikacji in vitro. Przenoszenie polimorfizmów związanych z HLA w Gag do niedopasowanych biorców HLA wiąże się ze zmniejszoną wartością zadaną wiremii. Przypuszczaliśmy, że może to być spowodowane zmniejszoną zdolnością replikacji wirusa. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską metodę oceny replikacji in vitro wirusa HIV-1 pod wpływem genu gag wyizolowanego z ostrych punktów czasowych od Zambijczyków zakażonych podtypem C. Metoda ta wykorzystuje klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia genu gag do powszechnego szkieletu prowirusa HIV-1 podtypu C, MJ4. To sprawia, że jest bardziej odpowiedni do badania sekwencji podtypu C niż poprzednie metody oparte na rekombinacji, które oceniały replikację in vitro przewlekle uzyskanych sekwencji gag-pro. Niemniej jednak protokół może być łatwo zmodyfikowany do badań nad wirusami z innych podtypów. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje solidną i powtarzalną metodę oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 na linii komórek T opartej na CEM. Metoda ta została wykorzystana do badania chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących od 149 podtypów C ostro zakażonych Zambijczyków i pozwoliła na identyfikację reszt w Gag, które wpływają na replikację. Co ważniejsze, wdrożenie tej techniki ułatwiło głębsze zrozumienie, w jaki sposób replikacja wirusa definiuje parametry wczesnej patogenezy HIV-1, takie jak wartość zadana wiremii i podłużny spadek limfocytów T CD4+.

Aby prawidłowo przeprowadzić ten protokół, który służy do stworzenia plazmidu prowirusowego zdolnego do montażu w pełni funkcjonalnych, zakaźnych chimer Gag-MJ4, należy zachować szczególną ostrożność podczas generowania odpowiednich amplikonów PCR. Kluczowe jest ustalenie, czy reakcja PCR wygenerowała amplikon gag o właściwej wielkości. Produkty powinny mieścić się w zakresie 100 par zasad (bp) od amplikonu o długości około 1 700 bp przedstawionego na Rysunku 1A. Dokładna długość tego fragmentu ...

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie genów gag pochodzących od osób zakażonych HIV1 podtypu C do replikacyjnie kompetentnego plazmidu HIV1, aby ocenić wpływ polimorfizmów sekwencji gag na zdolność replikacji HIV1 in vitro. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną amplifikację genu gag z osocza pacjenta. Drugim krokiem jest klonowanie sekwencji gag pochodzącej od pacjenta do replikacyjnie kompetentnego zakaźnego klonu molekularnego MJ-four. Następnie plazmid chimeryczny gag-MJ-four jest transfekowany w celu wytworzenia zakaźnych zapasów wirusa, które są następnie mianowane w celu oceny zakaźności na linii komórkowej wskaźnikowej. Ostatnim krokiem jest pomiar zdolności replikacji in vitro w linii komórek T GXR-25. Ostatecznie, w celu wizualizacji kinetyki replikacji wirusa, wykorzystuje się test odwrotnej transkryptazy z użyciem znakowania radiacyjnego do ilościowego określenia produkcji wirionów w czasie.Metoda, którą opiszemy dzisiaj, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie HIV. Obejmują one określenie czynników determinujących sprawność replikacyjną HIV oraz zrozumienie, w jaki sposób sprawność HIV wpływa na długofalową patogenezę. Metody te opiszą Jessica Prince i Dan Claiborne, dwoje moich studentów studiów doktoranckich.Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź odwrotną transkrypcję cDNA z RNA i namnóż produkty pierwszej rundy DNA, wykorzystując odwrotną transkryptazę oraz termostabilną polimerazę DNA w jednostopniowej reakcji RT-PCR. Następnie, wykorzystując jeden µL produktu amplifikacji PCR z pierwszej rundy jako matrycę DNA, przeprowadź drugą rundę amplifikacji PCR metodą nested PCR. Następnie dodaj trzy µL 5X barwnika do ładowania do pięciu µL objętości reakcji z drugiej rundy.Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 120 V na 1% żelu agarozowym w buforze TAE zawierającym fluorescencyjny barwnik do DNA pod wpływem UV, aż do rozdzielenia prążków. Następnie zwizualizuj prążki o wielkości 1,6 KB na iluminatorze światła niebieskiego. Po tym czasie nałóż pozostałą objętość reakcji wynoszącą 45 µL na 1% żel agarozowy TAE zawierający barwnik do DNA. Wytnij odpowiednie prążki za pomocą czystej żyletki i połącz trzy pozytywne reakcje dla każdego osobnika. Następnie wyekstrahuj DNA z wycinka żelu, używając zestawu do oczyszczania żelu, i eluuj je w wodzie wolnej od nukleaz. Zamroź produkt w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. 0:15:56 W tej procedurze, po amplifikacji regionu 5' UTR długiej powtórzonej sekwencji końcowej (LTR) plazmidu MJ-four, zwizualizuj produkty PCR o wielkości 1,3 KB na iluminatorze. Wytnij pozytywne amplikony, a następnie oczyść je i zamroź zgodnie z poprzednim opisem. Następnie wytwórz fuzyjne amplikony MJ-four LTR gag za pomocą PCR z nakładaniem się końców (splice overlap extension PCR). Zwizualizuj, wytnij, oczyść i zamroź amplikon o długości 3,2 kb. Teraz poddaj trawieniu 1,5 µg plazmidu MJ-four oraz 1,5 µg oczyszczonego produktu PCR LTR-gag za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BCL-one przez 1,5 godziny w temperaturze 50 °C. Następnie dodaj 1 µL NGOM-four do reakcji trawienia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po tym dodaj 5x barwnik do nakładania do reakcji trawienia restrykcyjnego. Powoli przeprowadź elektroforezę całej objętości na 1% żelu agarozowym TAE zawierającym barwnik do DNA przez jedną do dwóch godzin przy napięciu 100 V. Zwizualizuj, wytnij i oczyść wskazane prążki do klonowania zgodnie z wcześniejszym opisem.Następnie przygotuj reakcje ligacji, wykorzystując oczyszczony insert LTR-gag oraz wektor DNA MJ-four w stosunku insertu do wektora trzy do jednego. Inkubuj reakcje ligacji przez noc w temperaturze 4°C.Następnie przeprowadź transformację chemicznie kompetentnych bakterii JM-109 produktami ligacji, wysiewając je na płytki z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Hoduj transformowane bakterie w temperaturze 30 °C przez co najmniej 22 godziny. Aby potwierdzić wierność klonowania, poddaj DNA z mini-preparatu podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi NGOM-four i HPA-one w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.Następnie przeprowadź analizę na 1% żelu agarozy TAE. Oblicz objętość wirusa potrzebną z każdego zapasu na podstawie miana IU na mikrolitr z testu na liniach komórkowych TZM-BL, aby zainfekować 5 × 10⁵ komórek GXR-25 przy mnożniku infekcji (MOI) wynoszącym 0,05. Pamiętaj o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas pracy z replikacyjnie kompetentnym HIV, co obejmuje pełny fartuch ochronny, maskę na twarz i podwójne rękawice. W dniu infekcji wyjmij zapasy wirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmroź. Następnie rozcieńcz wirusa w medium C-R-P-M-I do objętości 100 µL, aby uzyskać MOI 0,05. Przenieś go do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V przeznaczonej do hodowli tkankowej, uwzględniając kontrolę pozytywną i negatywną w każdym zestawie eksperymentów replikacyjnych; przygotuj płytkę tak, aby co druga kolumna pozostała pusta w celu ograniczenia kontaminacji krzyżowej między dołkami. Następnie policz komórki GXR-25 za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz całkowitą liczbę komórek potrzebną do wszystkich infekcji. Odmierz wymaganą objętość do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i odwiruj, aby uzyskać pellet komórek. Następnie ostrożnie odessij medium i resuspenderuj w C-R-P-M-I przy stężeniu 5 × 10⁵ komórek na 100 µL. Przenieś komórki pipetą do sterylnego korytka i dokładnie wymieszaj. Następnie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej rozcieńczonego wirusa i dokładnie wymieszaj. Po tym dodaj 2 µL roztworu polybrene o stężeniu 5 mg/mL do każdego dołka i dokładnie wymieszaj komórki. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5% CO2 przez trzy godziny.Aby wypłukać zainfekowane komórki, należy odwirować płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie należy ostrożnie usunąć 150 µL medium i zastąpić je 150 µL świeżego C-R-P-M-I, nie naruszając osadu komórkowego. Procedurę tę powtórz jeszcze dwa razy, aby wystarczająco wypłukać komórki. Po ostatnim wirowaniu i dodaniu 150 µL C-R-P-M-I należy resuspender osad komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej. Przenieś mieszaninę z każdego dołka do 800 µL C-R-P-M-I w dołku płytki hodowlanej 24-dołkowej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Co dwa dni przenoś 100 µL supernatantu z powierzchni dołka hodowlanego do dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U i zamroź go do późniejszej analizy za pomocą testu RT. Następnie dokładnie zresuspender komórki i usuń połowę pozostałej objętości, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi komórek. Po tym kroku przywróć pierwotną objętość, dodając 550 µL świeżego C-R-P-M-I do każdego dołka.W tej procedurze do każdej 1 ml porcji mieszaniny głównej RT należy dodać od 1 do 2 µL DTTP o aktywności 10 mCi/ml oraz 4 µL 1 M DTT. Każdą probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającą mieszaninę główną RT, DTT i DTTP należy starannie wymieszać za pomocą pipety 1000 µL, a następnie przenieść zawartość do sterylnej korytka.Następnie odmież 25 µL znakowanej mieszaniny RT do każdej studni cienkościennej płytki PCR 96-dołkowej. Do płytki PCR zawierającej główną mieszaninę RT dodaj pięć µL każdego nadsączu. Następnie szczelnie zamknij płytkę PCR pokrywą z folii klejącej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Po inkubacji wykonaj niewielkie otwory w folii za pomocą wielokanałowej pipety 200 µL. Wymieszaj próbki pięciokrotnie. Przenieś pięć µL każdej próbki na papier DE-81 i pozostaw wszystkie próbki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Umieść bloty w oddzielnych pojemnikach do przemywania. Następnie przemyj bloty pięciokrotnie roztworem 1X SSC. Potem przemyj je dwukrotnie 90% etanolem przez pięć minut podczas każdego płukania, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu ostrożnie owiń blot folią spożywczą i naświetlaj na ekranie fosforowym w szczelnie zamkniętej kasecie przez noc w temperaturze pokojowej.Po przygotowaniu należy przeanalizować ekrany fosforowe za pomocą obrazownika fosforowego i określić ilość radioaktywnych transkryptów.Przedstawiono. Poniżej znajdują się reprezentatywne obrazy żeli ukazujące elektroforetyczny rozdział różnych amplikonów PCR niezbędnych do wygenerowania pochodnego od pacjenta amplikonu gag, który może zostać sklonowany do szkieletu plazmidu MJ-four. Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia elektroforetyczny rozdział produktów trawienia restrykcyjnego w celu klonowania genów gag pacjentów do MJ four.Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów trawienia restrykcyjnego oczyszczonego plazmidowego DNA chimery gag MJ-four. Wykres ten pokazuje powtarzalność testu replikacji w czasie w linii komórkowej GXR-25. Te same chimeryczne wirusy gag MJ four zostały użyte do zakażenia komórek GXR-25 w dwóch niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w odstępie około jednego roku.Wskaźniki replikacji wyznaczono poprzez obliczenie nachylenia logarytmicznie przekształconych wartości DLU i normalizację tego nachylenia względem typu dzikiego MJ-four. Dwa niezależne pomiary są silnie skorelowane, co podkreśla powtarzalność analiz przeprowadzanych w różnych odstępach czasu i z użyciem komórek o różnych numerach pasażu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się HIV/AIDS do analizy wirusowych determinant patogenezy w ostrej infekcji podtypem C, który jest najpowszechniejszym podtypem na świecie. Praca z replikacyjnie kompetentnym HIV może być niezwykle niebezpieczna. Wszystkie etapy obejmujące pracę z żywym wirusem powinny być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa BSL 2+. Wszystkie powierzchnie powinny być regularnie odkażane, a przez cały czas należy stosować podwójne rękawiczki.

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych do oceny in vitro zdolności replikacji HIV-1 podtypu C chimerycznych wirusów Gag-MJ4

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę klonowania opartą na enzymach restrykcyjnych do oceny zdolności replikacji HIV-1 in vitro. Technika ta pozwala badać wpływ polimorfizmów genu gag na replikację wirusa w liniach komórkowych T.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4 (Wideo) | JoVE Journal

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Przeglądaj więcej filmów