Name: Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę klonowania opartą na enzymach restrykcyjnych do oceny zdolności replikacji HIV-1 in vitro. Technika ta pozwala badać wpływ polimorfizmów genu gag na replikację wirusa w liniach komórkowych T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badacze dziękują wszystkim ochotnikom w Zambii, którzy wzięli udział w tym badaniu oraz całemu personelowi Zambia Emory HIV Research Project w Lusace, dzięki któremu to badanie było możliwe. Badacze chcieliby podziękować Jonowi Allenowi, Smicie Chavan i Mackenzie Hurlston za pomoc techniczną i zarządzanie próbkami. Chcielibyśmy również podziękować dr Markowi Brockmanowi za jego dyskusje i hojne przekazanie komórek GXR25.
To badanie zostało sfinansowane przez R01 AI64060 i R37 AI51231 (EH) oraz Międzynarodową Inicjatywę Szczepień przeciwko AIDS. Praca ta była możliwa częściowo dzięki hojnemu wsparciu narodu amerykańskiego za pośrednictwem Agencji Stanów Zjednoczonych ds. Rozwoju Międzynarodowego (USAID). Autorzy badania ponoszą odpowiedzialność za ich treść i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy USAID lub rządu Stanów Zjednoczonych. Prace te były również częściowo wspierane przez Rdzeń Wirusologiczny w Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC i JP były częściowo wspierane przez stypendia Action Cycling Fellowships. Prace te były częściowo wspierane przez grant bazowy Yerkes National Primate Research Center (2P51RR000165-51). Projekt ten został również częściowo sfinansowany przez Narodowe Centrum Zasobów Badawczych P51RR165 i jest obecnie wspierany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej/OD P51OD11132.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na długość i techniczny charakter tego protokołu, istnieje kilka etapów, które mają kluczowe znaczenie zarówno dla pomyślnej budowy chimerycznych plazmidów Gag-MJ4, jak i dla ilościowego określenia zdolności replikacji wirusa. Chociaż strategia klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia obcych genów gag do MJ4 opisana w tym protokole ma wiele zalet w porównaniu z wcześniej stosowanymi metodami opartymi na rekombinacji, protokół może być technicznie trudny, jeśli krytyczne kroki n...

Określenie zarówno cech gospodarza, jak i wirusa, które wpływają na patogenezę HIV-1 i postęp choroby, jest kluczowe dla racjonalnego projektowania szczepionek. Komórkowa odpowiedź immunologiczna jest kluczowym elementem ludzkiej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie HIV-1. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) są niezbędne do wstępnej kontroli ostrej wiremii i umożliwiają gospodarzowi ustalenie stanu ustalonego (wartości zadanej) wiremii1,2. Eksperymentalne zubożenie tych komórek efektorowych powoduje utratę kontroli nad wirusem3,4. Mimo to w genomie wirusa powstają mutacje ucieczki, które podważają rozpoznawanie CTL komórek zakażonych wirusem5-9.
Niektóre allele HLA są związane z niższymi wiremiami i wolniejszym postępem choroby, w tym B*57, B*27 i B*8110-15. Część korzyści ochronnych alleli HLA klasy I można przypisać faktowi, że są one ukierunkowane na funkcjonalnie ograniczone regiony genomu, takie jak Gag, i wybierają mutacje ucieczki, które zmniejszają zdolność wirusa do replikacji in vitro16-21. Chociaż ucieczka z komórkowego układu odpornościowego jest korzystna dla wirusa w kontekście selekcji allelu HLA klasy I, efekt tych mutacji może mieć zróżnicowane konsekwencje dla gospodarza po transmisji na osobę niedopasowaną do HLA22,23. W związku z tym zrozumienie wpływu przenoszonych mutacji ucieczki związanych z HLA na zdolność replikacji wirusa będzie ważne dla pogłębienia naszej wiedzy na temat wczesnej patogenezy HIV-1.
Chociaż poczyniono duży postęp w identyfikowaniu i charakteryzowaniu defektów dopasowania poszczególnych mutacji ucieczki związanych ze specyficznymi allelami HLA klasyI 24-29, naturalnie występujące izolaty HIV-1 mają unikalne i złożone ślady polimorfizmów związanych z HLA, prawdopodobnie wynikających z ciśnienia immunologicznego o różnym podłożu immunogenetycznym za pośrednictwem HLA30. W poprzedniej analizie Goepfert i wsp. wykazały, że akumulacja mutacji związanych z HLA w przekazywanych sekwencjach Gag pochodzących od 88 ostro zakażonych Zambijczyków wiązała się ze zmniejszeniem wartości zadanej wiremii31. Sugeruje to, że przenoszenie szkodliwych mutacji ucieczki, szczególnie w Gag, do biorców niedopasowanych do HLA zapewnia korzyści kliniczne i może być spowodowane osłabioną replikacją wirusa. Idąc dalej, konieczne jest zbadanie, w jaki sposób złożone kombinacje polimorfizmów Gag w naturalnie występujących izolatach współpracują ze sobą w celu zdefiniowania cech przenoszonego wirusa, takich jak zdolność replikacji, oraz jak wczesna replikacja może z kolei wpływać na parametry kliniczne HIV-1 i późną patogenezę.
Brockman i wsp. po raz pierwszy wykazali związek między zdolnością replikacji sekwencji gag-pro wyizolowanych podczas przewlekłej infekcji a wiremią zarówno w podtypie C, jak i B infekcji32-35. Podejście eksperymentalne przedstawione w tych badaniach, chociaż odpowiednie do badania zdolności replikacji in vitro sekwencji pochodzących od osób przewlekle zakażonych, ma kilka technicznych zastrzeżeń i ograniczeń, które utrudniają badanie zdolności replikacyjnych HIV-1 u osób z ostrym zakażeniem podtypem C. Metoda ta opiera się na rekombinacji populacyjnych sekwencji amplifikowanych PCR do podwirusa NL4-3 podtypu B, który pochodził częściowo z LAV, laboratoryjnie zaadaptowanego zapasu wirusa36. Wytwarzanie wirusa osiągnięto poprzez jednoczesną transfekcję linii komórek T37 opartej na CEM z amplikonami PCR i strawionym DNA delta-gag-pro NL4-3. Metoda ta wymaga wzrostu wirusa w okresie od tygodni do miesięcy, co może zniekształcić charakter odzyskanego zasobu wirusa w stosunku do quasi-gatunku wirusa in vivo, a tym samym zmienić pomiar zdolności replikacji in vitro. Metoda ta jest bardziej odpowiednia do badania osób przewlekle zakażonych, gdzie skutecznie selekcjonuje wirusa o najwyższej zdolności replikacji i gdzie klonowanie wielu różnych wariantów wirusa od dużej liczby osób przewlekle zakażonych jest dość pracochłonne, a zatem niewykonalne. Jednak u osoby z ostrym zakażeniem na ogół obecny jest jeden do dwóch wariantów, a zatem wyeliminowanie ryzyka wypaczenia charakteru odzyskanego zasobu wirusa poprzez presję selekcyjną in vitro pozwala na dokładniejszą ocenę zdolności replikacji in vitro. Po drugie, metoda ta wymaga ponownego połączenia sekwencji gag-pro podtypu C w szkielet pochodzący z podtypu B i może wprowadzić do analizy błędy niezgodności kręgosłupa. Ze względu na te ograniczenia, duża liczba sekwencji musi być analizowana w celu przezwyciężenia wszelkich potencjalnych wprowadzonych uprzedzeń.
Tutaj opisujemy alternatywne podejście eksperymentalne odpowiednie do badania sekwencji pochodzących od osób zakażonych podtypem C. Używamy strategii klonowania opartej na enzymach restrykcyjnych, aby wprowadzić gen gag pochodzący z punktów czasowych ostrej infekcji osób zakażonych HIV-1 podtypem C do podtypu C rdzenia prowirusa, MJ4. Wykorzystanie MJ4 jako wspólnego szkieletu, w którym można klonować geny gag, ma kluczowe znaczenie dla analizy sekwencji pochodnych podtypu C. MJ4 pochodzi z pierwotnego izolatu38, a zatem byłoby mniej prawdopodobne, że wprowadzi błąd systematyczny z powodu niezgodności podtypu między genem szkieletowym a genem gag. Ponadto podejście polegające na zastosowaniu klonowania restrykcyjnego opartego na enzymach pozwala na bezpośrednią transfekcję konstruktów prowirusowych do komórek 293T oraz na odzyskanie klonalnego zapasu wirusa identycznego ze sklonowaną sekwencją gag.
Metoda przedstawiona poniżej to metoda o wysokiej przepustowości do oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących z podtypu C. Transfekcja do komórek 293T jest prosta, a powrót do zdrowia wirusa trwa tylko trzy dni. Zdolność replikacji in vitro jest testowana na tej samej linii komórek T opartej na CEM-CCR5, stworzonej przez Brockmana i wsp.37, ale przy użyciu ważnych modyfikacji protokołu niezbędnych do pomyślnej replikacji chimerycznych wirusów MJ4 podtypu C. Zastosowanie odpowiedniej linii limfocytów T, a nie PBMC, pozwala na przetestowanie dużej liczby wirusów chimerycznych MJ4 podtypu C z wysoką powtarzalnością testu. Wreszcie, użycie znakowanego radioaktywnie testu odwrotnej transkryptazy do ilościowego oznaczania wirusa w supernatancie jest bardziej opłacalne niż stosowanie dostępnych na rynku zestawów ELISA p24. Daje również wyższy zakres dynamiki, co było ważne dla wykrywania zarówno słabo, jak i wysoce replikujących się wirusów w ramach tego samego testu oraz dla wykrywania subtelnych różnic w replikacji między izolatami.
Podsumowując, przedstawiona tutaj metoda pozwoliła na dogłębne badanie zdolności replikacji sekwencji gagowych pochodzących od osób zakażonych podtypem C HIV-1 z Zambii i jak napisano, może być również rozszerzona do badania innych populacji zakażonych podtypem C. Zaobserwowano duży stopień zmienności zdolności replikacyjnych między różnymi izolatami Gag. Ponadto udało nam się wykazać statystyczny związek między zdolnością replikacji przenoszonego Gag a nastawą wiremii, a także ze spadkiem CD4 + w okresie trzech lat39. Wyniki te podkreślają znaczenie badania, w jaki sposób przenoszone cechy wirusa, takie jak zdolność replikacji, oddziałują z układem odpornościowym gospodarza, wpływając na patogenezę we wczesnym okresie infekcji i będą stanowić integralną rolę w opracowywaniu skutecznych interwencji szczepionkowych, a także leczenia.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><silne>odczynniki PCR</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Niestandardowy Oligo</td><td>25 nmol, standardowy odsalanie</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowy Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCTCTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Wyprodukowane przez Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 probówek paskowych, niebieskie (płaska nasadka)</td><td></td> Jednoetapowy system RT-PCR <td>Daigger</td> EF3647BX <td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II Polimeraza DNA</td><td>Nukleotyd Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Mix</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, wysoka moc żelu</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb drabinka DNA</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Wyprodukowana przez Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10 000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel i System oczyszczania PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki, jednosieczne</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Wyprodukowane przez Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Odczynniki do klonowania</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne polistyrenowe szalki Petriego 100 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polipropylenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna NgoMIV</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4, 5 U/&mu; l</td><td></td><td></td> Kompetentne komórki Roche 10799009001 <td></td></tr><tr><td>JM109, >108 jtk/&mu; g</td><td>System</td> minipreparacji plazmidu Promega <td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Nadajnik światła niebieskiego</td><td>Wirówka Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 Beckman</td><td>Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Amphyl środek czyszczący/dezynfekujący</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>wyprodukowany przez Promega</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny (polibren)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Costar, 6-dołkowe, płaskie</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 24-dołkowe, płaskie</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 96-dołkowe, okrągłe</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Produkowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Kolby, górna część filtra Corning/skośna szyjka, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Wyprodukowane przez Corning Life</td></tr><tr><td>Rurki stożkowe, 50 ml, niebieska nakrętka</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Wyprodukowane przez BD Biosciences</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml, niebieska nakrętka</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Wyprodukowane przez BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Wyprodukowane przez Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna/Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS z magnezem i wapniem, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez magnezu i wapnia</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Sarstedt, różne kolory</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Tacki na zbiorniki do Wielokanałowy, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well clear V bottom tissue culture microplate</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Wyprodukowany przez Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Buffer Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Zdefiniowany, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Wyprodukowany przez Promega</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy, klasa II, 25% w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, do biologii molekularnej, 36,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potas trójwodzian heksacyjanożelazianu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III) potasu</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X15-R Beckman</td><td>Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">Odczynniki do oznaczania ilościowego odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8,0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Musi być dostosowany do pH 7,8 za pomocą KOH</td></tr><tr><td>2 M Chlorek potasu (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust do 1 M roztwór</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Kwas poliadenylowy (Poly rA) sól potasowa&nbsp;</td><td>Midland Reagent Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>- SR - Ekran fosforowy o super rozdzielczości, mały</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) Poliwęglan</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>wyprodukowany przez Corning Life</td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa aluminiowa taśma uszczelniająca z mikropłytkami, niesterylna</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Wyprodukowana przez Corning Life</td></tr><tr><td>DE-81 Papier anionowymienny</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta autoradiograficzna</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone storage phoshpor screen</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów hiv-1 podtypu c gag-mj4

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Ochronny wpływ wielu alleli HLA klasy I na patogenezę HIV-1 i postęp choroby jest częściowo przypisywany ich zdolności do celowania w konserwatywne części genomu HIV-1, które z trudem się wydostają. Zmiany sekwencji przypisywane komórkowemu ciśnieniu immunologicznemu pojawiają się w całym genomie podczas infekcji, a jeśli zostaną znalezione w konserwatywnych regionach genomu, takich jak Gag, mogą wpływać na zdolność wirusa do replikacji in vitro. Przenoszenie polimorfizmów związanych z HLA w Gag do niedopasowanych biorców HLA wiąże się ze zmniejszoną wartością zadaną wiremii. Przypuszczaliśmy, że może to być spowodowane zmniejszoną zdolnością replikacji wirusa. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską metodę oceny replikacji in vitro wirusa HIV-1 pod wpływem genu gag wyizolowanego z ostrych punktów czasowych od Zambijczyków zakażonych podtypem C. Metoda ta wykorzystuje klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia genu gag do powszechnego szkieletu prowirusa HIV-1 podtypu C, MJ4. To sprawia, że jest bardziej odpowiedni do badania sekwencji podtypu C niż poprzednie metody oparte na rekombinacji, które oceniały replikację in vitro przewlekle uzyskanych sekwencji gag-pro. Niemniej jednak protokół może być łatwo zmodyfikowany do badań nad wirusami z innych podtypów. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje solidną i powtarzalną metodę oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 na linii komórek T opartej na CEM. Metoda ta została wykorzystana do badania chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących od 149 podtypów C ostro zakażonych Zambijczyków i pozwoliła na identyfikację reszt w Gag, które wpływają na replikację. Co ważniejsze, wdrożenie tej techniki ułatwiło głębsze zrozumienie, w jaki sposób replikacja wirusa definiuje parametry wczesnej patogenezy HIV-1, takie jak wartość zadana wiremii i podłużny spadek limfocytów T CD4+.

Aby prawidłowo przeprowadzić ten protokół, który służy do stworzenia plazmidu prowirusowego zdolnego do montażu w pełni funkcjonalnych, zakaźnych chimer Gag-MJ4, należy zachować szczególną ostrożność podczas generowania odpowiednich amplikonów PCR. Kluczowe jest ustalenie, czy reakcja PCR wygenerowała amplikon gag o właściwej wielkości. Produkty powinny mieścić się w zakresie 100 par zasad (bp) od amplikonu o długości około 1 700 bp przedstawionego na Rysunku 1A. Dokładna długość tego fragmentu ...

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie genów gag pochodzących od osób zakażonych HIV1 podtypu C do replikacyjnie kompetentnego plazmidu HIV1, aby ocenić wpływ polimorfizmów sekwencji gag na zdolność replikacji HIV1 in vitro. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną amplifikację genu gag z osocza pacjenta. Drugim krokiem jest klonowanie sekwencji gag pochodzącej od pacjenta do replikacyjnie kompetentnego zakaźnego klonu molekularnego MJ-four. Następnie plazmid chimeryczny gag-MJ-four jest transfekowany w celu wytworzenia zakaźnych zapasów wirusa, które są następnie mianowane w celu oceny zakaźności na linii komórkowej wskaźnikowej. Ostatnim krokiem jest pomiar zdolności replikacji in vitro w linii komórek T GXR-25. Ostatecznie, w celu wizualizacji kinetyki replikacji wirusa, wykorzystuje się test odwrotnej transkryptazy z użyciem znakowania radiacyjnego do ilościowego określenia produkcji wirionów w czasie.Metoda, którą opiszemy dzisiaj, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie HIV. Obejmują one określenie czynników determinujących sprawność replikacyjną HIV oraz zrozumienie, w jaki sposób sprawność HIV wpływa na długofalową patogenezę. Metod

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych do oceny in vitro zdolności replikacji HIV-1 podtypu C chimerycznych wirusów Gag-MJ4

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Źródło: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy film prezentuje ocenę zdolności replikacyjnej wirusa z wykorzystaniem radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy. Nadnadczynki hodowlane zawierające wiriony potomne dodaje się do mieszaniny odwrotnej transkrypcji zawierającej radioznakowany nukleotyd. Wbudowany sygnał odzwierciedla ilość wytworzonych...

Ocena zdolności replikacyjnej wirusa za pomocą radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Opisana tutaj jest sprawdzona metoda określania stopnia ograniczenia HIV-1 przez komórkowe białko hamujące SAMHD1. Ludzkie komórki linii szpikowej U937 są transdukowane wektorem ekspresyjnym SAMHD1 współwyrażającym YFP, różnicowane, a następnie prowokowane HIV-RFP. Poziom restrykcji określa się za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę klonowania opartą na enzymach restrykcyjnych do oceny zdolności replikacji HIV-1 in vitro. Technika ta pozwala badać wpływ polimorfizmów genu gag na replikację wirusa w liniach komórkowych T.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4 (Wideo) | JoVE Journal

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Przeglądaj więcej filmów