Utrzymanie i hodowla rybek zebrafish

Właściwa pielęgnacja jest niezbędna dla sukcesu eksperymentów przeprowadzanych na danio prążkowanym. Optymalna jakość wody sprzyja zdrowiu ryb i powtarzalności doświadczeń. Ponadto produkcja ikry u danio prążkowanego jest w dużym stopniu zależna od odpowiedniego żywienia. W tym filmie opisano sposób utrzymywania i karmienia ryb w laboratorium, wskazano wskazówki dotyczące obchodzenia się z nimi i zarządzania stadami oraz przedstawiono sposób manipulowania środowiskiem danio prążkowanego w eksperymentach biologicznych.

Zacznijmy od omówienia podstaw dotyczących siedliska ryb.

Dziki zebrafish pochodzi ze słodkich wód Himalajów. W tym klimacie ryby spędzają większość dnia w wolno płynących zbiornikach ze słodką wodą.

W jaki sposób odtworzyć ten raj w laboratorium? Zacznijmy od najważniejszego elementu: wody. Choć może się wydawać, że słodką wodę łatwo uzyskać, woda z kranu jest toksyczna dla zebrafish ze względu na zawartość chloru i potencjalne zanieczyszczenia. Dlatego woda do akwariów musi przejść przez system oczyszczania, taki jak jednostka do odwróconej osmozy. Następnie do oczyszczonej wody dodaje się sole i bufory pH, aby zoptymalizować zasolenie i pH.

Aby zmaksymalizować wydajność eksperymentalną, wiele ryb utrzymuje się w ograniczonej ilości wody. Przy tak dużej liczbie pływających ryb odpady gromadzą się szybko, co sprawia, że wymiana wody jest niezbędna. Potrzeba ta generuje wysokie zapotrzebowanie na wodę, dlatego w zapleczach rybnych stosuje się systemy recyrkulacji, aby zminimalizować zużycie wody. Brudna woda jest filtrowana i sterylizowana za pomocą naświetlania UV przed powrotem do systemu.

Zebrafish utrzymuje się w specjalistycznych zbiornikach, które są dostępne w wielu rozmiarach. Zbiorniki są przykryte, aby ograniczyć parowanie i zapobiec ucieczce ryb. Aby umożliwić integrację zbiornika z systemem, w pokrywie znajdują się otwory, przez które stale wpływa czysta woda. Poziom wody pozostaje stabilny dzięki otworowi przelewowemu z tyłu zbiornika, który jest osłonięty przegrodą z małymi otworami, pozwalającymi na wypływ brudnej wody, ale nie ryb.

Pomimo wymiany wody, w zbiornikach mogą nadal gromadzić się glony i odpady stałe, dlatego muszą być one regularnie czyszczone.

Kontrola środowiskowa w zapleczach rybnych jest również niezwykle ważna. Temperaturę utrzymuje się w okolicach 28 °C lub 80 °F. Aby zachować rytm dobowy zwierząt, oświetlenie jest sterowane w cyklu 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.

Po omówieniu warunków utrzymania danio pręgowanych, przejdźmy do kwestii ich diety.

W swoim naturalnym środowisku danio pręgowane żywią się głównie zooplanktonem i owadami. Dietę tę odtwarza się w laboratorium, stosując kombinację karmy suchej i małych organizmów. Larwy i młodzieńce rozwijają się dzięki żywym mikroorganizmom, takim jak paramecje, natomiast ryby dorosłe są często karmione dostępnymi w handlu proszkami oraz małymi skorupiakami znanymi jako artemia.

Organizmy te są szczególnie odpowiednie do hodowli laboratoryjnej, ponieważ ich jaja można przechowywać w formie uśpionych cyst w temperaturze pokojowej. Aby przygotować artemię do podania, usuwa się twarde zewnętrzne skorupki poprzez traktowanie ich wybielaczem. Następnie odskorupione jaja są dokładnie płukane. Jaja przenosi się potem do napowietrzanej kolumny, aby umożliwić ich rozwój w wodzie słonej przez około jeden dzień. Na koniec wyklute artemie zbiera się i płucze w sitku o drobnych oczkach, a następnie przelewa do butelek w celu karmienia. Ryby są zazwyczaj karmione 2 - 3 razy dziennie, naprzemiennie pokarmem żywym i suchym, a podczas tego procesu wyłącza się przepływ wody, aby pokarm nie odpłynął przed zjedzeniem.

Po zapoznaniu się ze sposobami utrzymywania i karmienia ryb, nadszedł czas, aby nauczyć się, jak pracować z zasobami ryb i jak nimi zarządzać.

Laboratoria rybne pomieszczają wiele różnych typów danio pręgowanych, od szczepów typu dzikiego po ryby, których genomy zostały zmodyfikowane za pomocą mutacji punktowych lub wprowadzonych transgenów. Aby utrzymać kontrolę nad wszystkimi tymi rybami, zwierzęta o podobnym tle genetycznym są trzymane razem w oznakowanych zbiornikach. Etykiety zbiorników powinny zawierać szczegółowe informacje identyfikacyjne, w tym genotyp ryb oraz datę ich urodzenia.

Płodność danio pręgowanych zaczyna spadać po pierwszym roku życia, dlatego zasoby powinny być uzupełniane corocznie. Danio pręgowane nie przeżywają dobrze jako w pełni inbredowane linie, dlatego różnorodność genetyczną należy utrzymywać poprzez zbieranie potomstwa z krzyżówek niespokrewnionych ryb, tzw. „outcrossów”.

Podczas przeprowadzania outcrossów linii transgenicznych lub mutantów, potomstwo posiadające pożądaną modyfikację genetyczną musi zostać zidentyfikowane na podstawie ekspresji fluoroforu lub genotypowania. Aby przeprowadzić genotypowanie, najpierw uśpić ryby w tricainie. Następnie odciąć niewielki fragment płetwy ogonowej jako źródło DNA.

Na koniec wyizolować DNA z próbki ogona i wykorzystać je do analizy PCR w celu zidentyfikowania specyficznych sekwencji. Oczekując na wyniki, każdą rybę należy trzymać w osobnym małym zbiorniku z odpowiednią etykietą identyfikacyjną.

Po omówieniu standardowych warunków hodowli ryb, przyjrzyjmy się sposobom, w jakie standardy te są modyfikowane w celu badania procesów biologicznych.

Temperatura wody w systemie może mieć głęboki wpływ na zdrowie danio przebrany. Aby stworzyć model cukrzycy, badacze poddają ryby działaniu toksyny trzustkowej, streptozotocyny, i utrzymują je w zbiornikach o obniżonej temperaturze wody. Ryby z cukrzycą wykazują oczekiwane fenotypy, takie jak uszkodzenia nerek i oczu, a także ograniczoną regenerację płetwy ogonowej, co pozwala na badanie biologii cukrzycy.

Systemy zbiornikowe mogą być również modyfikowane w konkretnych celach eksperymentalnych. Badania zachowań pływackich ryb mogą służyć jako wskaźnik lęku, agresji lub zachowań społecznych. W tym przypadku wykorzystuje się śledzenie wideo do analizy różnic w zachowaniu pływackim między rybami nieleczonymi a tymi, które otrzymały lek neuroaktywny. Badania tego typu przyczyniają się do poszerzenia wiedzy z zakresu neuronauk i mogą stanowić narzędzie w procesie odkrywania nowych leków.

Zmienione warunki oświetlenia również mogą wpływać na danio przebrany. Intensywna ekspozycja na światło może zostać wykorzystana nawet do ablacji komórek światłoczułych siatkówki. Ryby te posiadają zdolność do naprawy uszkodzonej tkanki siatkówki poprzez proliferację komórek, co jest przedmiotem dużego zainteresowania naukowców badających degenerację siatkówki u ludzi.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE dotyczący utrzymania i hodowli danio pręgowanych. Omówiliśmy kluczowe zasady dotyczące zakwaterowania, karmienia i zarządzania rybami w warunkach laboratoryjnych. Dziękujemy za uwagę!