Fenotypowanie behawioralne modeli chorób myszy za pomocą Zintegrowanej Stacji Behawioralnej (INBEST)

Ogólnym celem tej metodologii jest poprawa odtwarzalności i standaryzacji fenotypowania behawioralnego i myszy eksperymentalnych poprzez ciągłe monitorowanie podstawowych wskaźników behawioralnych w znanym środowisku. Ten modułowy system składa się ze zdigitalizowanego, skomputeryzowanego koła do biegania z siatką wspinaczkową, zautomatyzowanego dozownika żywności, dwóch TER sterowanych fotokomórkami, sterowanego komputerowo bodźca świetlnego i schronienia, komponentów innych firm i technologii podczerwieni MPEG four zintegrowanej ze śledzeniem wideo i nagrywaniem zdarzeń Pakiety oprogramowania są połączone w celu stworzenia ośmiu aren, co pozwala na jednoczesne monitorowanie czterech zwierząt doświadczalnych i czterech kontrolnych. Opóźnienia, częstotliwości i czasy trwania określonych zachowań są analizowane za pomocą oprogramowania MED PC four.

Natomiast aktywność lokomotoryczna i topografia ścieżek ruchu są oceniane za pomocą oprogramowania ETH ovision XT 8.5 przy użyciu kompleksowej analizy statystycznej. Dane były często przetwarzane w celu ujawnienia zmian behawioralnych wywołanych progresją choroby w różnych modelach mysich. Złożona i wrażliwa natura zachowania często sprawia, że wiarygodne pomiary u przewlekle chorych myszy są bardzo trudne.

Korzystanie z nowych technologii, które pozwalają na dokładną, bezstronną analizę behawioralną. Opisujemy autorski system monitorowania o nazwie Inves lub Zintegrowana stacja behawioralna. Aparatura ta została zaprojektowana w celu zapewnienia długotrwałych pomiarów podstawowych wyników funkcjonalnych, takich jak spontaniczna aktywność, spożycie pokarmu i wody, reaktywność emocjonalna, zmotywowane zachowanie, a wszystko to w środowisku o niskim poziomie stresu przypominającym dom.

Główne zalety inwestowania w porównaniu z pojedynczymi testami behawioralnymi to ciągłe monitorowanie, zmniejszenie stresu związanego z transportem i szybkie gromadzenie wielu zestawów danych, które są natychmiast wprowadzane do bezstronnej analizy komputerowej. Chociaż ciągłe monitorowanie jest często mylące w tradycyjnych badaniach, ważne jest, aby pamiętać, że niektóre domeny zachowania, takie jak funkcje neurologiczne i uczenie się przestrzenne, nie mogą być badane w środowisku klatki domowej, co wymaga dodatkowych testów Aby zakończyć ocenę profilu behawioralnego, Jeden do dwóch tygodni przed rozpoczęciem eksperymentu, Zacznij przyzwyczajać myszy do cyklu od 12 do 12 od jasnego do ciemnego. Myszy są najbardziej aktywne w nocy.

Ustaw ramy czasowe ciemnego cyklu tak, aby były równoległe do godzin pracy eksperymentatora. Wszystkie inne czynniki środowiskowe, takie jak temperatura i wentylacja, powinny pozostać stałe w tym okresie. W celu trwałej identyfikacji numerycznej należy wytatuować myszy na ogonie przez pięć do siedmiu dni przed badaniem.

Regularnie zajmuj się myszami do dwóch godzin dziennie, przyzwyczajając je w ten sposób do pomiaru stresu i rejestruj temperaturę ciała w odbycie oraz notuj ich ogólny wygląd. Wyklucz myszy z badania, które wykazują poważne nieprawidłowości, takie jak niskie spożycie pokarmu lub wody, utrata masy ciała, zgarbiona postawa, potargane lub poplamione wodogłowie sierści lub wydzielina porfiryny z okolic oczu. Ponadto w tym czasie można przeprowadzić szeroką gamę testów behawioralnych, takich jak otwarte pole, co pozwala na bardziej kompleksowe zrozumienie deficytów wydajności.

W przypadku przedłużonego badania behawioralnego dozownik żywności powinien mieć pełny zapas granulek mysich karmy. Każdy o wadze 20 miligramów. Jedną butelkę należy zawsze napełniać świeżą wodą z kranu.

W teście preferencji druga butelka może zapewnić alternatywne rozwiązanie, które jest przedmiotem zainteresowania, takie jak roztwór zawierający cukier. Zważ butelki, aby oszacować objętość spożytą między sesjami. Aby zmierzyć opóźnienie i częstotliwość napadów picia, dziobki butelek muszą być przymocowane do TER.

Czujnik podczerwieni wykrywa lizanie, więc upewnij się, że czujnik nie jest zablokowany przez dyszę wylewki. Jeśli tak, zmień długość wylewki tak, aby zmieściła się w klatce. Schronienie należy umieścić w rogu oddalonym od koła jezdnego.

Do śledzenia wideo konieczne jest, aby pomieszczenie było oświetlone słabym, rozproszonym światłem, które nie odbija się od podłogi lub ścian w zainwestowaniu. Po prawidłowym ustawieniu oświetlenia arena testowa może zostać zdigitalizowana dla oprogramowania testowego. Do tej demonstracji używany jest pakiet oprogramowania ETH Ovision XT 8.5 do konfiguracji areny.

Zacznij od otwarcia domyślnego projektu śledzenia i wprowadzenia ustawień eksperymentalnych. Następnie wybierz źródło wideo, w tym przypadku pilny chwytak piccolo. Ustaw liczbę aren śledzenia na cztery.

Wybierz środkowy nos i ogon dla punktów śledzenia, a następnie wybierz jednostki miary Dalej z listy próby. W menu ustawień zdefiniuj liczbę prób, klikając przycisk Dodaj próby. Następnie przełącz opcję dodaj zmienną, aby określić zmienne niezależne, takie jak identyfikator myszy, grupa płci, przypisanie i szczep.

Teraz przechwyć obraz tła areny, klikając zakładkę ustawień areny i definiując obwód areny za pomocą dostępnych narzędzi do rysowania po zdefiniowaniu areny, użyj opcji dodaj strefę, aby obrysować strefy zainteresowania, takie jak podłoga, TER, dozownik jedzenia i tak dalej. Następnie dodaj strefy, w których mysz nie jest widoczna, korzystając z opcji dodaj grupę ukrytych stref. Obejmuje to schronienie i koło jezdne.

Każda ukryta strefa powinna mieć również określony punkt wyjścia z wejścia. Po zdefiniowaniu obwodu i stref każdej areny należy wykonać testy kalibracyjne, korzystając z opcji kalibracji w oprogramowaniu. Użyj narzędzia dostępu do skali, aby określić szerokość i długość każdej areny.

Następnie zweryfikuj ustawienia każdej areny za pomocą przycisku walidacji i przystąp do ustawiania parametrów próbnych i zbierania danych. Aby pozyskać dane, należy najpierw ustawić parametry akwizycji w programie. Zacznij od uzyskania dostępu do zakładki ustawień kontroli próbnej i określenia ram czasowych dla zestawu próbnego.

Warunek początkowy, który ma się rozpocząć, gdy czas trwania punktu środkowego przekroczy jedną sekundę na arenie, czas trwania próby ustawia się, rozwijając pole warunku zatrzymania i ustawiając próbę tak, aby kończyła się po ustalonym opóźnieniu, takim jak 10 godzin, teraz wybierz opcję z metody wykrywania z zakładki ustawień wykrywania. Następnie chwyć obraz referencyjny pustej areny, używając przycisku ustawień i wybierając opcję Chwyć prąd, będąc nadal w module wykrywania, dostosuj zakres kontrastu dla środkowych punktów wykrywania nosa i ogona. Ustaw zakres jako ciągły.

Następnie wskaż, że mysz jest jaśniejsza lub ciemniejsza niż tło. Teraz dostosuj ustawienie rozmiaru obiektu, które jest oparte na polu widzenia aparatu. Następnie, jeśli to konieczne, dostosuj liczbę klatek na sekundę analizy w oparciu o to, do czego zdolny jest komputer.

Przetwarzanie 14,9 klatek. Drugi jest zwykle wystarczający. Po wprowadzeniu wszystkich zmian w opcjach modułu wykrywania należy je zapisać przed przystąpieniem do pomiaru opóźnienia, częstotliwości i czasu trwania działań behawioralnych.

Niestandardowa procedura w MED PC 4 służy do wprowadzania krok po kroku parametrów sesji, takich jak identyfikator myszy, czas trwania próby, biegowe uderzenia kół i tak dalej. Gdy wszystkie te parametry zostaną wprowadzone, a cały sprzęt testowy zostanie włączony, kontynuuj, umieszczając mysz na arenie. Następnie zsynchronizuj pakiety śledzenia wideo i zdarzeń, jednocześnie naciskając przyciski nagrywania i cicho opuść pomieszczenie później, gdy upłynie okres nagrywania, zwróć myszy do ich domowych klatek, zmierz wagę butelek i zapisz wszystkie nagrane dane na nośnikach cyfrowych.

Nieprzetworzone dane można wprowadzić do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy, a surowe pliki wideo można ocenić pod kątem rzadkich zachowań, takich jak stereotypy lub napady padaczkowe. Przedłużone badanie z udziałem myszy CD One przy użyciu najlepszego narzędzia przeprowadzono kilka dni przed operacją. Zebrano dane wyjściowe, a następnie dane pooperacyjne, które obejmują trwałe domózgowo-komorowe podawanie przeciwciał reaktywnych w mózgu.

Począwszy od piątego dnia, grupy eksperymentalne wykazywały różne upośledzenia, w tym zmniejszone lizanie butelek z wodą. Wykazali również zwiększone opóźnienie w zbliżaniu się do butelek z roztworem sukralozy i wykazali zmniejszone spożycie żywności. Zbiegając się z tymi zmianami, myszy, którym podawano przeciwciała reagujące na mózg, wykazywały również zmniejszoną aktywność kół biegowych w porównaniu z myszami kontrolnymi, które poruszały się, mierzone przez oprogramowanie do śledzenia wideo, które również były zmniejszone.

W grupie eksperymentalnej leczone myszy wolały spędzać czas w schroniskach. Korzystając z tych danych, skonstruowano prosty rogram, aby zilustrować te różnice w zachowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować niestandardowe urządzenie monitorujące do bezstronnej analizy behawioralnej.

W warunkach zbliżonych do domowych, zautomatyzowane fenotypowanie klatki domowej zapewnia bogactwo informacji pozwalających na dokładniejszą ocenę kinetyki wystąpienia i nasilenia deficytów behawioralnych wywołanych chorobą związanych ze spontanicznym zachowaniem motywowanym lokomocją i reaktywnością emocjonalną poprzez minimalizację problemów związanych z niespójnymi ustawieniami środowiskowymi, transportem, stresem i powtarzającymi się urządzeniami do obsługi, takimi jak inves, mogą znacznie zwiększyć spójność i precyzję wyników behawioralnych w odrębnych badaniach.