Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie genów gag pochodzących od osób zakażonych HIV1 podtypu C do replikacyjnie kompetentnego plazmidu HIV1, aby ocenić wpływ polimorfizmów sekwencji gag na zdolność replikacji HIV1 in vitro. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną amplifikację genu gag z osocza pacjenta. Drugim krokiem jest klonowanie sekwencji gag pochodzącej od pacjenta do replikacyjnie kompetentnego zakaźnego klonu molekularnego MJ-four. Następnie plazmid chimeryczny gag-MJ-four jest transfekowany w celu wytworzenia zakaźnych zapasów wirusa, które są następnie mianowane w celu oceny zakaźności na linii komórkowej wskaźnikowej. Ostatnim krokiem jest pomiar zdolności replikacji in vitro w linii komórek T GXR-25. Ostatecznie, w celu wizualizacji kinetyki replikacji wirusa, wykorzystuje się test odwrotnej transkryptazy z użyciem znakowania radiacyjnego do ilościowego określenia produkcji wirionów w czasie.

Metoda, którą opiszemy dzisiaj, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie HIV. Obejmują one określenie czynników determinujących sprawność replikacyjną HIV oraz zrozumienie, w jaki sposób sprawność HIV wpływa na długofalową patogenezę. Metody te opiszą Jessica Prince i Dan Claiborne, dwoje moich studentów studiów doktoranckich.

Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź odwrotną transkrypcję cDNA z RNA i namnóż produkty pierwszej rundy DNA, wykorzystując odwrotną transkryptazę oraz termostabilną polimerazę DNA w jednostopniowej reakcji RT-PCR. Następnie, wykorzystując jeden µL produktu amplifikacji PCR z pierwszej rundy jako matrycę DNA, przeprowadź drugą rundę amplifikacji PCR metodą nested PCR. Następnie dodaj trzy µL 5X barwnika do ładowania do pięciu µL objętości reakcji z drugiej rundy.

Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 120 V na 1% żelu agarozowym w buforze TAE zawierającym fluorescencyjny barwnik do DNA pod wpływem UV, aż do rozdzielenia prążków. Następnie zwizualizuj prążki o wielkości 1,6 KB na iluminatorze światła niebieskiego. Po tym czasie nałóż pozostałą objętość reakcji wynoszącą 45 µL na 1% żel agarozowy TAE zawierający barwnik do DNA. Wytnij odpowiednie prążki za pomocą czystej żyletki i połącz trzy pozytywne reakcje dla każdego osobnika. Następnie wyekstrahuj DNA z wycinka żelu, używając zestawu do oczyszczania żelu, i eluuj je w wodzie wolnej od nukleaz. Zamroź produkt w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. 0:15:56 W tej procedurze, po amplifikacji regionu 5' UTR długiej powtórzonej sekwencji końcowej (LTR) plazmidu MJ-four, zwizualizuj produkty PCR o wielkości 1,3 KB na iluminatorze. Wytnij pozytywne amplikony, a następnie oczyść je i zamroź zgodnie z poprzednim opisem. Następnie wytwórz fuzyjne amplikony MJ-four LTR gag za pomocą PCR z nakładaniem się końców (splice overlap extension PCR). Zwizualizuj, wytnij, oczyść i zamroź amplikon o długości 3,2 kb. Teraz poddaj trawieniu 1,5 µg plazmidu MJ-four oraz 1,5 µg oczyszczonego produktu PCR LTR-gag za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BCL-one przez 1,5 godziny w temperaturze 50 °C. Następnie dodaj 1 µL NGOM-four do reakcji trawienia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po tym dodaj 5x barwnik do nakładania do reakcji trawienia restrykcyjnego. Powoli przeprowadź elektroforezę całej objętości na 1% żelu agarozowym TAE zawierającym barwnik do DNA przez jedną do dwóch godzin przy napięciu 100 V. Zwizualizuj, wytnij i oczyść wskazane prążki do klonowania zgodnie z wcześniejszym opisem.

Następnie przygotuj reakcje ligacji, wykorzystując oczyszczony insert LTR-gag oraz wektor DNA MJ-four w stosunku insertu do wektora trzy do jednego. Inkubuj reakcje ligacji przez noc w temperaturze 4°C.

Następnie przeprowadź transformację chemicznie kompetentnych bakterii JM-109 produktami ligacji, wysiewając je na płytki z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Hoduj transformowane bakterie w temperaturze 30 °C przez co najmniej 22 godziny. Aby potwierdzić wierność klonowania, poddaj DNA z mini-preparatu podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi NGOM-four i HPA-one w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.

Następnie przeprowadź analizę na 1% żelu agarozy TAE. Oblicz objętość wirusa potrzebną z każdego zapasu na podstawie miana IU na mikrolitr z testu na liniach komórkowych TZM-BL, aby zainfekować 5 × 10⁵ komórek GXR-25 przy mnożniku infekcji (MOI) wynoszącym 0,05. Pamiętaj o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas pracy z replikacyjnie kompetentnym HIV, co obejmuje pełny fartuch ochronny, maskę na twarz i podwójne rękawice. W dniu infekcji wyjmij zapasy wirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmroź. Następnie rozcieńcz wirusa w medium C-R-P-M-I do objętości 100 µL, aby uzyskać MOI 0,05. Przenieś go do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V przeznaczonej do hodowli tkankowej, uwzględniając kontrolę pozytywną i negatywną w każdym zestawie eksperymentów replikacyjnych; przygotuj płytkę tak, aby co druga kolumna pozostała pusta w celu ograniczenia kontaminacji krzyżowej między dołkami. Następnie policz komórki GXR-25 za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz całkowitą liczbę komórek potrzebną do wszystkich infekcji. Odmierz wymaganą objętość do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i odwiruj, aby uzyskać pellet komórek. Następnie ostrożnie odessij medium i resuspenderuj w C-R-P-M-I przy stężeniu 5 × 10⁵ komórek na 100 µL. Przenieś komórki pipetą do sterylnego korytka i dokładnie wymieszaj. Następnie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej rozcieńczonego wirusa i dokładnie wymieszaj. Po tym dodaj 2 µL roztworu polybrene o stężeniu 5 mg/mL do każdego dołka i dokładnie wymieszaj komórki. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5% CO2 przez trzy godziny.

Aby wypłukać zainfekowane komórki, należy odwirować płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie należy ostrożnie usunąć 150 µL medium i zastąpić je 150 µL świeżego C-R-P-M-I, nie naruszając osadu komórkowego. Procedurę tę powtórz jeszcze dwa razy, aby wystarczająco wypłukać komórki. Po ostatnim wirowaniu i dodaniu 150 µL C-R-P-M-I należy resuspender osad komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej. Przenieś mieszaninę z każdego dołka do 800 µL C-R-P-M-I w dołku płytki hodowlanej 24-dołkowej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Co dwa dni przenoś 100 µL supernatantu z powierzchni dołka hodowlanego do dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U i zamroź go do późniejszej analizy za pomocą testu RT. Następnie dokładnie zresuspender komórki i usuń połowę pozostałej objętości, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi komórek. Po tym kroku przywróć pierwotną objętość, dodając 550 µL świeżego C-R-P-M-I do każdego dołka.

W tej procedurze do każdej 1 ml porcji mieszaniny głównej RT należy dodać od 1 do 2 µL DTTP o aktywności 10 mCi/ml oraz 4 µL 1 M DTT. Każdą probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającą mieszaninę główną RT, DTT i DTTP należy starannie wymieszać za pomocą pipety 1000 µL, a następnie przenieść zawartość do sterylnej korytka.

Następnie odmież 25 µL znakowanej mieszaniny RT do każdej studni cienkościennej płytki PCR 96-dołkowej. Do płytki PCR zawierającej główną mieszaninę RT dodaj pięć µL każdego nadsączu. Następnie szczelnie zamknij płytkę PCR pokrywą z folii klejącej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Po inkubacji wykonaj niewielkie otwory w folii za pomocą wielokanałowej pipety 200 µL. Wymieszaj próbki pięciokrotnie. Przenieś pięć µL każdej próbki na papier DE-81 i pozostaw wszystkie próbki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Umieść bloty w oddzielnych pojemnikach do przemywania. Następnie przemyj bloty pięciokrotnie roztworem 1X SSC. Potem przemyj je dwukrotnie 90% etanolem przez pięć minut podczas każdego płukania, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu ostrożnie owiń blot folią spożywczą i naświetlaj na ekranie fosforowym w szczelnie zamkniętej kasecie przez noc w temperaturze pokojowej.

Po przygotowaniu należy przeanalizować ekrany fosforowe za pomocą obrazownika fosforowego i określić ilość radioaktywnych transkryptów.

Przedstawiono. Poniżej znajdują się reprezentatywne obrazy żeli ukazujące elektroforetyczny rozdział różnych amplikonów PCR niezbędnych do wygenerowania pochodnego od pacjenta amplikonu gag, który może zostać sklonowany do szkieletu plazmidu MJ-four. Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia elektroforetyczny rozdział produktów trawienia restrykcyjnego w celu klonowania genów gag pacjentów do MJ four.

Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów trawienia restrykcyjnego oczyszczonego plazmidowego DNA chimery gag MJ-four. Wykres ten pokazuje powtarzalność testu replikacji w czasie w linii komórkowej GXR-25. Te same chimeryczne wirusy gag MJ four zostały użyte do zakażenia komórek GXR-25 w dwóch niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w odstępie około jednego roku.

Wskaźniki replikacji wyznaczono poprzez obliczenie nachylenia logarytmicznie przekształconych wartości DLU i normalizację tego nachylenia względem typu dzikiego MJ-four. Dwa niezależne pomiary są silnie skorelowane, co podkreśla powtarzalność analiz przeprowadzanych w różnych odstępach czasu i z użyciem komórek o różnych numerach pasażu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się HIV/AIDS do analizy wirusowych determinant patogenezy w ostrej infekcji podtypem C, który jest najpowszechniejszym podtypem na świecie. Praca z replikacyjnie kompetentnym HIV może być niezwykle niebezpieczna. Wszystkie etapy obejmujące pracę z żywym wirusem powinny być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa BSL 2+. Wszystkie powierzchnie powinny być regularnie odkażane, a przez cały czas należy stosować podwójne rękawiczki.