Name: Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj technikę mysiej heterotopowej transplantacji serca obejmującą pobranie narządu od dawcy, anastomozę tętniczą i żylną oraz codzienną ocenę funkcji przeszczepu przez palpację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Biagio za jego wcześniejszą pracę w naszym laboratorium.

Wszystkie zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od patogenów w University of Colorado Barbara Davis Center Animal Facility za zgodą IACUC i były pod opieką zgodnie z wytycznymi NIH.
Głębokość znieczulenia jest początkowo oceniana na podstawie uszczypnięcia palca u nogi i obserwacji częstości oddechów po rozpoczęciu zabiegu.
1. Żniwa z serc dawcy
<ol>
	<li>Znieczulić mysz dawcę, wstrzykując pentobarbital (60 mg/kg IP).</li>
	<li>Unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów i przypnij futro. Przetrzyj skórę alkoholem.</li>
	<li>Po wypreparowaniu skóry otwórz jamę brzuszną, wykonując poprzeczne nacięcie tuż poniżej przepony.</li>
	<li>Przetnij przeponę z tyłu do przyczepu żebrowego i unieś przednią ścianę klatki piersiowej do przodu i górnie, odsłaniając serce.</li>
	<li>Rozciągnij na całej grubości, przetnij tylną boczną jamę piersiową po lewej i prawej stronie klatki piersiowej.</li>
	<li>Wyizoluj żyłę główną dolną (IVC) i umieść luźny jedwabny szew 5-0 wokół IVC w pobliżu jego wprowadzenia do prawego przedsionka.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1,0 ml heparynizowanej soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C (200 u/cm3) do IVC, a następnie podwiązać naczynie jedwabnym szwem 5-0 i podzielić.</li>
	<li>W podobny sposób wyizoluj prawą żyłę główną górną (rSVC) i podwiązaj za pomocą jedwabnego szwu 5-0 i podziel.</li>
	<li>Delikatnie przetoczyć serce w kierunku prawej strony zwierzęcia i odizolować lewą żyłę główną górną (lSVC), podwiązać jedwabnym szwem 5-0 i podzielić, odsłaniając lewą tętnicę płucną.</li>
	<li>Zabezpiecz serce pod mokrą gazą, podczas gdy grasica jest tępo wycięta z dala od głównej tętnicy płucnej (PA) oraz lewej i prawej gałęzi PA oraz wstępującego łuku aorty.</li>
	<li>Tępo wypreparuj łuk aorty z otaczających tkanek. Mikronożyczki służą do podziału aorty proksymalnie do prawej tętnicy ramienno-głowowej; tj. nie powinno być żadnych rozgałęzień między sercem a punktem podziału aorty.</li>
	<li>Ten odcinek łuku aorty tworzy mankiet tętniczy dla procesu implantacji.</li>
	<li>Odbijaj mankiet aorty niżej, aby odsłonić pień PA oraz lewą i prawą gałąź PA.</li>
	<li>Tępo wypreparuj lewą i prawą gałąź PA z dala od otaczających tkanek tak daleko od serca, jak to możliwe. Pozwala to na łatwe wypreparowanie tułowia PA z otaczających tkanek.</li>
	<li>Podziel pień PA tak dystalnie, jak to możliwe, tuż obok jego rozwidlenia. Ten odcinek tętnicy płucnej tworzy mankiet żylny dla procesu implantacji.</li>
	<li>Umieść jedwabny szew 5-0 wokół podstawy serca i zawiąż. Serce jest następnie odcinane u podstawy i umieszczane w roztworze soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C. Całkowity czas zbioru wynosi ok. 10-15 min.</li>
</ol>
2. Technika implantu serca
<ol>
	<li>Znieczulić myszy biorcę pentobarbitalem (dawka początkowa 60 mg/kg IP, w razie potrzeby dawka uzupełniająca 25 mg/kg IP).</li>
	<li>Przytnij futro i unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów, a następnie przygotuj skórę jodonem powidonu i ułóż w sterylny sposób.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej.</li>
	<li>Cofnij jelito wyżej i uzewnętrznione na klatkę piersiową. Przechowywać zawinięte w sterylną wilgotną gazę (sterylną sól fizjologiczną) w całym etui.</li>
	<li>Odizoluj aortę brzuszną i żyłę główną dolną (IVC) poniżej naczyń nerkowych i umieść bawełniane opaski 4-0 wokół aorty i IVC górne, a następnie poniżej miejsca zespolenia.</li>
	<li>Zidentyfikuj wszelkie naczynia lędźwiowe w terenie i podwiązaj za pomocą nylonowego szwu 10-0.</li>
	<li>Zawiąż bawełniane krawaty, najpierw niższe, a następnie lepsze. W ten sposób część krwi zostaje zatrzymana w aorcie, co ułatwia aortomię.</li>
	<li>Uformuj aortomię za pomocą igły 30 G, aby wprowadzić się do światła aorty. Przedłuż nacięcie cienkimi mikronożyczkami na długość około 2 mm. Nacięcie to wykonuje się w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia.</li>
	<li>Wykonaj zespolenie końca do boku aorty dawcy z aortą biorcy w następujący sposób. Umieść nylonowy szew podtrzymujący 10-0 w aorcie dawczej i do dolnego kąta nacięcia w aorcie biorcy i zawiąż. Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w aorcie dawczej i górnym rogu nacięcia w aorcie brzusznej i zawiąż.</li>
	<li>Wykonaj biegnącą linię szwu od górnej do dolnej w bocznej ścianie aorty i przywiąż do wcześniej umieszczonego ściegu podporowego. Pamiętaj, aby zbliżyć błony wewnętrzne (wewnętrzną powierzchnię naczynia) do siebie podczas zszywania. Następnie zszyj przyśrodkową stronę w sposób biegowy i zawiąż. Pierwszy i ostatni ścieg z każdej strony należy umieścić jak najbliżej ściegów podporowych. Następnie staraj się mieć 3 równomiernie rozmieszczone ściegi między tymi dwoma, co daje w sumie 5 ściegów.</li>
	<li>Wykonać zespolenie końcowo-boczne tętnicy płucnej dawcy do biorcy IVC w następujący sposób. Nakłuć IVC igłą 30 G i przedłużyć nacięcie na ok. 2 mm cienkimi mikronożyczkami. Nacięcie to wykonuje się w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia.</li>
	<li>Przywiąż tętnicę płucną dawcy do dolnego rogu nacięcia w IVC nylonem 10-0. Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w tętnicy dawczej i górny róg nacięcia w IVC i zawiąż.</li>
	<li>Wykonaj biegnącą linię szwów między tętnicą płucną a IVC i zawiąż. Pierwszy i ostatni ścieg z każdej strony należy umieścić jak najbliżej ściegów podporowych. Następnie staraj się mieć 5 równomiernie rozmieszczonych ściegów między tymi dwoma, co daje w sumie 7 ściegów.</li>
	<li>Zwolnij dystalną bawełnianą opaskę 4-0, przywracając przepływ żylny.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu hemostazy zespolenia żylnego proksymalny krawat bawełniany 4-0 jest stopniowo rozluźniany, a zespolenie tętnicze obserwowane jest pod kątem hemostazy. Gdy oba zespolenia zostaną uznane za bezpieczne, zdejmij bawełniane opaski z myszy.</li>
	<li>Wróć do jelita brzusznego. Ściana brzucha jest zamknięta w dwóch warstwach za pomocą szwu 5-0 Silk w sposób ciągły.</li>
	<li>Podaj 1,0 ml bolusa sterylnego, ciepłego soli fizjologicznej do jamy brzusznej jako resuscytację płynową po zamknięciu, a po operacji wstrzykuje się podskórnie 0,8 ml soli fizjologicznej. Podczas zabiegu nie są wymagane żadne inne środki wspomagające. Odzyskaj zwierzę na kocu rozgrzewającym. Całkowity czas implantacji wynosi ok. 90-120 min dla początkujących, 45-60 min z doświadczeniem. Podawać analgezję buprenorfiną, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml na początku zabiegu i co 6-12 godzin przez 72 godziny po operacji. </li>
</ol>
3. Ocena przeszczepu
<ol>
	<li>Oceń funkcję przeszczepu codziennie za pomocą badania palpacyjnego przezbrzusznego.</li>
	<li>Trzymaj mysz tak, jakby miała otrzymać zastrzyk dootrzewnowy.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij czubek palca wskazującego do ściany brzucha i upewnij się, jaka jest siła bicia i regularność przeszczepu.</li>
	<li>Przyznaj jakość badania palpacyjnego w skali od 4 (normalna amplituda i częstotliwość) do 0 (odrzucony przeszczep bez bicia).</li>
</ol>
WAŻNE UWAGI:
Wszystkie narzędzia są sterylizowane, sterylne rękawiczki są noszone przez cały czas trwania zabiegu i utrzymywane jest sterylne pole. Operacje dawcy i biorcy wykonywane są przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Upewnij się, że zespolenia są "czyste". Oznacza to, że tylne ściany nie są zaczepiane podczas zakładania szwów. Spowoduje to znaczne zwężenie przepływu, co najprawdopodobniej doprowadzi do nieudanego przeszczepu, a w skrajnych przypadkach do paraliżu kończyn tylnych. Niezwykle ważne jest również, aby uzyskać przejścia pełnej grubości, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną igły do szwu. Odcięcie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia serca.

<ol><li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343 (1973).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3%2C000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon.</a> J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).</li>
<li>Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+vascularized+heterotopic+cardiac+transplantation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse.</a> J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+suture+technique+in+a+mouse+heart+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified suture technique in a mouse heart transplant model.</a> Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).</li>
<li>Mao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+knotless+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice.</a> J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).</li>
<li>Csencsits, K. L., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+alloreactive+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%3A+there%27s+more+to+it+than+MHC+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction.</a> Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).</li>
<li>Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+vascularized+murine+cardiac+transplantation+to+study+graft+arteriopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).</li>
<li>Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+and+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury.</a> Transplant Rev. 23 (1), (2009).</li>
<li>Grazia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cardiac+allograft+rejection+by+directly+cytotoxic+CD4+T+cells%3A+parallel+requirements+for+Fas+and+perforin%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin.</a> Transplantation. 89 (1), 33 (2010).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), (2007).</li>
<li>Plenter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Society+for+Surgical+Research.+45th+Annual+Congress%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> European Society for Surgical Research. 45th Annual Congress. , (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta technika chirurgiczna nie jest łatwa do opanowania, ale po opanowaniu jest potężnym narzędziem badawczym. Badacz/chirurg jest nagradzany za konsekwencję w technice i dbałość o szczegóły. Cierpliwość w fazie uczenia się jest kluczowa. Jak opublikowano przez Niimi3, za pomocą narzędzia do nauki opartego na wideo potrzeba średnio 11 prób, aby osiągnąć pierwszą udaną procedurę i 78 prób, aby osiągnąć 90% wskaźnik sukcesu. Filmy stały się ważnym narzędziem dydaktycznym w chirurgii11,12.
Rozwiązywanie problemów
Może dojść do krwawienia z zespoleń, które jest prawdopodobnie spowodowane albo brakiem prawidłowego napięcia w szwach, albo zbyt małą liczbą szwów. Chociaż środek wywołujący krzepnięcie, taki jak Gelfoam, może być przydatny do zmniejszania przecieków, zalecamy, aby chirurg polegał na dobrej technice. Przekrwienie niebijącego serca jest najczęściej spowodowane zbyt ciasnymi zespoleniami, szczególnie po stronie żylnej. Niebijący, nieperfundowany przeszczep jest często spowodowany przez pęcherzyk powietrza, który przemieścił się do jednej z tętnic wieńcowych. Ważne jest, aby utrzymywać pole od wilgotnego do mokrego, aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków do naczyń.

Ograniczenia techniki
Ta technika nie jest odpowiednia, jeśli badacz chce zbadać wpływ na w pełni funkcjonujące serce. Wymagałoby to zastosowania techniki przeszczepu ortotopowego, która do tej pory okazała się niemożliwa do wykonania.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Jeśli ktoś chce zbadać wpływ na w pełni unaczyniony, lity przeszczep narządów u myszy, to model serca jest prawdopodobnie najłatwiejszy do opanowania. Mysie modele przeszczepu płuc, nerek i wątroby istnieją, ale są znacznie trudniejsze do nauczenia i udoskonalenia.
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Niezwykle ważne jest, aby uzyskać przejścia pełnej grubości, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną igły do szwu. Odcięcie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia serca.
Przede wszystkim powtarzalność, spójność procedury i ciągła dbałość o szczegóły przyniosą wspaniałe wyniki oraz dane, które można finansować i publikować.

W erze, w której możliwe jest przeprowadzanie przeszczepów nerek, płuc, wątroby i trzustki u myszy, kamieniem węgielnym podstawowych badań nad przeszczepami narządów i immunologią od 1973 roku1-4 pozostaje heterotopowy model przeszczepu serca u myszy. W międzyczasie opublikowano kilka artykułów szczegółowo opisujących ulepszenia/udoskonalenia5,6 tej procedury.
Jako model przeszczepu narządów stałych, głównie unaczyniony, procedura ta nie ma sobie równych. Po opanowaniu procedura ta nadaje się do badań nad allogenicznymi reakcjami odrzucenia7, rozwojem przewlekłych waskulopatii8 i mechanizmami uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego9.
Kluczem do pomyślnego nauczenia się tej procedury są, tak jak w przypadku każdej innej operacji, cierpliwość ze strony instruktora i uczestnika oraz dbałość o szczegóły. Na początku procesu nowy chirurg przekona się, że będzie spędzał wiele godzin nad każdym przeszczepem. W miarę zdobywania doświadczenia czas operacji, a tym samym niedokrwienie, drastycznie się skróci. Zwracanie uwagi na szczegóły każdego kroku prędzej czy później doprowadzi do sukcesu.
Podczas gdy instruktor może zrobić wszystko, co w jego mocy, aby przekazać i przewidzieć wszystkie możliwe upadki, które mogą wystąpić podczas tych operacji, "kreatywny" stażysta prawdopodobnie znajdzie kilka własnych!
Podstawy procedury są następujące. Łuk aorty wstępującej dawcy jest zespoleny koniec do boku do aorty brzusznej biorcy, a tętnica płucna dawcy jest zespolena koniec z żyłą główną dolną biorcy (IVC). Krew przepływa z aorty biorczej w sposób wsteczny przez aortę dawczą do tętnic wieńcowych. Po przepłynięciu przez układ wieńcowy krew spływa do prawego przedsionka przez zatokę wieńcową, jest pompowana do prawej komory, a następnie przez tętnicę płucną do biorcy IVC. W ten sposób układ wieńcowy jest zaopatrywany w krew tętniczą, a rytm zatokowy wraca do przeszczepu w ciągu 1-2 minut od reperfuzji. Ponieważ lewe komory serca są zasadniczo obciążone ciśnieniem, wolna ściana lewej komory z czasem zaniknie.

<table><tbody><tr><td><silny>Instrument</silny></td><td><silny>Roboz #</td><td>Fine Science Tools #</td><td>Arosurgical #</td></tr><tr><td>Prosty kleszcz do mikropreparacji #5</td><td>RS-5015</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony kleszcz do mikropreparacji #7</td><td>RS-5047</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony ząbkowany kleszcz</td><td>RS-5137</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji Vannas, krótkie</td><td>RS-5610</td><td></td><td>09.140.08</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, proste, ostre, długie</td><td></td><td>11.602.11</td><td></td></tr><tr>Uchwyt <td></td><td></td><td>igły z mikrouchwytem sprężynowym</td><td>11.549.15</td></tr><tr>Kleszczyk <td></td><td>do komarów prosty</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, proste,</td><td>RS-5962</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, zakrzywione,</td><td>RS-5981</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikro zwijacz</td><td>RS-6540</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taca na instrumenty, 10" x 6 i frac12; &rdquo; x & frac34; "</td><td>RT-1350S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szew jedwabny, 5/0, szpula 22,5 m</td><td>18020-50</td><td></td>10/0 nylon T4A10Q07 5/0 jedwabne rękawiczki E19A05N Biogel od Medex Supply Drapes Precept, #64-9012-9 Strzykawki BD 1 cm3 insuliny, #329424 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory bawełniane</td><td></td><td>marki Fisher, #23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Waciki powidonowo-jodowe</td><td>PDI, #B40600</td><td></td>4/0 Krawaty bawełniane Bawełna domowa autoklawizowana z narzędziami <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

Minęło już ponad czterdzieści lat od czasu, gdy ta technika została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego, Wynna i Russella. Chociaż zajęło kilka lat, aby inne laboratoria stały się biegłe w tej technice i wykorzystywały ją, obecnie jest ona szeroko stosowana przez wiele laboratoriów na całym świecie. Znaczące udoskonalenie oryginalnej techniki zostało opracowane i zgłoszone w 2001 roku przez Niimi. Opisane są tutaj techniki, które ewoluowały przez ponad dekadę w rękach trzech chirurgów (Plenter, Grazia,) w naszym centrum. Techniki te są obecnie przekazywane młodszemu pokoleniu chirurgów i badaczy.
Opierając się głównie na doświadczeniach z Niimi, stosowane procedury ewoluowały w najdrobniejszych szczegółach - szczegółach, które postaramy się tutaj opisać w taki sposób, aby inni mogli korzystać z tego bardzo użytecznego modelu. Podobnie jak Niimi, odkryliśmy, że pomoc wideo do nauki jest bezcennym źródłem informacji dla początkujących.

Wykorzystanie tej techniki chirurgicznej otwiera drogę do prowadzenia zarówno prostych badań nad przeżyciem lub odrzuceniem przeszczepu, jak i bardzo złożonych protokołów eksperymentalnych. W badaniu krótko opisanym na poniższej rycinie staraliśmy się określić udział, o ile występuje, Fas i/lub perforyny jako mechanizmów odrzucenia serca pośredniczonego przez limfocyty T CD4. Stało się to możliwe dzięki niezwykłemu zestawowi szczepów myszy dostępnych obecnie w badaniach. Wyniki wykazują, że bezpośrednie odrzucenie alloprzeszczepów serca przez efektorowe limfocyty T CD4 wymaga alternatywnego wkładu ekspresji Fas w przeszczepie oraz ekspresji perforyny w limfocytach T. Według naszej wiedzy jest to pierwsze wykazanie, że aktywność cytolityczna limfocytów T CD4 może odgrywać niezbędną rolę w pierwotnym ostrym odrzuceniu alloprzeszczepu in vivo.
<img alt="Wykres przeżycia Kaplana-Meiera; % przeżycia allograftu w stosunku do dni po transferze limfocytów T CD4; badanie immunologiczne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51511/51511fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51511/51511fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Perforyna i Fas stanowią obligatoryjne i równoległe ścieżki odrzucania serca pośredniczonego przez limfocyty T CD4 Limfocyty T CD4 od myszy B6, B6 PFPKO (knock-out perforyny) oraz B6gld (z niedoborem liganda Fas) zostały wykorzystane do rekonstytucji biorców B6rag-/- z allograftami serca C3H typu dzikiego lub C3Hlpr z niedoborem Fas. Usunięcie samego Fas (♦, p=NS w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6) z serc dawcy lub usunięcie samej perforyny z limfocytów T CD4 (■, p=NS w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6) nie zniosło odrzucania. Co ciekawe, usunięcie FasL z efektorowych limfocytów T CD4 znacząco opóźniło odrzucanie (●, p &lt; 0,02 w porównaniu z Wt C3H + limfocyty T CD4 B6, p &lt; 0,01 w porównaniu z Wt C3H + limfocyty T CD4 B6 PFPKO oraz p &lt; 0,01 w porównaniu z C3Hlpr + limfocyty T CD4 B6). Jednak większość allograftów nadal została odrzucona (4 z 5). Co istotne, jednoczesne usunięcie zarówno Fas dawcy, jak i perforyny z limfocytów T CD4 całkowicie zniosło odrzucanie (○, p &lt; 0,002 w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6, Wt C3H + limfocyty T CD4 B6 PFPKO oraz C3Hlpr + limfocyty T CD4 B6). Zniesienie to było znacznie silniejsze niż w przypadku indywidualnego usunięcia FasL z limfocytów T CD4 (○, p &lt; 0,003 w porównaniu z kontrolą Wt C3H + limfocyty T CD4 B6gld). Z Grazia et al10. Przedrukowano za zgodą.

W manuskrypcie opisano kroki wymagane do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu serca u myszy.

Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie oraz ocena stanu zdrowotnego heterotopowego przeszczepu serca u myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw staranne pobranie serca od dawcy. W drugim kroku chirurgicznie przygotowuje się miejsce graftu u biorcy, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do implantacji tkanki dawcy.Następnie przeszczepia się serce dawcy poprzez utworzenie anastomozy tętniczej i żylnej. W ostatnim kroku weryfikuje się hemostazę w liniach szwów naczyniowych przed zamknięciem otworu w organizmie biorcy. Ostatecznie stan zdrowia przeszczepu można monitorować poprzez codzienną palpację, aby ocenić wpływ różnych czynników na przeżywalność przeszczepionego narządu.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy anastomozy są trudne do opanowania. Napięcie szwów musi być odpowiednio dobrane, aby uniknąć przecieków oraz zwężenia przepływu krwi. Aby pobrać serce dawcy, należy najpierw unieruchomić znieczulone zwierzę dawcy za pomocą czteropunktowych więzów.Po ścięciu futra przemyć skórę alkoholem. Po odwarstwieniu skóry wykonać nacięcie poprzeczne bezpośrednio poniżej przepony. Aby otworzyć jamę brzuszną, przeciąć przeponę za przyczepem żebrowym.Wykonaj nacięcie pełnej grubości ścianki, otwierając tylną boczną część jam klatki piersiowej po lewej i prawej stronie, wyizoluj żyłę główną dolną (IVC), a następnie załóż luźny szew z nici jedwabnej 5-0 wokół IVC w miejscu przylegającym do jej ujścia do prawego przedsionka. Wstrzyknij 1 cc soli fizjologicznej z heparyną o temperaturze 4 °C do IVC, podwiąż naczynie szwem jedwabnym 5-0 i przetnij je.Następnie po podwiązaniu i zaszyciu prawej żyły głównej górnej w podobny sposób, delikatnie obróć serce w stronę prawą zwierzęcia, a następnie wyizoluj i podwiąż lewą żyłę główną górną, odsłaniając lewą tętnicę płucną. Teraz zabezpiecz serce pod wilgotną gazą i tępym narzędziem oddziel grasicę od głównej tętnicy płucnej, lewej i prawej odnogi tętnicy płucnej oraz łuku aorty wstępującej. Tępym narzędziem uwolnij łuk aorty z otaczających go tkanek, a następnie za pomocą mikronozycycy przetnij aortę proksymalnie względem prawej tętnicy ramienno-głownej, aż między sercem a punktem przecięcia aorty nie pozostaną żadne odnogi.Ten odcinek łuku aorty tworzy mankiet tętniczy dla procesu implantacji. Następnie odchylić mankiet aorty w dół, aby odsłonić pień tętnicy płucnej oraz lewą i prawą gałąź tętnicy płucnej. Następnie poprzez tępe rozczepianie oddzielić lewą i prawą gałąź tętnicy płucnej od otaczających tkanek, prowadząc rozczepianie jak najdalej od serca.Przetnij pień tętnicy płucnej tak dystalnie, jak to możliwe, bezpośrednio proksymalnie w stosunku do miejsca jej rozwidlenia, aby utworzyć mankiet żylny niezbędny do procesu implantacji. Następnie zawiąż szew jedwabny 5-0 u podstawy serca. Odetnij serce u podstawy i przenieś wyciętą tkankę do soli fizjologicznej w temperaturze 4°C.Całkowity czas pobrania wynosi około 10 do 15 minut do momentu wszczepienia serca dawcy. Po znieczuleniu i unieruchomieniu zwierzęcia biorcy, przemyj skórę jodynem powidonowym, płucząc pomiędzy zabiegami alkoholem lub sterylną wodą. Powtórz tę czynność trzy razy, a następnie w sposób sterylny obłóż pole operacyjne.Następnie rozpocznij procedurę od wykonania dwucentymetrowego pionowego nacięcia w linii środkowej brzucha. Aby dostać się do jamy brzusznej, odsuń jelita w górę i wyłóż tkankę na klatkę piersiową, owijając ją w sterylną gazę zwilżoną sterylną solą fizjologiczną. Następnie wyizoluj aortę brzuszną i żyłę główną dolną poniżej naczyń nerkowych i załóż cztery szwy z nici bawełnianej o rozmiarze 0 wokół tkanki, najpierw powyżej, a następnie poniżej miejsca anastomozy.Zidentyfikuj wszelkie naczynia lędźwiowe w polu widzenia i podwiąż je nicią nylonową 10 T. Przeszyj, a następnie zawiąż dolną wiązkę bawełnianą, a potem górną, aby zatrzymać część krwi w aorcie, co ułatwi wykonanie autotomii tętnicy A. Po zabezpieczeniu węzłów wprowadź igłę 30 G do światła aorty.Następnie za pomocą precyzyjnych mikronożyczek należy wydłużyć nacięcie do długości około dwóch milimetrów w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia. Teraz należy umieścić szew nylonowy 10-0. Zastosuj szew stabilizujący w aorcie dawcy oraz w dolnym kącie nacięcia w aorcie biorcy, aby wykonać anastomozę koniec-bok aorty dawcy z aortą biorcy.Po zawiązaniu szwu, umieść drugi nylon 10 T naprzeciwko pierwszego w aorcie dawcy, w górnym rogu nacięcia oraz w aorcie brzusznej, a następnie również zawiąż ten szew. Po umieszczeniu drugiego szwu, wykonaj szew ciągły od strony górnej do dolnej na bocznej ścianie aorty, dbając o to, aby zbliżyć błonę wewnętrzą i zawiązać szew przy wcześniej założonym szwie stabilizującym. Następnie zaszyj stronę przyśrodkową szwem ciągłym i zawiąż go, umieszczając pierwszy i ostatni ścieg po każdej stronie jak najbliżej szwów stabilizujących.Należy dążyć do wykonania trzech równomiernie rozmieszczonych szwów pomiędzy tymi dwoma, tak aby łącznie uzyskać pięć szwów. Następnie, aby wykonać anastomozę typu koniec-bok tętnicy płucnej dawcy do żyły głównej dolnej (IVC) biorcy, najpierw nakłuć IVC igłą 30G, a następnie za pomocą precyzyjnych mikronożyczek wydłużyć nacięcie o około dwa milimetry w linii prostej wzdłuż osi podłużnej naczynia. Następnie przywiązać tętnicę płucną dawcy do dolnego rogu nacięcia w IVC za pomocą nylonowej nici 10-0.Umieść drugą nici nylonową 10-0 naprzeciwko pierwszej w tętnicy donora oraz w górnym rogu nacięcia w brzusznej części żyły głównej dolnej (IVC) i zawiąż. Następnie wykonaj szew ciągły między tętnicą płucną a IVC i go zawiąż, umieszczając pierwszy i ostatni ścieg po każdej stronie jak najbliżej szwów stabilizujących. Należy dążyć do wykonania pięciu równomiernie rozmieszczonych ściegów pomiędzy nimi, co daje łącznie siedem ściegów.Następnie poluzuj dystalną czwartą wiązkę bawełnianą OTT, przywracając przepływ żylny. Po upewnieniu się, że w miejscu anastomozy żylnej wystąpiła hemostaza, stopniowo poluzuj proksymalną czwartą wiązkę bawełnianą OTT i sprawdź hemostazę w miejscu anastomozy tętniczej. Gdy obie anastomozy zostaną uznane za szczelne, usuń wiązki bawełniane z myszy, wprowadź jelito z powrotem do jamy brzusznej i użyj jedwabiu 5-0 do zamknięcia ściany brzusznej w dwóch warstwach.W sposób ciągły podaj do jamy brzusznej bolus 1 mL sterylnej, ciepłej soli fizjologicznej w celu nawodnienia podczas zamykania rany, a następnie wstrzyknij podskórnie 0,8 mL soli fizjologicznej. Na koniec, aby ocenić funkcję przeszczepu poprzez codzienną palpację transabdominalną, unieruchom mysz w sposób analogiczny do podawania iniekcji dosytniej. Następnie delikatnie przyciśnij opuszkę palca wskazującego do ściany brzusznej, aby ocenić siłę i regularność skurczów przeszczepu.Przypisz jakości palpacji ocenę od czterech dla prawidłowej amplitudy i częstotliwości do zera dla niebijącego, odrzuconego przeszczepu. Ta technika chirurgiczna ułatwia zarówno proste badania przeżywalności przeszczepów, jak i złożone protokoły eksperymentalne. Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie badano udział fas i/lub perforyny jako mechanizmów odrzucania serca zapośredniczonego przez limfocyty T CD4+.Wyniki wykazują, że bezpośrednie odrzucenie allograftów serca przez efektorowe limfocyty T CD4+ wymaga alternatywnego wkładu ekspresji graftu oraz ekspresji perranu przez limfocyty T, co wskazuje po raz pierwszy, że aktywność cytolityczna limfocytów T CD4+ może odgrywać niezbędną rolę w pierwotnym ostrym odrzuceniu allograftu in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak umieścić szwy w anastomozy, aby uzyskać zdrowy, bijący przeszczep serca.

murine-heterotopic-heart-transplant-technique

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Technika heterotopowego przeszczepu serca u myszy

Model heterotopowego przeszczepienia serca u myszy został uznany przez wielu badaczy za istotną metodę badania mechanizmów odrzutu i odpowiedzi immunologicznej. Jednak techniki z nią związane wciąż stanowią wyzwanie. Dzięki modyfikacji standardowych metod z sukcesem przeprowadziliśmy ponad 1000 przeszczepów.

Heterotopowe przeszczepienie serca u myszy

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Technika jest demonstrowana dla procedury mikrochirurgicznej do heterotopowego przeszczepu serca u myszy, w tym uproszczone metody pobierania dawców i zespolenia naczyń biorców.

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

Technika mankietowa skraca i ułatwia model heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, unikając technicznie trudnych zespoleń szwów w małych naczyniach. Szczegóły techniczne przedstawione w tym artykule wideo powinny pozwolić naukowcom na ustalenie tego modelu w swoich laboratoriach.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

Wprowadzamy podejście z rurką wewnętrzną do techniki mankietu do heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, aby pomóc w przeprowadzeniu naczynia nad mankietem. Odkryliśmy, że współpraca dwóch doświadczonych chirurgów znacznie skraca czas operacji.

Optymalizacja techniki mankietowej do przeszczepu serca u myszy

Pokazano nowatorską technikę rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej.

Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Niniejszy artykuł opisuje zmodyfikowaną technikę heterotopowego przeszczepu unaczynionego serca z zaktualizowaną techniką aseptyczną, analgezją i znieczuleniem.

Zmodyfikowany protokół przeszczepu serca heterotopowego u myszy zgodny ze współczesnymi standardami techniki aseptycznej, anestezjologii i analgezji

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Poznaj technikę mysiej heterotopowej transplantacji serca obejmującą pobranie narządu od dawcy, anastomozę tętniczą i żylną oraz codzienną ocenę funkcji przeszczepu przez palpację.

Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

Przeglądaj więcej filmów